非小细胞肺癌患者血清细胞因子的检测及其临床意义

非小细胞肺癌患者血清细胞因子的检测及其临床意义
祁松楠;蒋敏;忻寅强;王琳;赵瑞柯;黄宝丽;彭群新;史进方;顾国浩;马青
【摘要】Objective To investigate the role of changes of serum interleukin‐6(IL‐6) ,interleukin‐8(IL‐8) , monocyte chemotactic protein(MCP‐1) and granulocyte‐macrophage colony‐stimulating factor(GM‐CSF) levels in the patients with non‐small cell lung cancer(NSCLC) .Methods The levels of serum IL‐6 ,IL‐8 ,MCP‐1 and GM‐CSF in cases of 50 NSCLC and 50 healthy controls were measured by adopting the protein microarray .Results Compared with the healthy control group ,serum IL‐6 ,IL‐8 and GM‐CSF levels were increased evidently(P<0 .01) ,while serum MCP‐1 level was increased (P<0 .05) in the patients with NSCLC ,the differences were statistically significant(P<0 .05 ;compared with the patients with the stage Ⅰ + Ⅱ NSCLC ,serum IL‐6 level in the stage Ⅲ + Ⅳ was increased evidently(P<0 .01) ,while serum MCP‐1 levels was decreased
(P<0 .05) ,serum GM‐CSF level in the patients with the stage Ⅲ + Ⅳ NSCLC was decreased evidently ,the differences were statistically
signifiant(P<0 .01) ,there was no statistically significant difference in serum IL‐8 level(P>0 .05) .The serum IL‐6 level of the NSCLC patients with lymph node metastasis was significantly higher than that without lymph node metastasis (P<0 .05) ,and there were no statistically significant differences in serum IL‐8 ,MCP‐1 and GM‐CSF levels(P>0 .05) .The serum IL‐8 level of lung adenocarcinoma patients was significantly higher than that of lung squamous cancer patients(P< 0 .05) ,and there were no statistically
significant difference in serum IL‐6 ,MCP‐1 and GM‐CSF
levels(P>0 .05) .Conclusion The changes of serum IL‐6 ,IL‐8 ,MCP‐1 and
GM‐CSF levels may be closely related to the occurrence and progression of NSCLC ,their serological tests conduces to understand the immune function status of NSCLC patients and has the reference value in the staging and typing of NSCLC .%目的：探讨非小细胞肺癌（NSCLC）患者血清
细胞因子白细胞介素（IL）‐6、IL‐8、单核细胞趋化蛋白‐1（MCP‐1）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM‐CSF）的量值变化在NSCLC发生发展过程中的作用。

方法采用蛋白芯片法检测50例NSCLC患者及50例健康者血清IL‐6、IL‐8、MCP‐1、GM‐CSF的浓度。

结果与健康对照组比较，NSCLC患者血清IL‐6、IL‐8、GM‐CSF浓度明显升高（P＜0．01），MCP‐1浓度升高（P＜0．05），差异有
统计学意义；与Ⅰ＋Ⅱ期患者相比，Ⅲ＋Ⅳ期患者血清IL‐6浓度明显升高（P＜0．01），血清MCP‐1浓度降低（P＜0．05），血清GM‐CSF浓度明显降低（P ＜0．01），差异有统计学意义，血清IL‐8浓度差异无统计学意义（P＞0．05）；与无淋巴结转移的患者相比，有淋巴结转移的患者血清IL‐6浓度升高（P＜0．05），差异有统计学意义，血清IL‐8、MCP‐1、GM‐CSF浓度的差异无统计
学意义（P＞0．05）；与肺鳞癌患者相比，肺腺癌患者血清IL‐8浓度升高（P＜0．05），差异有统计学意义，血清IL‐6、MCP‐1、GM‐CSF浓度的差异无统计
学意义（P＞0．05）。

