大肠杆菌基因组整合载体、基因工程菌以及在生产木糖醇中的应用[发明专利]

(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510196843.8
(22)申请日 2015.04.23
C12N 15/70(2006.01)
C12N 1/21(2006.01)
C12P 7/18(2006.01)(71)申请人浙江大学
地址310027 浙江省杭州市西湖区浙大路
38号
(72)发明人吴绵斌 苏卜利 林建平 杨立荣
(74)专利代理机构杭州天勤知识产权代理有限
公司 33224
代理人
胡红娟
(54)发明名称
大肠杆菌基因组整合载体、基因工程菌以及
在生产木糖醇中的应用
(57)摘要
本发明公开了一种大肠杆菌基因组整合载
体、基因工程菌以及在生产木糖醇中的应用，该大
肠杆菌基因组整合载体，包括复制子、表达原件、
目的基因、抗性基因和整合位点，所述的整合位点
为IS 序列；该基因工程菌包括大肠杆菌和整合进
大肠杆菌基因组的上述整合载体。

本发明以大肠
杆菌基因组中的拷贝数较多的IS 序列作为整合
位点，进行载体与基因组的整合，不仅整合方法简
单，而且整合到基因组上的目的基因遗传稳定，既
解决了质粒作为表达载体时，工程菌代谢负担重、
分离不稳定和蛋白表达不可控的问题，又简化了
现有的整合技术，解决了现有整合技术多拷贝整
合繁琐、耗时等问题。

(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书8页序列表11页 附图6页
(10)申请公布号CN 104789586 A (43)申请公布日2015.07.22
C N 104789586
A
1.一种大肠杆菌基因组的整合载体，包括复制子、表达原件、目的基因、抗性基因和整合位点，其特征在于，所述的整合位点为IS序列。

2.如权利要求1所述的整合载体，其特征在于，所述的IS序列为IS5序列。

3.如权利要求1所述的整合载体，其特征在于，所述的抗性基因为带有FRT位点的抗性基因。

4.如权利要求1所述的整合载体，其特征在于，所述的复制子为R6K。

5.如权利要求1所述的整合载体，其特征在于，碱基序列如SEQ ID No.2所示。

6.一种基因工程菌，包括大肠杆菌和转入大肠杆菌基因组的整合载体，其特征在于，所述的整合载体如权利要求1～5任一项所述。

7.如权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，大肠杆菌基因组中，所述整合载体存在若干拷贝。

8.如权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述目的基因为木糖还原酶基因，碱基序列如SEQ ID No.1所示。

9.如权利要求8所述的基因工程菌，其特征在于，目的基因上游的启动子为组成型启动子P43。

10.如权利要求7～9所述的基因工程菌在生产木糖醇中的应用。

大肠杆菌基因组整合载体、基因工程菌以及在生产木糖醇
中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程和生物技术领域，尤其涉及一种大肠杆菌基因组整合载体、基因工程菌以及在生产木糖醇中的应用。

背景技术
[0002] 木质纤维素生物质是地球上最丰富、最廉价的可再生资源，随着化石燃料等不可再生资源的日益枯竭，可再生资源的开发利用逐渐受到人们的重视，利用生物质资源生产生物基化学品和燃料是当前研究的热点。

木质纤维素包括纤维素、半纤维素和木质素，其中利用纤维素生产燃料乙醇研究已经很成熟并有工业化生产实例；木质素由于成分较为复杂，研究较为缓慢，并没有取得重大进展；约占木质纤维素原料5％～30％的半纤维研究正引起人们的广泛关注。

半纤维素的主要成分是木聚糖，其经过简单的酸解就能获得木糖，利用木糖生产木糖醇从碳元素利用而言，是原料利用率最高的途径之一。

木糖醇是来源于木糖的附加值最高、市场需求最大的化学品。

木糖醇是一种五碳糖醇，其甜度与蔗糖相当，热量值却只有其60％左右，木糖醇具有抗龋齿及代谢不依赖胰岛素、改善肝功能等特点，广泛应用于食品、医药和化工行业；2004年美国能源部从300多种候选化学品中筛选出12个最具应用前景的来源于生物质的基础化学品，木糖醇就是其中之一。

