固相微萃取_衍生化技术及其在环境和生物分析中的应用_栾天罡

固相微萃取-衍生化技术及其在环境和生物分析中的应用
栾天罡＊1　张展霞2
(中山大学生命科学学院,生物防治国家重点实验室1,化学与化学工程学院2,广州510275)
摘　要　固相微萃取(SPME )是近年发展起来的一种无溶剂、简单快速的样品预处理方法。

SPME 同衍生化技
术结合是拓展SPME 方法的一个重要方向。

对固相微萃取与衍生化方法结合在环境及生物样品中极性分析
和金属有机化合物上的应用及进展进行了评述,又对SPME 衍生化反应的方式和条件进行了讨论。

关键词　固相微萃取,衍生化,极性有机物,金属有机化合物,环境生物分析,评述
　2002-03-24收稿;2002-10-17接受
本文系中山大学青年教师科研启动基金资助项目
1　引 言
固相微萃取(solid phase micr oextraction ,SP ME )是1990年初由加拿大Waterloo 大学J .Pawliszyn 等在固相萃取(SPE )基础上发展起来的样品预处理技术[1～4]。

SPME 通过装在注射器内石英纤维萃取头表面的高分子涂层,对样品中的有机物进行选择性萃取和预富集,然后将富集了分析物的涂层立即插入气相色谱(GC )进样口热解吸进样。

SPME 的优点是完全消除了有机溶剂,使萃取、预富集、进样一次完成,减少了分析时间,且可以自动进样
[5,6]。

SPME 的原理是待分析物在涂层和样品之间的分配平衡,主要是物理吸附,遵循相似相溶原理。

萃取平衡时,涂层中的分析物吸附量与样品中分析物浓度线性相关,可以进行定量分析[2]。

SPME 适用于多种样品,尤其适合于水相基体中超微量有机物的萃取分离。

SPME 包括直接萃取和顶空萃取两种萃取方式,直接萃取是将纤维涂层直接插入样品中萃取分析物,主要用于气体和较干净的水样品;顶空萃取则是将涂层置于样品上的顶部空间,萃取对挥发性和半挥发性有机物,适用于较“脏”的样品和固体样品[4],并可使色谱柱不被大分子物质、非挥发性物质污染。

同普通气相顶空方法相比,
SPME 顶空具有富集作用,使气相色谱分析有更高的灵敏度和更宽的线性范围[7]。

影响SP ME 的因素除了高分子涂层的种类和厚度,还包括萃取温度、基体的处理(加入无机盐和改
变pH 值)及搅拌效率等[2,4,11]。

如果萃取平衡时间较长,SPME 过程不必达到完全平衡,但对萃取的时
间、温度,纤维涂层的位置要准确地控制
[12]。

解吸过程中,解吸温度、解吸时间和纤维在进样口的深度,也需要严格的控制。

SPME 和GC 联用,与高灵敏度的检测器如质谱(MS )、电子捕获检测器(ECD )、原子发射光谱检测器(AED )结合,可使分析的检出限达到μg L ～ng L 量级。

此外,SPME 与高效液相色谱(HPLC )和毛细管电泳(CE )结合也有一些进展[8,9],与GC 不同的是,在HPLC 和CE 中需要特殊的接口,而且解吸是靠流动
相对目标萃取物的再分配来完成的。

从已报道的文献来看,SP ME 已应用于气体[11]、水[13～15]、土壤[4,16]和生物样品[17,18]中有机物的萃取,
主要是挥发和半挥发性有机物,如苯及其同系物(BTE X )、多环芳烃(PAHs )等。

对难挥发性、强极性或热
不稳定有机物的应用少,萃取率低[4,12]。

这主要有两个方面的原因,一是待分析物的极性强,即使用极
性的SP ME 涂层(如聚丙烯酸酯polyacrylate ),其萃取率也较低:二是SPME 萃取后色谱分析中,极性和难挥发性分析物的色谱行为差,热不稳定的化合物会分解,得不到有效的色谱峰,导致分析方法的灵敏度和精密度都比较低。

极性有机物分子中多含有酸性或碱性官能团(如OH 、COOH 、NH 2等),其偶极距大,挥发性低,色谱行为差,GC 不能或难于直接分析。

为了达到气相色谱分析的目的,通常采用衍生化反应,用非极性取代基封闭极性官能团,提高分析物的挥发性,改善色谱的分离效果,提高检测灵敏度并缩短第31卷
2003年4月 分析化学(FENXI HUAXUE )　评述与进展Chinese Journal of Analytical Chemistry 第4期496～500
分析时间。