结论血清IL‐6、IL‐8、MCP‐1、GM‐CSF的改变与NSCLC的发生、发展密切相关，其血清学检测有助于了解 NSCLC患者的免疫功
能状态，对NSCLC分期、分型具参考价值。

【期刊名称】《检验医学与临床》
【年(卷),期】2015(000)016
【总页数】4页(P2339-2341,2343)
【关键词】非小细胞肺癌;白细胞介素6;白细胞介素8;单核细胞趋化蛋白1;粒细胞
巨噬细胞集落刺激因子;蛋白芯片法
【作者】祁松楠;蒋敏;忻寅强;王琳;赵瑞柯;黄宝丽;彭群新;史进方;顾国浩;马青
【作者单位】苏州大学附属第一医院检验科/江苏省临床免疫学研究所，江苏苏州215000;苏州大学附属第一医院检验科/江苏省临床免疫学研究所，江苏苏州215000;中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所纳米生物医学研究部，江苏苏州 215000;苏州大学附属第一医院检验科/江苏省临床免疫学研究所，江苏苏州215000;苏州大学附属第一医院检验科/江苏省临床免疫学研究所，江苏苏州215000;苏州大学附属第一医院检验科/江苏省临床免疫学研究所，江苏苏州215000;苏州大学附属第一医院检验科/江苏省临床免疫学研究所，江苏苏州215000;苏州大学附属第一医院检验科/江苏省临床免疫学研究所，江苏苏州215000;苏州大学附属第一医院检验科/江苏省临床免疫学研究所，江苏苏州215000;中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所纳米生物医学研究部，江苏苏州 215000
【正文语种】中文
肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康。

世界卫生组织2012年全球肿瘤统计数据显示，肺癌的发病率和病死率分别为13.0%和19.4%，居所有肿瘤之首，已成为全球性的健康威胁[1]。

非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌中
最常见的一类，其发生发展与机体的免疫功能状态密切相关。

机体存在复杂的调节免疫功能的细胞因子工作网络，各种细胞因子互相协调共同维持机体免疫功能稳态，而细胞因子与肿瘤的关系一直是肿瘤免疫学研究的热点之一。

多种细胞因子联合定
量检测是判断机体免疫功能的有效方法，具有重要的研究价值。

本研究采用高灵敏度、高通量的蛋白芯片法检测NSCLC患者和健康者血清中的细胞因子浓度，并结合NSCLC患者的临床资料探讨其在肺癌发生发展过程中的作用和意义，为NSCLC患者免疫功能评价和免疫治疗提供依据。

1.1 一般资料选取2014年4～9月苏州大学附属第一医院收治的初诊NSCLC患者50例，其中男26例，女24例，平均年龄(67.4±9.6)岁。

所有病例均经组织病理学检查确诊，其中鳞癌22例，腺癌28例。

根据国际抗癌联盟(UICC)TNM分期标准：Ⅰ期13例，Ⅱ期11例，Ⅲ期12例，Ⅳ期14例。

收集同期本院预防保健科健康体检者50例，其中男26例，女24例，平均年龄(65.5±6.3)岁。

NSCLC组和健康对照组一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。

患者与健康对照者均知情同意。

1.2 仪器与试剂 EZ-Plex Human Cytokine 4-plex细胞因子检测芯片(苏州偲聚生物材料有限公司)、GE Image Quant LAS 4000 mini 化学成像分析仪(美国General Electric Company)、TS-1脱色摇床(杰瑞尔电器有限公司)、QL-901X 型漩涡混合器(海门其林贝尔仪器制造有限公司)、LX-100手掌型离心机(海门其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.3 方法
1.3.1 标本采集采集肺癌患者及健康对照组清晨空腹静脉血3 mL，室温下静置1 h后以3 000 r/min离心10 min，将血清分装后置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 细胞因子检测血清细胞因子定量检测采用蛋白芯片夹心法。