[0003] 工业上生产木糖醇主要是利用半纤维素酸水解获得木糖，经分离纯化后得到纯度在95％以上的木糖在高温高压条件下用镍催化加氢制得，这种工艺条件苛刻，且容易造成污染，生产成本较高；生物法生产木糖醇不需要高温高压条件、易燃易爆氢气、污染环境的镍催化剂和高纯度的木糖等，反应条件温和、安全节能且环境友好，所以生物法转化生产木糖醇越来越受到人们的重视。

目前用于发酵法制备木糖醇的微生物几乎都是酵母菌，既有自然菌种，也有基因工程菌。

酵母菌作为木糖醇生产菌株有着自己的优势，比如能耐受较高的糖浓度，对半纤维素水解液中的抑制因子抵抗性较强，等等。

但是也存在不可回避的问题，主要体现在：(1)目前主要产木糖醇的酵母是热带假丝酵母，其具有潜在的致病性，并不适合食品的生产；(2)酵母本身所含有的木糖还原酶专一性较差，对木糖和阿拉伯糖都有较高的催化效率，这样一来利用半纤维素水解液转化生产木糖醇的时候，必然会有大量副产物阿拉伯糖醇的产生，导致下游分离困难，增加生产成本；(3)在利用其它重组酵母如酿酒酵母生产木糖醇时，因为其没有专一性的木糖转运蛋白，木糖吸收利用较慢，所以生产效率较低。

这些原因造成了目前生物法生产木糖醇在成本上还难以实现规模化、产业化开发与应用。

大肠杆菌作为生产各种高附加值化学品的理想宿主，当前研究最为透彻，基因背景清楚，利用其构建基因工程菌有着得天独厚的条件，其有培养条件简单，生长速度快，基因操作相比酵母较为简单，蛋白表达水平高等诸多优点，而且在安全性问题上美国FDA也批准了以大肠杆菌K12为出发菌株的重组菌用于生物医药产品的生产。

以大肠杆菌作为宿主生产木糖醇已有报道，Zhao等人(Zhao，H.，Nair，N.U.，Racine，M.，Woodyer，R.，2011. Production ofxylitol from a mixture ofhemicellulosic sugars.PCT/US201I/021277)
利用大肠杆菌工程菌株进行流加发酵时，利用160g木糖可产生156g木糖醇，浓度达到136g/L，生产速率为1.92g/L/h；在利用脱毒后的半纤维素水解液进行发酵时，利用50.6g 木糖可生产46g木糖醇，生产速率为0.56g/L/h。

[0004] 目前采用大肠杆菌为宿主生产木糖醇的研究才刚刚开始，相关的报道不多，研究也不够深入，该文献报道的研究虽然已经是目前重组大肠杆菌生产木糖醇的最高水平，但是还没有充分发挥大肠杆菌发酵生产木糖醇的潜力，其底物浓度、产物浓度及生产效率还不能和酵母相媲美。

虽然当前针对不同宿主，利用各种代谢工程手段显著提高了木糖醇的得率和产率，但大肠杆菌作为宿主生产木糖醇还存在一些瓶颈。

由于大肠杆菌基因操作简便，商业化可供选择的表达载体众多，不同的启动子、不同拷贝数的复制子极大的方便了蛋白在大肠杆菌内的表达；所以对于大肠杆菌的代谢工程策略，当前普遍采用的是利用质粒作为表达载体。

但是质粒的存在往往会导致过重的代谢负担、分离的不稳定性以及蛋白表达的不可控性；同时为了维持菌株中质粒的稳定存在，通常需要添加抗生素，这不仅增加生产成本，还会带来抗药性的问题，威胁人类健康。

