小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定

小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定
摘要：
过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，是过氧化物酶体的标志酶尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2 对细胞的危害。

人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。

过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。

溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37℃，最适pH值约为7.8。

本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶。

建立了一套适合一般实验室分离纯化过氧化氢酶的方法，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。

现报告如下：
一、实验器材
1、实验动物：成年雄性小鼠（河北医科大学实验动物中心提供）
2、主要器材：托盘天平，组织捣碎机，离心管，H2050R高速冷冻离心机，CU600型电热恒温水箱，DYY-8L型电泳仪（北京市六一仪器厂），H2S-H水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司），垂直板型电泳装置，制冰机，4℃冰箱
二、实验方法
1、过氧化氢酶制备
● 匀浆
是根据过氧化氢酶的性质，利用有机溶剂将组织细胞捣碎，使其释放出来的方法。

小鼠肝脏匀浆液制备：用颈椎脱臼法处死小鼠，取出肝脏，称重 6g；按1：8.5的比例加入匀浆缓冲液51ml（0.05mol/L醋酸-23.5%乙醇缓冲液，pH4.0）,匀浆机捣碎3-5min；缓慢滴加匀浆液体积0.5倍的氯仿（边加边快速搅拌）再次匀浆1min；匀浆液离心（4℃, 6500rpm, 30min）后保留上清液备用。

● 盐析
是在过氧化氢酶中加入适当浓度的中性盐溶液，破坏其水化膜，使其成盐析状态而沉淀下来，离心后可除去部分杂蛋白。

盐析法粗提过氧化氢酶：缓慢加入上清液体积0.06倍的0.5mol/L的硫酸钠溶液，冰浴搅拌1h，离心（4℃, 6500rpm, 10min）
，保留离心沉淀；加入4倍肝重（0.1mol /L pH7.8）的磷酸缓冲液手动玻璃匀浆器使沉淀溶解,离心（4℃, 4000rpm, 10min）,保留上清备用。

● 透析
是利用透析袋的半透过性，在一定透析条件下，使过氧化氢酶以不变性的沉淀形式析出，复溶后，可除去部分杂蛋白。

透析法纯化过氧化氢酶：将上清液置于透析袋，透析两周（透析液：20%乙醇，0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/L氯化钠）中途更换一次透析液；透析后取出浊溶液，离心（4℃, 6500rpm, 10min），取沉淀，溶于0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液中,离心（4℃,4500rpm, 10min）收获上清，得到小鼠肝脏过氧化氢酶溶液。

将收获的上清液（3组合并为一组）放入处理过的透析袋中，置于50%的甘油中包埋浓缩24小时后放冰箱保存，
制备过程中各阶段产物用比色测定法测定酶活，分析制备效率。

分离纯化产物酶活性回收率用各步产物的酶活占匀浆上清液酶活的百分比来表示。

● 层析
是根据混合物中各种物质分子大小不同，在凝胶层柱的扩散移动速度不同使混合物分离的方法。

分别在280nm和407nm波长下测光吸收值，合并收集峰值重合管，得到纯化过的过氧化氢酶。

取出装柱好的层析柱，打开出口使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床面平齐时，沿柱口旋转加样，同时开始收集层析柱的流出液，每管收集约25滴，一次在407nm和280nm波长下，测定各管吸光度值。

并绘制曲线。

2、过氧化氢酶的性质测定
● 电泳
电泳是根据带电颗粒在电场作用下向着预期与其电荷相反的电极移动的现象，蛋白质电泳迁移率主要取决于它的相对分子量。

所以用电泳法可测定过氧化氢酶的分子量。

用定量移液器把样品和MAKER加在配好的SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板的样品槽内，接上电源开始电泳（55min），取出凝胶，用考马斯亮蓝R-250染色
15min；脱色后放置一周后观察蛋白质条带情况，并计算相对迁移率
● lowry 法测定纯化的过氧化氢酶浓度
是根据蛋白质中的酪氨酸与酚试剂之磷钼酸、磷钨酸作用产生蓝色化合物，其颜色深浅与蛋白含量成正比的方法。

作出标准曲线的到过氧化氢酶的浓度
制作标准蛋白的选择：选择与待测样品相同组成的蛋白质作为标准蛋白溶液。

标准蛋白溶液的配制：将标准蛋白经凯式定氮法准确测定其蛋白含量，再用无离子水配成0.1mg∕mL储存液。

按照表（如下）配成不同浓度的标准蛋白组，编上号码，以第一管为空白管，在分光度计上测定650mn处的光密度值。

以各标准浓度为横坐标，各管密度值为纵坐标作图，绘制标准曲线。

● 米式常数值测定
滴定法：以H2O2 为底物，用过氧化氢酶催化其分解10min，加入硫酸终止催化反应，并用已知浓度高锰酸钾滴定剩余的H2O2，换算出减少的H2O2的量，进而计算出酶的活力。