气相色谱衍生化技术已广泛地用于环境、生化、医药和临床分析[19,20]。

GC 衍生化反应主要有3种类型:(1)硅烷化反应法;(2)酰化反应(包括醋酐法,卤代酰基法);(3)酰化反应法(包括重氮烷烃法、卤化硼催化法、氢氧化铵盐分解法、无机酸催化法等),此外,还有生成如醚类、腙类以及环状衍生物的衍生化方法。

大多数衍生化反应,都需要有机溶剂介质,要求无水条件。

在衍生化反应的前后,要去除样品中的干扰化合物和其他组分。

如果要分析生物样品这类复杂试样中的一种或一小类化合物,就需要进行多级萃取、薄层色谱分离等几个预分离步骤,或者采用特殊反应离析样品或干扰物。

这些操作中的每一步,都可能使分析结果产生误差,即使较简单的衍生化样品处理,通常也需要萃取、样品干燥、浓缩等步骤。

强极性有机物亲水性强,衍生化前的常规萃取效果不好,回收率和精密度都比较低。

因此,在样品预处理过程中,发展简单、快速、可满足自动化要求的新衍生化方法和技术,是非常必要的。

2　S PME 衍生化及其在有机分析的应用研究
衍生化与SP ME 的结合,为SPME 用于极性、难挥发性有机物的分析提供了可能性[21,22]。

通过合适的衍生化反应,封闭待分析物的极性基团,将极性分析物转换成弱极性分析物,提高其挥发性,即提高了SPME 的萃取率,,同时也提高色谱分辨率和检测灵敏度及选择性。

Buchholz 将SP ME 衍生化用于酚的分析[23],在样品中加入乙酸酐,酚转化为乙酸酯,同SPME 直接萃取酚相比,萃取率提高了25倍,同时改
善了色谱的分辨率。

与液液萃取-衍生化的方法[11]相比,SPME 衍生化方法省略了萃取、样品干燥、浓缩
等步骤,克服了衍生化过程步骤多,分析物容易损失的局限性,方法简单快速。

因此,SPME 衍生化技术的研究,成为SPME 发展的方向之一。

但SPME 衍生化方式和反应类型的研究才起步不久[24],最近我们对SPME 涂层中衍生化方式进行了较详细的研究,主要研究了涂层中硅烷化反应的反应机理及其对SPME 涂层的影响[25,27]。

2.1　SPME 衍生化方式
根据SP ME 的特点和衍生化反应发生的位置,SPME 衍生化方法可分为3种方式[24]:(1)在样品中衍
生化;(2)在纤维涂层中衍生化;(3)在GC 进样口衍生化。

2.1.1　在样品中衍生化　在样品中衍生,不需要将待分析物预先萃取分离,而是直接将衍生化试剂加
入样品基体中,反应完成后,再用SP ME 萃取。

除了酚的分析[23],Pan 等采用三氟乙酸酯和五氟苯乙醛
分别将气相和水相样品中极性有机胺衍生化为酰胺和亚胺
[28];同直接萃取相比,其检出限降低了两个数量级。

与气相衍生化不同,衍生化反应在水相中受到pH 值和胺的p K a 的影响,亚胺衍生物在水相中易发生分解。

Pan 等[24]采用五氟苯基重氮乙烷(PDPFE )、五氟苄基溴(PFB -Br )SPME 衍生化方法GC -ECD
分析了水相中的短链脂肪酸,衍生化反应可以在水相中进行,其衍生物对ECD 的响应值高,但反应时间长达3h 。

由于SPME 的主要优点之一是直接萃取水相体系中的有机物,而决大多数衍生化反应都要求无水条件,需要有机介质,在水相中反应受到基体的影响不易进行,且衍生试剂或衍生化产物会分解。