目前利用大肠杆菌生产木糖醇的研究中，基本都还是利用质粒作为表达载体，所以目的基因在宿主菌中遗传稳定性问题就显得特别突出。

[0005] 当前在大肠杆菌中进行基因组整合，主要有同源重组，定点整合和转座酶介导的重组。

同源重组最常用的是Red/ET重组，但此技术在在进行每次整合时需要寻找合适的重组位点，然后根据整合位点设计不同同源臂，比较耗时费力；并且随着目的基因长度的增加，其重组效率会大幅下降。

定点整合往往借助的是大肠杆菌内的噬菌体整合位点进行整合，实现多拷贝整合比较困难。

转座酶介导的重组需要利用转座酶对目的基因进行处理，然后进行随机的整合，实验操作较为繁琐，且不可进行多拷贝整合。

最近有研究者利用FRT位点作为整合位点，进行多拷贝整合，此方法较为简便，但是抗性基因却无法删掉，增加了细胞的代谢负担并可能带来生物安全性问题。

所以，开发一种安全简便的大肠杆菌基因组整合方法显得尤为重要。

发明内容
[0006] 本发明提供了一种大肠杆菌基因组整合载体、基因工程菌以及在生产木糖醇中的应用，该整合载体可以多拷贝整合到大肠杆菌基因组中，整合方法简单且遗传稳定。

[0007] 一种大肠杆菌基因组的整合载体，包括复制子、表达原件、目的基因、抗性基因和整合位点，所述的整合位点为IS序列。

[0008] IS序列作为最简单的转座元件，是很多细菌染色体的正常组成成分，特别是大肠杆菌，其含有多种常见的IS序列，且拷贝数较多。

以IS序列作为同源序列实现整合载体与大肠杆菌基因组的重组，通过常规的整合技术，就可以使整合载体多拷贝整合到大肠杆菌基因组中，方法简单易行，且整合到基因组上的目的基因遗传稳定。

[0009] 大肠杆菌中常见的IS序列有IS1、IS2、IS3、IS4、IS5等，不同大肠杆菌所含有的IS序列拷贝数不同，同源序列长度也不相同，而拷贝数越多，同源序列较长，目的基因整合的拷贝数也越多，概率也会越大，上述IS序列中，IS1的拷贝数为10左右同源序列347-504bp，IS2的拷贝数为8左右，同源序列407-411bp，IS3的拷贝数为2左右，1293-1329bp，IS4的拷贝数为6左右，同源序列646-867bp，IS5的拷贝数为12左右，同源
序列1000-1017bp。

因此作为优选，选择IS5序列作为整合位点可以增加目的基因的拷贝数。

[0010] 整合载体使用R6K复制子，其只有在表达γ蛋白的宿主菌中才能复制扩增，在普通菌株中只有整合至基因组中才能在有抗性的培养基上生长；因此作为优选，所述的复制子为R6K复制子。