首先制备标准品并根据需要进行稀释，同时使用样品稀释液以1∶10稀释血清样本。

取出蛋白芯片并于室温下平衡20 min，从加样孔往每个反应器内加入洗液200 μL润洗，静置3 min；使用移液枪将洗液吸尽后加入200 μL配置好的血清样品液或标准品，室温、150 r/min孵育2 h，洗涤芯片后加入检测抗体混合液200 μL，室温、150
r/min孵育1 h；洗涤芯片，加入HRP标记链霉亲和素溶液200 μL，室温、150
r/min孵育0.5 h；洗涤芯片后向芯片表面滴加等比混好的发光底物液30 μL，将
发光架移入化学发光成像仪中成像，所得图像使用GenePix pro6.0软件进行分析。

以标准品信号值为横坐标，标准品浓度为纵坐标绘制标准曲线，根据样品信号值在标准曲线上求出样品浓度(pg/mL)。

1.4 统计学处理采用SPSS17.0软件进行数据处理及统计学分析，计量资料不服从正态分布，以M(Q1,Q3)形式表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验。

以
P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 NSCLC和健康对照组血清各细胞因子浓度与健康对照组比较，NSCLC患者血清IL-6、IL-8、GM-CSF浓度明显升高(P<0.01)，MCP-1浓度升高(P<0.05)，差异有统计学意义。

见表1。

2.2 NSCLC不同病理状态下血清各细胞因子浓度的比较依据NSCLC患者不同临
床病理参数进行分析分组，比较分析发现，与Ⅰ+Ⅱ期患者相比，Ⅲ+Ⅳ期患者血
清IL-6浓度明显升高(P<0.01)，血清MCP-1浓度降低(P<0.05)，血清GM-CSF
浓度明显降低(P<0.01)，差异有统计学意义，血清IL-8浓度的差异无统计学意义(P>0.05)；与无淋巴结转移的患者相比，有淋巴结转移的患者血清IL-6浓度升高(P<0.05)，差异有统计学意义，血清IL-8、MCP-1、GM-CSF浓度的差异无统计学意义(P>0.05)；与肺鳞癌患者相比，肺腺癌患者血清IL-8浓度升高(P<0.05)，
差异有统计学意义，血清IL-6、MCP-1、GM-CSF浓度的差异无统计学意义(P>0.05)。

见表2。

细胞因子是由活化的免疫细胞(T细胞、B细胞、NK细胞、单核巨噬细胞、中性粒细胞)，成纤维细胞等产生的一类分泌型糖蛋白，其以多种多样的生物学活性，在
体内构成功能性细胞因子网络，彼此协作或相互制约，介导和调节机体免疫应答、炎性反应、造血功能，对维持机体正常的免疫功能状态起着非常重要的调控作用。

在异常情况下，细胞因子也会成为一系列病理过程的重要介质，参与炎性反应和肿瘤的发生[2]。

血清中细胞因子含量普遍较低，传统的ELISA方法难以达到良好的
检测效果。

本研究采用高灵敏度、高通量的蛋白芯片法(可同时检测数个或数十个
指标)，其基本技术手段是基于一种新型的固体支撑材料——改性聚二甲基硅氮烷(iPDMS)，iPDMS独特的表面化学能够有效地固定蛋白质并保持其生物活性，在
复杂环境下仍然能实现蛋白质的“绝对零”非特异性吸附，从而保证其满足体外诊断的要求[3]。

基于这些优点，本研究使用iPDMS作为载体，同时高效地检测肺癌患者血清中多种细胞因子浓度。

IL-6和IL-8都属于细胞因子网络中具有多种效应的炎性介质，其产生受多种因素
的调控，一方面可由机体免疫系统接受病毒、脂多糖、糖皮质激素等的刺激后产生，另一方面，当机体处于荷瘤状态时，肿瘤细胞也可通过自分泌和旁分泌的方式产生这类细胞因子[4-5]。