这使基体中衍生化方法受到一定的限制。

2.1.2　S PME 涂层中衍生化　为了避免样品基体对衍生化的影响,衍生化反应可以在SPME 涂层中进行[22]。

SP ME 不仅仅作为富集器、分离器,而且还可以作为反应器。

涂层可以被认为是液相或半固相的有机介质,将待分析物和衍生化试剂萃取到SPME 涂层中进行衍生化反应。

涂层中衍生化包括两种方式:(1)萃取衍生化试剂,然后在基体中萃取极性化合物,同时在纤维涂层中衍生(in -situ derivatization );
(2)先萃取分析物,然后萃取衍生化试剂衍生(postderivatization )。

在涂层中进行衍生化。

In -situ 方式避免水相的影响,较适用于挥发性的极性有机物。

Pan 等[29]
采用In -situ 方式,SP ME 先萃取环己烷溶液中芘基重氮乙烷(PDAM ),然后顶空萃取强极性的丙酸和丁酸,同时在涂层中反应,酸衍生化为芘基酯。

芘基酯比较稳定且与涂层的结合力很强,GC -FID 分析,灵敏度得到很大的提高。

反应在室温进行,提高反应温度可以提高反应转化率,但在高温和湿度大的条件下,芘基重氮甲烷(PDAM )会
发生分解。

该方法的缺点是反应时间较长(3h )。

Mills 等[30]采用In -situ 方式,SPME 重氮甲烷衍生化,顶空萃取,分析了排泄物中的短链脂肪酸,并将该方法用于临床研究。

497第4期栾天罡等:固相微萃取-衍生化技术及其在环境和生物分析中的应用
Post 方式适合于非挥发性极性有机物,Pan 等[24]采用Post 方式,SPME 先直接萃取水中长链脂肪酸,
然后将SPME 涂层置于重氮甲烷试剂的顶空,在涂层中进行衍生化。

反应在室温进行,速度较快(20
min ),得到高挥发性的脂肪酸酯,提高了色谱的分辨率和灵敏度。

Lee 等[31]自制的重氮甲烷衍生化装
置,采用Post 方式,分析了水中的酸性除草剂,检出限达到10～30ng L 。

Okeyo [32]等采用Post 方式,加热N ,O -双(三甲基硅)三氟乙酰胺(B STFA ),SPME 顶空气相萃取,对血清中类固醇进行了定性分析。

Sng
等[33]采用在水相中比较稳定的N -甲基-N -异丁基二甲基三氟乙酰胺(MTB STFA ),分别选用两种涂层中衍生化方式,对神经性化学武器试剂在水中降解产物(羟基硫醚、烷基磷酸等)进行了半定量分析。

研究中发现SPME 先萃取MTBSTFA ,然后萃取水相中分析物,最后再萃取MTBSTFA 的方式,具有较高的萃取率,但方法的灵敏度和重现性较差。

我们以B STFA 为衍生化试剂,研究了在涂层中硅烷化衍生对葡萄酒中白黎芦醇进行了定量分析[25]。

结果发现,采用Post 方式,BSTFA 顶空气相萃取硅烷化试剂的方法,可以使反应不受水相的影响。

我们同时研究了衍生化和萃取条件对萃取率及SPME 涂层的影响,方法简单准确,检出限达到5ng L 。

同时,我们也对葡萄酒中其它极性有机物进行了定性分析[26]。

2.1.3　GC 进样品衍生化　由于四甲基铵盐热分解甲酯化法可以在GC 进样口进行,Pan [24]又研究了在
GC 进样口中衍生化的方式,SPME 同时萃取溶解在水中的长链脂肪酸(C 14-C 22)和四甲基氢氧化铵(TMA -OH )或四甲基硫酸氢铵(TMA -HSO 4),然后插入在300℃的GC 进样口衍生化。

结果表明:TMA -HSO 4有较高的酯化率,但该方法不适用于C 12以下的脂肪酸,原因是极性强,SPME 的萃取率低。

我们在研究中探索了甲基硅烷化GC 进样口衍生化方法
[27],SPME 萃取白黎芦醇,GC 进样口解吸后,注入甲基硅烷化试剂衍生化。

GC -MS 分析得到了白黎芦醇的三甲基硅衍生物。

目前SPME 衍生化方法已用于有机酸、胺、酚和醇等多种极性化合物的分析。

2.2　SPME 衍生化的反应类型
目前已报道SPME 衍生化文章不多,主要集中在酰化、甲酯化,而硅烷化的研究较少。

酰化反应主要用于封闭羟基、氨基和硫醇基,增加待分析物的挥发性,是最早用于SPME 的衍生化反应,主要有醋酐
法[23]、卤代酰基法[28]。

反应多在样品中进行,通常需要加热(60～80℃)。

在水相反应时,衍生化试剂要过量,否则衍生物会水解。

Lee [34]采用涂层中衍生化(Post 方式),以七氟丁酸酐为衍生化试剂,在自制的衍生化装置加热270℃反应10s ,测定了血清中神经性药物安非他明(amphetamine )和甲基苯丙胺(metha mphetamine ),灵敏度分别比不衍生提高了17倍和4倍,但重现性较差(RSD 为17%)。