[0011] 抗性基因两端含有FRT位点，通过FLP重组酶可将菌体携带的抗性基因删除，在减轻菌体代谢负担的同时消除抗生素抗性基因流失到自然带来的抗药性问题。

[0012] 整合载体中的其他结构，如启动子、终止子、多克隆位点和RBS位点，可以根据目的基因类型进行选择；抗性基因的类型也可根据研究目的来确定。

具体地，作为优选，所述整合载体的碱基序列如SEQ ID No.2所示。

[0013] 本发明还提供了一种基因工程菌，该基因工程菌包括宿主细胞大肠杆菌以及转入大肠杆菌基因组的上述整合载体。

所述的大肠杆菌优选为HK401。

作为优选，大肠杆菌基因组中，所述整合载体存在若干拷贝，以提高基因工程菌目的蛋白的表达量。

但是需要指出的是，以整合载体中的带FRT位点的抗性基因片段可以在整合至大肠杆菌基因组后进行敲除，可以减轻大肠杆菌的代谢负担，并消除其潜在的生物安全性问题。

[0014] 本发明又进一步提供了所述的基因工程菌在生产木糖醇中的应用。

该基因工程菌基因组中整合的目的基因为木糖还原酶基因(简称XR基因)，表达木糖还原酶。

本发明选用了碱基序列如SEQ ID No.1所示的木糖还原酶基因，该基因能在30℃的较高温度下获得高效表达，并且几乎没有包涵体产生。

[0015] 木糖还原酶基因的启动子可以采用Trc、pBAD和P43，针对上述碱基序列的木糖还原酶基因，实验表明，含启动子P43的表达载体转化大肠杆菌后得到的基因工程菌在木糖醇生产中的生产效率更高，并且不需要昂贵的诱导剂，所以，优选组成型的P43启动子。

[0016] 另外，实验表明，整合载体在大肠杆菌基因组中的拷贝数会影响木糖醇的生产效率，但是，拷贝数达到一定数值后，木糖醇的生产效率趋于稳定。

因此采用IS5序列作为整合位点时，整合载体的拷贝数量为1～6，其中，优选拷贝数为5。

[0017] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0018] (1)本发明以大肠杆菌基因组中的拷贝数较多的IS序列作为整合位点，进行载体构建与基因组的整合，不仅整合方法简单，而且整合到基因组上的目的基因遗传稳定，既解决了质粒作为表达载体时，工程菌代谢负担重、分离不稳定和蛋白表达不可控的问题，又简化了现有的整合技术，解决了现有整合技术多拷贝整合耗时费力，筛选标记无法删除等问题。

[0019] (2)本发明将组成型启动子P43与木糖还原酶基因进行连接，得到表达载体转入宿主细胞后，获得的基因工程菌木糖还原酶能在30℃的较高温度下获得高效表达，并且几乎无包涵体产生，且木糖还原酶的表达不需要添加诱导剂。

[0020] (3)本发明基因工程菌中目的基因整合进基因组后，不存在质粒分离不稳定的问题，也不需要添加抗生素，在降低生产成本的同时，减少了抗药性的问题，并且其表达不需要诱导剂，进一步降低生产成本。

附图说明
[0021] 图1为重组质粒pTrc99a-kan-xr6600的图谱。

[0022] 图2为重组质粒pBAD24M-XR的图谱。

[0023] 图3为重组质粒pCDF43的图谱。

[0024] 图4为重组质粒pRC43的图谱。

[0025] 图5为基因工程菌HK412的发酵结果图；
[0026] 其中，Concentration(g/L)表示浓度(g/L)，Time(h)表示发酵时间(h)，Glucose 为葡糖糖，Xylose为木糖，Xylitol为木糖醇。

[0027] 图6为基因工程菌HK422的发酵结果图；
[0028] 其中，Concentration(g/L)表示浓度(g/L)，Time(h)表示发酵时间(h)，Glucose 为葡糖糖，Xylose为木糖，Xylitol为木糖醇。

[0029] 图7为基因工程菌HK432的发酵结果图；
[0030] 其中，Concentration(g/L)表示浓度(g/L)，Time(h)表示发酵时间(h)，Glucose 为葡糖糖，Xylose为木糖，Xylitol为木糖醇。

[0031] 图8为基因工程菌的基因表达情况以及发酵结果；
[0032] A为基因工程菌IS1-1，IS5-1，IS5-2，IS5-3，IS5-4，IS5-5，IS5-6的基因表达情况；
[0033] B为基因工程菌IS1-1，IS5-1，IS5-2，IS5-3，IS5-4，IS5-5的发酵结果图；[0034] C为工程菌IS5-6的发酵结果图；
[0035] 其中，IS1-1表示以IS1为同源序列，经过一轮整合；IS5-1表示以IS5序列为同源序列，经过一轮整合，其他依次类推；Concentration(g/L)表示浓度(g/L)。