在Km值测定中采用此法测定酶活力。

过氧化氢酶活力单位定义为：以每分钟催化1μmolH2O2减少所需的过氧化氢酶的量作为一个酶活性单位（U）。

样品的比活以每毫克样品蛋白所含的酶活性单位数表示。

三、实验结果
层析后蛋白吸光度变化曲线图
407nm 280nm
16 0.093 0.158
17 0.108 0.189
18 0.135 0.234
19 0.475 0.264
20 0.152 0.222
21 0.171 0.210
22 0.170 0.194
图如下：
SDS-PAGE测定过氧化氢酶分子量
相对迁移率Rf=样品迁移距离/BPB的迁移距离
LgMr（层析蛋白）=4.78 Mr（层析蛋白）=60255.9 Mr（过氧化氢酶）=4* Mr（层析蛋白）
=241.024KD
图如下：
lowry 法测定纯化的过氧化氢酶浓度
不同浓度的标准蛋白质组配置：
试剂C 3 3 3 3 3 3 3 3
A650 0 0.001 0.131 0.192 0.255 0.312 0.134 0.090 蛋白质浓度0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.043 0.028
图如下：
Km值的测定：
项目 1 2 3
加入H2O2的ml数 2.50 2.00 1.0
KmnO4的用量16.9 13.3 6.3
1/v=1÷
64.52 74.07 117.65
1/[s]=1÷
30.00 37.45 75.19
酶活= 消耗底物量 /时间
酶体积
图如下：
小鼠肝脏过氧化氢酶分离纯化
溶液体积(ml) 蛋白浓度
（mg/ml）
酶活
Km
mmol/L
分子量IU /ml
总酶活
(105)
比活
（IU/mg）
回收
率%
匀浆49.7 1.432 3.2×1031.5904 44.9 100 58.8 241.024
比活（IU/mg） = 酶活力/蛋白浓度
总酶活力105 = 酶活力×溶液体积
酶活力(U/ml) = (H2O2 的浓度×加入H2O2 的ml数—2.5×KmnO4 ml数
×KmnO4浓度 / 加入样品的ml数) ×105
回收率% = 用各步产物的酶活力占匀浆离心上清液酶活力的百分比来表示
四.实验讨论
1.为什么选择雄性小鼠的肝脏做实验？
答：因为雄性小鼠的身体健康指标比雌性小鼠要好。

实验要减少偶然，就必须保证在实验过程中引起某个症状的原因是客观的，而不是由于小鼠本身的原因造成的，所以用雄性小鼠会好一点。

过氧化氢酶存在于所有已知的动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在。

所以用雄性的小鼠的肝脏做实验。

2.组织匀浆法的目的是什么？
答：在保证过氧化氢酶天然活性的状态下，把肝脏细胞打碎，释放出过氧化氢酶
3．为什么匀浆缓冲液中加23.5％乙醇？
答：因为乙醇可以溶解酯质的物质，而过氧化氢酶在乙醇中溶解度很小。

4.匀浆法中，为什么加氯仿，而且要边加边搅拌？
答：加氯彷是让除过氧化氢酶以外的蛋白质变性。

因为氯仿能使蛋白质变性，但过氧化氢酶遇氯仿不变性。

边加边搅拌是防止因局部氯仿浓度过高，将过氧化氢酶也氧化。

5.盐析时，为什么选择硫酸钠？
答：盐能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质沉淀。

硫酸钠是中性盐，对溶液的pH影响小。

氯化钠也行。

6.盐析时，为什么要在冰浴搅拌的状态下，且要缓慢滴加？
答：常温下，酶的活性有损伤。

搅拌和缓慢滴加，是防止局部盐浓度过高，使杂蛋白析出。

7.为什么匀浆、透析中用醋酸缓冲液，而盐析、凝胶层析中用的都是磷酸缓冲液？
答：醋酸缓冲液的缓冲范围的pH值在4.7左右，过氧化氢酶在pH为4.7左右的溶液中溶解度极小，而磷酸缓冲液的缓冲范围的pH值在7.8左右，过氧化氢酶在7.8左右的溶解度很大，醋酸缓冲液是使过氧化氢酶沉淀，而磷酸缓冲液是使过氧化氢酶溶解，这两种缓冲液的作用目的不一样。

8.为什么透析袋要煮沸后才能使用？
答：为防干裂，透析袋出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，
用前必须除去。

可先用50％乙醇煮沸1小时，再依次用50％乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。

实验证明，50％乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。

使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN3，以防长菌。

洗净凉干的透
析袋弯折时易裂口，用时必须仔细检查，不漏时方可重复使用。

9.为什么透析时透析液的pH要维持在4.7左右？
答：过氧化氢酶在pH为4.7的时候溶解度小，容易沉淀。

而杂蛋白不易沉淀，溶解在其中，易于分离。