全血标本冷藏保存一周对血清HBV DNA复测结果的影响

全血标本冷藏保存一周对血清HBV DNA复测结果的影响王晓乐;章晓鹰;张珏;李黎
【摘要】目的探讨全血标本冷藏保存1周对血清乙肝病毒DNA(HBV DNA)复检结果的影响.方法采集乙肝患者外周全血150例,及时2～8℃保存,分别于采血后第1天和第7天用实时荧光定量PCR法(FQ-PCR)检测血清HBV DNA水平.结果150例全血标本第1天、第7天时血清HBV DNA载量分别为:5.50±1.46、
5.64±1.53,结果呈小幅升高趋势,但两组差异无统计学意义(P＞0.05);以第1天结果为基准,第7天时结果偏倚绝对值为(4.26±0.03)％,其中15例偏倚大于±7.5％.结论以分析中质量控制为前提,全血标本冷藏保存l周对血清HBV DNA复测结果的影响符合ISO 15189室内质控要求,能满足临床追加检测或复查申请;操作误差和FQ-PCR方法学的不足仍是造成复测较大偏差的最主要原因.
【期刊名称】《标记免疫分析与临床》
【年(卷),期】2015(022)002
【总页数】3页(P152-154)
【关键词】乙肝病毒DNA;实时荧光定量聚合酶链反应;质量控制
【作者】王晓乐;章晓鹰;张珏;李黎
【作者单位】上海中医药大学附属曙光医院检验科,上海201203;上海中医药大学附属曙光医院检验科,上海201203;上海中医药大学附属曙光医院检验科,上海201203;上海中医药大学附属曙光医院检验科,上海201203
【正文语种】中文
实时荧光定量聚合酶链反应(fluorescent quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR)是目前国内大多数医疗机构采用的血清HBV DNA检测方法。

该方法以高效扩增技术为基础，融合了探针技术的高特异性和光谱技术的高敏感性，对实验室条件、操作技术、标本状态等均有较高要求。

对于FQ-PCR法分析前的
标本保存，全国临床检验操作规程中有具体规定:检测靶核酸为DNA的标本，可
在2～8℃中保存3天，不能及时检测的血清标本应于-20℃保存。

日常工作中，
我们经常会收到临床医生血清HBV DNA复检或追加检查的申请，也会在质量督
查或试剂批号更换时进行留样复测比对。

本文探讨常规2～8℃保存大于3天的全
血标本是否能满足PCR质控要求，是否会造成较大偏倚，偏倚产生的原因可能有
哪些。

对象和方法
1 对象
2014年1月至9月，于我院肝炎科就诊的乙肝患者150例(乙型肝炎病毒DNA
定量检测结果均大于1×103IU/mL)，其中，男性105例，平均年龄38±12岁;女性45例，平均年龄42±15岁。

2 方法
2.1 标本采集与处理用含促凝剂的真空采血管，分15批次采集150例乙肝患者外周血3mL(每批次10例标本)，采血后全血标本立即放置2～8℃冰箱保存。

每批
次PCR实验前，全血标本均需充分离心(2000rpm，10min)。

2.2 检测仪器和试剂 Centrifuge 5424 R高速离心机(德国Eppendorf公司产);ABI 7500核酸扩增仪(美国ABI公司产);HBV DNA实时荧光定量检测试剂盒由上海科华生物工程股份有限公司提供;室内质控品(高、低两浓度水平)由上海市临检中心提供;含促凝剂的真空采血管，由浙江康是医疗器械有限公司提供。

2.3 检测方法应用FQ-PCR技术，按照试剂盒的操作说明进行。

分别于抽血后第1天和第7天，检测2～8℃保存的待测全血标本的血清HBV DNA水平。

3 统计学分析
采用 SPSS13.0统计软件进行分析，将血清HBV DNA定量检测结果换算成
log10IU/mL(HBV DNA载量)进行比较。

换算后资料符合正态分布，以表示，比较采用配对t检验。

结果
1 150例乙肝患者第1天和第7天血清HBV DNA定量检测结果分析
第1天和第7天血清HBV DNA载量分别为5.50±1.46和5.64 ±1.53，结果有小幅升高趋势;按 HBV DNA载量进行分组，结果见表1，各载量组第1天和第7天检测结果差异均无统计学意义(P＞0.05)。