[0036] 图9为基因工程菌IS5-5在5L发酵罐中分批发酵的发酵结果图；
[0037] 其中，Concentration(g/L)表示浓度(g/L)，Time(h)表示发酵时间(h)，Glucose 为葡糖糖，Xylose为木糖，Xylitol为木糖醇，Dry cell weight(g/L)表示发酵液中基因工程菌细胞干重(g/L)。

[0038] 图10为基因工程菌IS5-5在15L发酵罐中分批补料发酵的发酵结果图；[0039] 其中，Concentration(g/L)表示浓度(g/L)，Time(h)表示发酵时间(h)，Glucose 为葡糖糖，Xylose为木糖，Xylitol为木糖醇，Dry cell weight(g/L)表示发酵液中基因工程菌细胞干重(g/L)。

具体实施方式
[0040] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

[0041] 本发明是在申请号为201410750635.3、名为“一种基因工程菌及其构建方法和在生产木糖醇中的应用”发明专利申请的基础上做的进一步研究。

[0042] 上述发明专利申请中公开了一种能够高效生产木糖醇的含特定木糖还原酶基因的基因工程菌，该木糖还原酶基因插入到特定表达载体中，以质粒的形式在基因工程菌中进行表达；如背景技术中所述的，以质粒作为表达载体时，容易导致宿主细胞代谢负担过重、质粒分离稳定性差、蛋白表达不可控，并且为了维持菌株中质粒的稳定存在，还需要添加抗生素，不仅增加生产成本还带来抗药性的问题。

为此，本发明采用基因组整合技术将目的基因整合至宿主细胞基因组上；但是，采用现有的基因组整合技术只能实现目的基因在
基因组上的单拷贝，严重影响了目的蛋白的表达量，故为解决上述问题，本发明采用特定的同源序列IS序列，该序列为宿主细胞的正常组成成分且拷贝数多，其存在对细胞的生长没有特定的功能，只是在细胞遗传时，增加其变异概率，对生物的进化有益，但是对工业生产却是无益的。

[0043] 下列实施例中，质粒pET-30a(+)、pTrc99a-rbs-xr6600和菌株HK401以及XR基因均来自申请号为201410750635.3、名为“一种基因工程菌及其构建方法和在生产木糖醇中的应用”的发明专利申请文献中，XR基因的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(DSM 4181)购至中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为(CGMCC 1.3376)。

[0044] 实施例1 不同启动子基因工程菌的构建
[0045] 1、Trc启动子表达载体的构建
[0046] 以质粒pET-30a(+)和pTrc99a-rbs-xr6600为模板，设计引物ori-kan-P1和ori-kan-P2扩增pET-30a(+)上的复制子和卡那霉素抗性基因，设计引物Ptac+XR-P1和Ptac+XR-P2扩增质粒pTrc99a-rbs-xr6600上的启动子、目的基因及终止子，分别酶切，酶切后以T4连接酶连接，构建重组质粒；并将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取卡纳霉素平板上长出的菌落，提取质粒及测序后，将验证正确的重组质粒命名为：[0047] pTrc99a-kan-xr6600，将质粒转入菌株HK401，构建含有相应重组质粒的基因工程菌，命名为HK412。

[0048] 2、pBAD启动子表达载体的构建
[0049] 用NheI和HindIII酶切pBAD24去掉多克隆位点及核糖体结合位点(RBS)，用XbaI 和HindIII酶切pET-30a(+)获得RBS位点及多克隆位点，以T4连接酶连接，构建重组质粒；并将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取氨苄青霉素平板上长出的菌落，提取质粒及测序后，将验证正确的重组质粒命名为：pBAD24M。