甲酯化反应主要用于封闭羧基,因此较多用于脂肪酸的分析。

衍生化方法包括重氮烷烃法[24,30,31]、
氢氧化铵盐分解法[24]。

重氮甲酯化反应活性高,常温下即可进行,无副产物,对SP ME 涂层没有损害,适
合在涂层中衍生化。

但重氮化试剂的反应活性较高,不易贮藏,反应过程中易发生爆炸,而且重氮甲烷是致癌物质,对人体有害。

芘基重氮甲烷虽然在常温下比较稳定,但需要有机溶剂,其衍生化反应需要
较长的反应时间(大于2h )。

此外,Clark 等[35]对无机酸催化法进行了研究,在样品中采用盐酸催化甲醇
酯化反应后,顶空萃取GC -MS 分析了烟草中有机酸。

硅烷化衍生化方法,主要用于封闭含活性氢的基团,适合大多数极性有机物,应用非常广泛。

其缺点是衍生物对湿气很灵敏,有时稳定性差。

因此这方面的文章较少,涂层中衍生化是主要的研究方向。

Okeyo [32]和Sng [33]等人对SPME 硅烷化方法进行了初步研究,但仅限于定性分析,而且方法的重现性较
差。

我们在采用Post 方式,对葡萄酒中的白黎芦醇进行了定量分析[25],检出限达到ng L 量级,RSD <
10%。

我们采用同样的方法得到酚类、有机酸、醇及多羟基有机物甲基硅烷化衍生物[26]。

在此基础上,
我们采用3种硅烷化试剂[27],研究了3种涂层中衍生化方式,SPME 顶空萃取同时进行衍生化,分析了挥发性丙酸和丁酸,同重氮化方法相比,方法简单、快速,检出限达到ng L 。

我们对涂层中硅烷化反应动力学进行了研究,由于硅烷化试剂扩散系数大,涂层中的衍生化试剂相对过量,衍生化反应遵循假(Pseudo )一级反应动力学。

因此不需达到反应平衡,只要准确控制反应条件,即可进行定量分析。

此外,Martos 等[36]对在涂层中将甲醛衍生化为肟的方法进行了研究,分析检出限达到4.6μg L 。

Sxostek 等[37]采用二巯基化合物做衍生化试剂,SPME -样品中衍生化,GC -MS 分析了有机砷酸,方法的
498 分析化学
第31卷
RSD <10%。

2.3　衍生化反应对S PME 涂层的影响
提高衍生化温度,有利于提高反应的转化率,从而提高反应的灵敏度。

但由于SPME 涂层是有机相,衍生化反应中尤其是在涂层中进行反应,衍生化试剂对萃取涂层造成影响。

我们在研究中发现[25,27]
,硅烷化反应温度在60℃时,高聚物涂层会发生降解;酰化试剂即使采用顶空萃取,室温下也可将SPME 涂层溶解或脱离纤维,导致分析结果的重现性差。

因此,衍生化反应不宜加热,但对于反应活性较低的分析物,其灵敏度较低。

由此可见,涂层的化学稳定性,是限制SP ME 衍生化发展和应用的重要因素。

3　S PME -GC 衍生化方法用于有机金属化合物的形态分析
SPME -GC 衍生化方法还用于分析完全非挥发的有机金属化合物。

由于自然界中污染物通过食物链在生物体内积累,其潜在的生理毒性和对非目标生物的影响,越来越引起人们的重视。

有机金属化合物的形态分析是目前的研究热点[38]。

目前采用SP ME 衍生化方法用于有机金属化合物分析的衍生化试剂有两类:烷基化试剂(四乙基硼化钠,sodium tetraethylbroate )和氢化试剂(NaB H 4、KB H 4)。