表1 150例乙肝患者外周全血4℃冷藏第1天和第7天时血清HBV DNA载量比较()HBV DNA载量组别例数第1天HBV DNA载量第7天HBV DNA载量第7天HBV DNA载量偏倚(%)3.00 ～3.99 30 3.50 ±0.22 3.61 ±0.27 5.71
±0.044.00 ～4.99 30 4.46 ±0.21 4.52 ±0.22 3.98 ±0.035.00 ～5.99 30 5.45 ±0.27 5.56 ±0.33 3.79 ±0.036.00 ～6.99 30 6.58 ±0.22 6.73 ±0.38 3.72
±0.037.00 ～7.99 30 7.53 ±0.22 7.77 ±0.31 4.10 ±0.02
2 第7天血清HBV DNA载量偏倚值分析
ISO 15189分子诊断应用说明(2012)中要求，留样复测误差允许范围为±7.5%，且每批次5例样本中复测结果偏倚大于7.5%的应不超过1例。

本实验全血标本冷藏第7天时，15例标本血清HBV DNA载量偏倚值大于7.5%，见图1。

每批次PCR实验10例标本中复测结果偏倚大于7.5%的不超过2例。

图1 15例全血标本2～8℃冷藏第7天时血清HBV DNA载量偏倚大于7.5%
讨论
实时荧光定量PCR技术(FQ-PCR)是目前国内检测乙型肝炎病毒DNA的常用技术，也是实验要求严苛的手工操作技术，质量控制的高标准要求PCR实验人员不放过
每一处细节，不断完善实验能力，细化作业指导书，追求结果的准确可控。

分析前标本的质量控制是检验流程中的首要环节。

以往研究表明，血清HBV DNA 在体外非常稳定，血清标本4℃条件下保存7天，HBV DNA少量降解，但对检测结果的影响无统计学意义［1］。

本实验室根据自身实际情况，拟在作业指导书中规定:真空促凝采血管采集全血3mL，置冷藏保存，3天内完成血清HBV DNA检测，分析后全血标本仍然于冷藏保存，1周后丢弃。

冷藏大于3天的全血标本，如果复测血清HBV DNA水平，结果能否满足ISO 15189分子诊断项目室内质量控制要求是本研究关心的问题，目前未见相关报道。

本文结果显示，全血标本冷藏保存7天未造成血清HBV DNA明显降解，相反，
大于80%的标本第7天血清HBV DNA载量出现小幅升高现象，但是结果差异无统计学意义(P＞0.05);全血标本冷藏第7天时，15例标本血清HBV DNA载量偏
倚值大于7.5%，但每批次实验中，偏倚大于7.5%的标本不大于2例。

ISO 15189分子诊断应用说明(2012)中要求，留样复测误差允许范围为±7.5%，且每
批次5例抽样复测中，检测值偏倚大于7.5%的标本不多于1例。

依照此项规则，本实验室全血标本冷藏保存7天后血清HBV DNA复测结果完全符合质量控制要求。

值得注意的是，全血标本2～8℃冷藏保存到第7天血清HBV DNA载量小幅升高的现象与以往血清标本HBV DNA载量少量降解数据不同。

乙肝病毒只能在肝脏
细胞中复制，乙肝病毒释放到血液循环后，可以游离于血清中或被白细胞吞噬［2］，HBV DNA载量均值不降反升，很可能是全血中白细胞胞内HBV DNA微量释放所造成。

此外，最近研究发现，某些药物成分体外能有效抑制肝脏细胞或外周血单个核细胞HBV DNA复制［3-4］。

FQ-PCR法实验结果影响因素很多，除了实验运行体系中“人机料法环测”可能存在的误差，还可能存在其他误差源和需注意的操作细节，应进行持续有效地监控［5-6］。

本实验室于 2010年通过 ISO 15189质量管理体系认可，环境、仪器、试剂等均符合管理要求，且所有实验操作由一人完成，保证每批次操作环节相对稳定;每次扩增Baseline Start值设为3个循环，Baseline End值为15个循环，PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准差的10 倍［7］。

在充分保证分析中质量控制的前提下，全血标本冷藏保存1周对血清HBV DNA
复测结果的影响符合ISO 15189室内质控要求，能满足临床HBV DNA复检或追加检查的申请。

而对于质量督查或试剂批号更换比对时留样再测标本的选取，则应选择保存3天内标本，以尽量减少分析误差影响因素。

造成留样复测结果较大偏
差的原因，可能还是以操作误差和FQ-PCR方法学上不足这两方面原因为主。

本实验例数有限，造成全血标本HBV DNA载量复测值小幅升高的原因尚需更多
样本量、更完整的诊疗资料、更全面的角度进一步地探讨。

参考文献
【相关文献】
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［3］Ke C Z，Chen Y，Gong Z J，et al.Dynamic changes of HBV DNA in serum and peripheral blood mononuclear cells of chronic hepatitis patients after lamivudine treatment.World J Gastroenterol，2006，12(25):4061-4063.
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