IL-6主要通过介导信号传导与转录激活因子3(STAT3)通路来调节肿瘤细胞的增殖与分化，抑制肿瘤细胞凋亡，刺激肿瘤新生血管生成[6]。

IL-
8也具有调节肿瘤血管生成的作用，通过促进肿瘤组织血管的生成来促进肿瘤的生长、侵袭和转移[7]。

本研究显示，NSCLC患者血清IL-6、IL-8浓度显著高于健康对照组，IL-6随着病理分期的增加以及淋巴结转移的出现而升高，提示IL-6在NSCLC侵袭、转移过程中发挥重要作用，这与陈春莉等[8]的研究结果基本一致。

多项研究表明，血清IL-6和IL-8浓度升高是NSCLC预后不良的指标，血清IL-6
和IL-8浓度的检测有助于了解患者的免疫功能状态、判断疾病进展和评估预后[9-10]。

本研究还发现肺腺癌血清IL-8浓度显著高于肺鳞癌，而此前未见有关血清
IL-8浓度在NSCLC不同组织类型中表达浓度不一的报道，王振元等[11]在应用逆转录PCR技术研究肺癌组织IL-8 mRNA表达时曾发现肺腺癌IL-8 mRNA表达高于其他组织学类型的肺癌，对于此现象的产生原因仍不清楚，可能与肺腺癌的一些生物学行为相关，如肺腺癌在早期即可侵犯血管和淋巴管，常在原发瘤引起症状前
即已转移。

MCP-1是一种具有重要生理作用的趋化因子，可由单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等接受一定刺激后诱导分泌，在体内发挥介导免疫细胞迁移，调节血细胞发育、胚胎器官发育、血管生成、细胞凋亡等作用。

GM-CSF是一种多功能造血因子，
可以选择性地刺激粒细胞、巨噬细胞增殖、分化和成熟。

体外研究表明，将表达MCP-1的纤维母细胞和癌细胞共同接种动物时，其能抑制肿瘤的生长和转移；而添加GM-CSF培养的单个核细胞用于治疗早期和复发性NSCLC的研究也已经进
入Ⅱ期临床实验阶段，表明MCP-1和GM-CSF具有抗肿瘤活性[12-13]。

本研究显示，NSCLC患者血清MCP-1、GM-CSF浓度高于健康对照组，这些炎性因子
的升高一方面反映了机体免疫系统发挥积极的抗肿瘤效应，另一方面细胞因子、趋化因子的持续存在和由其引发的级联反应能够诱导细胞增殖，趋化炎性细胞聚集，增加活性氧产物的产生，导致DNA氧化损伤，有DNA损伤或发生了基因突变的增殖细胞在富含炎性细胞和多种生物因子的微环境中继续失控性增殖，修复程序混乱，最终癌变，也反映了细胞因子作用网络的双向性和复杂性[14]。

肿瘤微环境中组成性表达的MCP-1、GM-CSF对肿瘤的发生、发展、转移等病理过程有着重要作用，MCP-1、GM-CSF均可通过招募多种炎性细胞、加速血管生成的作用来促
进肿瘤细胞的生长[15-16]。

本研究显示，MCP-1和GM-CSF浓度在肿瘤后期出
现下降，推测可能是由于肿瘤细胞产生的免疫抑制因子所导致。

细胞因子浓度的改变与NSCLC的发生、发展密切相关，通过细胞因子的血清学检测有助于及时了解患者的免疫功能状态，评估肿瘤病变的分期和预后转归等，其同时也提示对于NSCLC的治疗可以通过干预细胞因子通路来实现。

然而目前细胞因子血清学检测未得到足够的重视和普及，究其原因可能是由于细胞因子在血清中含量较低，缺乏高灵敏度、高通量的检测平台，而蛋白芯片检测技术的建立为血清细胞因子的检测提供了高灵敏度、高通量、低成本的检测平台，具有很高的临床应用
前景。

△ 通讯作者，E-mail：********************。

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