[0050] 用引物XR-P1和XR-P2扩增XR基因，用NdeI和HindIII分别酶切，酶切后以T4连接酶连接，构建重组质粒；并将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取氨苄青霉素平板上长出的菌落，提取质粒及测序后，将验证正确的重组质粒命名为：
[0051] pBAD24M-XR，将质粒转入菌株HK401，构建含有相应重组质粒的基因工程菌，命名为HK422。

[0052] 3、P43启动子表达载体的构建
[0053] 用引物P43-P1和P43-P2从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168中扩增强组成型启动子P43；再用引物P43-XR-P1和P43-XR-P2扩增XR基因，经过重叠PCR将P43启动子与XR基因连接在一起；用引物pcdf-P1和pcdf-P2以pCDF-duet质粒为模板，扩增质粒上的复制子及硫酸链霉素抗性基因，分别酶切，酶切后以T4连接酶连接，构建重组质粒；并将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取硫酸链霉素平板上长出的菌落，提取质粒及测序后，将验证正确的重组质粒命名为：pCDF43，将质粒转入菌株HK401，构建含有相应重组质粒的基因工程菌，命名为HK432。

[0054] 上述表达载体构建过程中采用的引物以及PCR反应体系和反应条件如下：[0055] (1)引物序列
[0056] ori-kan-P1：5’-CGGGGTACCAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGC-3’
[0057] ori-kan-P2：5’-AAAACTGCAGCAGGTGGCACTTTTCGGGGA-3’
[0058] Ptac+XR-P1：5’-GGGGTACCCATATGGTGCACTCTCAGTACAAT
[0059] CTG-3’
[0060] Ptac+XR-P2：5’-AAAACTGCAGAAAAGGCCATCCGTCAGGAT-3’
[0061] XR-P1：5’-CCGGAATTCATGGTTCCTGCTATCAAGCTCAA-3’
[0062] XR-P2：5’-CCCAAGCTTCTAACCGAAAATCCAGAGGTTCTC-3’
[0063] P43-P1：5’-CCGGAATTCGAGCTCAGCTTTATTGAGTGGATGA-3’
[0064] P43-P2：5’-GTTGAGTTTGATCGCAGGTACCATTTGTTTTCCTCCT
[0065] TGTTCCGT-3’
[0066] P43-XR-P1：5’-ACGGAACAAGGAGGAAAACAAATGGTACCTGCG
[0067] ATCAAACTCAAC-3’
[0068] P43-XR-P2：5’-CCCAAGCTTCTAACCGAAAATCCAGAGGTTCTC-3’
[0069] pcdf-P1：5’-CCCAAGCTTCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTA
[0070] GCATAACCCCTT-3’
[0071] pcdf-P2：5’-CCGGAATTCGCGGTTCAGTAGAAAAGATCAAAGGA
[0072] TC-3’
[0073] (2)PCR反应体系：
[0074] 体系总体积为50μL，其中PrimerSTAR Max DNA Polymerase 25L，上下游引物(10μM)各1.5L，模板(50ng/ml)1L，ddH
2
O 21L。

[0075] (3)PCR反应程序：
[0076] 5℃预变性2min；98℃变性10s，Tm退火15s，72℃延伸5s/kb，30个循环；72℃延伸5min，4℃保温。

[0077] 将各基因工程菌经活化后接种于LB(5g L-1酵母膏，10g L-1蛋白胨，和10g L-1NaCl)培养基中，分别在30℃下培养15h，培养完成后离心收集细胞，使用磷酸钾缓冲液(pH 7.4)重悬，破胞后离心获得上清液即为粗酶液，采用NADPH在340nm处的吸光度法分别检测木糖还原酶的酶活。