反应是在样品基体中进行。

G r ecki 等采用四乙基硼化钠作为衍生化试剂与无机铅在水相中直接反应生成四乙基铅,SPME 顶空萃取GC -MS 测定了水中无机铅离子[29]。

四乙基硼化钠由于可以在水相中直接衍生,在SPME 衍生化方法中得到较多的
应用。

Moens 等用GC -ICP -MS 联用同时测定有机汞、有机锡、有机铅化合物[40]。

Morcillo 等GC -FPD 分析
甲基锡化合物[41],Cai 等用GC -MS 分析了甲基汞和无机汞[42]。

氢化试剂比烷基化试剂价格便宜,但反
应生成的氢化物不够稳定,需严格的控制条件。

江桂斌[43～46]等采用NaB H 4和KBH 4衍生,顶空萃取,原子吸收和火焰广度分析了不同样品中的甲基汞、乙基汞、苯基汞和丁基锡化合物,检出限达到ng g 量级。

另外,Otu [47]等将SP ME 用于萃取分离水中无机离子。

将PDMS 涂层表面微孔化,进行离子交换,用
于萃取硝酸溶液中Bi ,然后在酸性碘化钾溶液中解吸,形成黄色的Bil -4络合离子,分光光度法分析。

4　展　望
SPME 衍生化是近几年才发展起来的技术,有关的研究文献较少。

衍生化方式和反应类型及反应机理还有待于深入研究。

其研究可在以下几个方面展开:(1)新的衍生化试剂的研究,尤其是水相中稳定的衍生化试剂;(2)新的衍生化装置的研制,如柱前衍生化装置;(3)新的SPME 涂层的开发和研究,如具有较高稳定性和选择性涂层材料。

由于SPME 衍生化方法具有步骤少、简单、快速、灵敏、不使用溶剂等诸多优点,随着其技术的进一步完善,应用范围也会进一步扩大,在环境及生物样品预处理领域中将有很好发展前景。