经测定HK412，HK422和HK432的酶活分别为3644.2U/L，1071.8U/ L和2758.3U/L。

[0078] 实施例2 不同工程菌产木糖醇能力的测试
[0079] 将工程菌HK412、HK422、HK432按2％接种于45mL改良M9培养基(1L培养基中含
4～6g Na
2HPO
4
，2～5g KH
2
PO
4
，1～2g NH
4
Cl，1～5g NaCl，1～5mM MgSO
4
，1～5mMCaCl
2
，
2～10g/L酵母膏)中，于30℃下培养至OD600为0.6～1时，添加适量诱导剂(Trc：IPTG pBAD：阿拉伯糖)并向发酵液中添加木糖至终浓度为20g/L、添加葡萄糖至终浓度为10g/L，于30℃培养，考察各工程菌的发酵特性，考察结果如图5、6、7所示。

[0080] 如图5所示，工程菌HK412在0.1mM IPTG诱导后能在34.5h内将葡萄糖和木糖消耗完，产生木糖醇18.5g/L，生产效率为0.62g/L/h；
[0081] 如图6所示，工程菌HK422在0.2％阿拉伯糖的诱导下，在34.5h内并不能全部利用完葡萄糖和木糖，产生19.5g/L木糖醇，生产效率为0.48g/L/h；
[0082] 如图7所示，工程菌HK432在不需要诱导剂的情况下，在34.5h内也能全部利用完葡萄糖和木糖，木糖醇浓度为19.79g/L，木糖醇的生产速率最高达0.7g/L/h。

[0083] 实施例3 整合载体的构建
[0084] 用引物CM+R6K-P1和CM+R6K-P2以PKD3为模板扩增R6K复制子和携带FRT位点的氯霉素抗性基因，用引物IS5-P1和IS5-P2扩增插入序列IS5，通过重叠PCR将IS5序列与R6K复制子和氯霉素抗性连在一起，设计引物pCDF43-P1和pCDF43-P2，以pCDF43为模板扩增启动子P43、XR和终止子，分别酶切，酶切后以T4连接酶连接，构建重组质粒；并将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取硫酸链霉素平板上长出的菌落，提取质粒及测序后，将验证正确的重组质粒命名为：pRC43。

[0085] 其中，引物的具体序列如下：
[0086] CM+R6K-P1：5’-AAAACTGCAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAA-3’
[0087] CM+R6K-P2：5’-AGTGGGAGAGATCTCACTAAGGTGCCTCACTGATT
[0088] AAGCATTGG-3’
[0089] IS5-P1：5’-CCGGAATTCAAGAGATTTTCTTGTCCCGCATG-3’
[0090] IS5-P2：5’-TGCTTAATCAGTGAGGCACCTTAGTGAGATCTCTCCCA
[0091] CTGACGTAT-3’
[0092] pCDF43-P1：5’-CCGGAATTCGAGCTCAGCTTTATTGAGT-3’
[0093] pCDF43-P2：5’AAAACTGCAGTGCTGGTTTACCGGTTTATTGACTA-3’
[0094] 利用构建pRC43相同的方法，构建带有IS1整合序列的质粒，命名为pRC431.引物序列为：
[0095] IS1-P1：5’-CCGGAATTCATCAGCTGTCCCTCCTGTTCAG-3’
[0096] IS1-P2：5’-TGCTTAATCAGTGAGGCACCTTATTGATAGTGTTTTATGTTCAGATAATGCCCGATG AC-3’。

[0097] 实施例4 多拷贝整合基因工程菌的构建
[0098] 提取pRC43质粒，以HK401菌株为多拷贝整合宿主，简单的氯化钙法制作感受态，热击法转化，涂布，筛选能在氯霉素抗性平板生长的菌落即为质粒整合进基因组的菌株；将获得的菌株再制作成感受态，导入PCP20质粒，30℃培养至菌液变浑浊，升高温度至42℃过夜培养，借助FRT位点将菌体携带的氯霉素抗性基因删除。