References
1　Arhur C L ,Pawliszyn J .Anal .Chem .,1990,62:2145～2148
2　Louch D ,Motlagh S ,Pawliszyn J .A nal .Chem .,1992,64:1187～1199
3　Zhang Z ,Yan g M J ,Pawlisz yn J .Anal .Chem .,1994,66:844A ～853A
4　Zhang Z ,Pawliszyn J .A nal .Chem .,1993,65:1843～1852
5　Arhur C L ,Killam L M ,Buchholz K D ,Pawliszyn J ,Berg J R .Anal .Chem .,1992,64:1960～1966
6　Eisert R ,Pawliszyn J .A nal .Chem .,1997,69:3140～3147
7　Zhang Z ,Pawliszyn J .J .High Res .Chro matogr .,1996,19:155～160
8　Chen J ,Pawlisz yn J .Anal .Chem .,1995,67:2530～2533
9　Guo F ,Gorecki T ,Trish D ,Pawlisyzn J .A nal .Co mmu nications ,1996,33:361～364
10　Arhur C L ,Potter W D ,Buchholz D K ,Motlagh S ,Pawliszyn J .LC -GC ,1992,10(3):656～661
11　Chai M ,Pawliszyn J .Envir on .Sci .Technol .,1995,29:693～701
499第4期栾天罡等:固相微萃取-衍生化技术及其在环境和生物分析中的应用
12　Buchholz K D ,Pawliszyn J .Environ .Sci .Techn ol .,1993,27:2844～2848
13　Eisert R ,Levsen K .J .Chr omatogr .A ,1996,733:143～157
14　Yang Y ,Miller D J ,Hawthorne S B .J .Chro mato gr .A ,1998,:800:257～266
15　Zhao Mingqiao (赵明桥),Li Gon gke (李攻科),Luan Tiangang (栾天罡),Zhang Zhanxia (张展霞).Chines e J .Anal .Chem .
(分析化学),2000,28(11):1326～1330
16　Boyd -Boland A A ,M agdic S ,Pawlisz yn J .Analys t ,1996,121:929～937
17　Chiarotti M ,M arsili R .J .M icrocol .,1994,6:577～580
18　Luan T G ,Li G ,Zhao M Q ,Zhang Z X .Anal .Chem .A cta ,2000,404:329～334
19　Drozd J .Chemical Derivatization in G as Chromatogra phy .Amsterdam :Elsevier Press ,1981
20　Zhu Shiyong (朱世永),Chen Shijing (陈世京).Chemical D erivatives in G as Chro matography (衍生物气相色谱法).Beijing (北
京):Chemical Industry Press (化学工业出版社),1993
21　Boyd -Boland A A ,Chai M ,Zhang Z ,Yang J M ,Pawliszyn J ,G recki T .Environ .Sci .Technol .,1994,28(13):569A ～574A 22　Pawliszyn J .Trends in A nal .Chem .,1995,14(3):113～122
23　Buchholz K D ,Pawliszyn J .A nal .Chem .,1994,66:160～167
24　Pan L ,Pawliszyn J .A nal .Chem .,1997,69:196～205
25　Luan T G ,Li G ,Zhang Z X .A nal .Chim .Acta ,2000,424:19～25
26　Luan Tiangang (栾天罡),Li Gongke (李攻科),Zhang Zhanxia (张展霞).Acta Scientiarum Naturalism Universities Sunyaseni .
(中山大学学报),2001,39(3):82～86
27　Luan Tian gang (栾天罡).Ph .D Thesis o f Zhongs han Univ .(中山大学博士毕业论文).2000
28　Pan L ,Chong M J ,Pawliszyn J .J .Chr omatogr .A ,1997,773:249～260
29　Pan L ,Adams M ,Pawliszyn J .Anal .Chem .,1995,67:4396～4430
30　Mills A G ,Walker V ,Mughal H .J .Chromatogr .A ,1999,730:113～122
31　Lee R M ,Lee R J ,Lin Y W ,Chen C M ,Hwang B H .Anal .Chem .,1998,70:1963～1968
32　Okeyo P ,Rentz M S ,Snow H N ,J .High Res olut .Chro mato gr .,1997,20:171～173
33　Sng T M ,Ng F W J .J .Chromatogr .A ,1999,832:173～182
34　Lee R M ,Song Y S ,Hwang B H ,Chou C C .J .Chr omatogr .A ,2000,896:265～273
35　Clark T ,Bunch J E .J .Chr omatogr .Sci .,1997,35:209～212
36　Martos P A ,Pawliszyn J .A nal .Chem .,1998,70:2311～2320
37　Szostek B ,Aldstadt J .J .Chromatogr .A ,1998,807:253～263
38　Liu Jiyan (刘稷燕),Jiang Guibin (江桂斌).Chinese J .Anal .Chem .(分析化学),1999,27(10):1226～1330
39　Gorecki T ,Pawliszyn J .A nal .Chem .,1996,68:3008～3014
40　Moens L ,Smaele T D ,Dams R ,Van Den Broeck P ,Sandra P .Anal .Chem .,1997,69:1604～1611
41　Morcillo Y ,Cai Y ,Bayona J M .J .High Resolut .Ch romatogr .,1995,18:767～770
42　Cai Y ,Bayona J M .Chro matog r .A ,1995,696:113～122
43　Jiang G B ,Ceulemans M ,Adams C F .J .Chromatgr .,1996,727:119～129
44　Jiang G B ,Xu F Z .Ap pl .Organo met .Chem .,1996,10:77～82
45　He B ,Jiang G B .Anal .At .Spectrom .,1998,13:1141～1144
46　Liu Jiyan (刘稷燕),Jiang Guibin (江桂斌).Chinese J .Anal .Chem .(分析化学),2001,29(2):158～160
47　Otu E O ,Pawliszyn J .Mikrochim .A cta ,1993,112:41～48
Derivatization -Solid Phase Microextraction Techniques and Its Application
to Analysis of Organic Compounds
Luan Tiangang ＊1,Zhan g Zhanxia 2
(School of Life Science ,State Key Labo ratory for Bioco ntr ol 1,School of Chemis try and Chemical Engineering 2,
Sun Yet -sen (Zhongshan )University ,G uangzhou 510275)
A bstract The recent development of solid phase microextraction (SPME )coupled with derivatization techniques and its application to polar analytes and organometallic compounds were reviewed with 47r eferences .The derivatization types and operating c onditions are discussed in detail .
Keywords Solid phase microextraction ,derivatization ,polar analytes ,or ganometallic compounds ,environmental biological analysis ,review
(Recei ved 24March 2002;accepted 17October 2002)500 分析化学第31卷。