如此往复，获得不同拷贝数的菌株IS5-1，IS5-2，IS5-3，IS5-4，IS5-5，IS5-6。

为了验证其它IS序列同样可以作为整合位点，用同样的方法用pRC431进行整合，获得IS1-1。

[0099] 整合菌株拷贝数的确定：
[0100] 将各菌株接种于LB培养基中，培养6h后收取菌体，利用TRIzol试剂提取总mRNA，
利用反转录试剂盒将mRNA反转录成cDNA，以此为模板利用One Step SYBR PrimeScript TM RT-PCR KitII荧光定量PCR试剂盒使用Bio-Rad CFX96Real-Time PCR检测系统扩增目的基因，以16sRNA为内参基因，使用FX Manager软件计算出菌株目的基因的表达情况，间接算出基因的拷贝数。

[0101] 荧光定量PCR引物如下：
[0102] QPCR-F：GACGGCAAGAGCGAGAT；
[0103] QPCR-R：TGCTGGACGAGGTAGGG
[0104] 16sRNA-F：ACCCTTATCCTTTGTTGCC；
[0105] 16sRNA-R：TATGAGGTCCGCTTGCTCT；
[0106] 由于利用大肠杆菌自身的重组系统进行基因组整合，其重组效率相对较低，每一轮整合，也基本都是增加一个拷贝，通过定量PCR的结果可以看出此结果(图8A)。

[0107] 通过上述实施例2中所述的相同方法考察不同拷贝数的菌株生产木糖的能力，从图8B，8C可以看出，随着拷贝数的增加木糖醇的产量逐渐增加，当拷贝达到6个时，其生产效率相比较5个拷贝时，并没有显著增加，当拷贝数达到5个时，其转化效率已与使用质粒的水平相当这说明在使用质粒时，虽然酶活较高，但这并不是木糖醇生产效率的决定因素，反而在发酵过程中造成酶的浪费及宿主菌过重的代谢负担，所以选择5个拷贝作为最终菌种。

[0108] 另外，通过IS1作为同源序列的整合也能达到IS5同样的效果，说明IS序列作为同原序列进行整合是一种简便有效的基因组整合方法。

[0109] 实施例5 利用工程菌IS5-5生产木糖醇的应用实例
[0110] 1、重组工程菌分批发酵
[0111] (1)将工程菌IS5-5按2％接种过夜的种子培养基中，于30℃下培养8h，获得种子液；
[0112] 种子培养基及发酵培养基的配方为：1L培养基中，含4～6g Na2HPO4，2～5g
KH
2PO
4
，1～2g NH
4
Cl，1～5g NaCl，1～5mM MgSO
4
，1～5mM CaCl
2
，10～20g/L蛋白胨，2～
8g/L的酵母膏。

[0113] (2)将种子液按10％接种至装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，于30℃下培养至OD
600
为5～15(约4h)时，向发酵液中添加木糖至终浓度为100g/L、添加葡萄糖至终浓度为50g/L，于30℃培养，定点采集样品测定各种糖及木糖醇的含量。

[0114] 分析条件：Dionex UltiMate 3000高效液相系统，Corona Charged Aerosol检测器，Aminex HPX-87C(7.8mm×300mm)糖柱，流动相为纯水(0.8mL min-1，76℃)。

[0115] 考察工程菌IS5-5发酵液中的发酵特性，见图9。

[0116] 由图9可见，工程菌IS5-5能快速的转化木糖生产木糖醇，发酵液中，木糖醇最终浓度能达到123.2g//L，生产效率为1.81g/L/h。

[0117] 2、重组工程菌分批补料发酵
[0118] 步骤(1)-(2)同本实施例第1部分“工程菌分批发酵”(发酵在15L发酵罐中进行)，在发酵进行到40h时另外补加木糖和葡萄糖至终浓度分别为80g/L和40g/L，考察工程菌IS5-5的发酵特性，见图10。

[0119] 由图10可见，经过100小时的发酵，工程菌IS5-5能将所有糖耗完，发酵液中木糖醇最终浓度达到180.74g/L。