两种胶体金制备方法的比较研究

两种胶体金制备方法的比较研究宋宏新，符海英，薛海燕，张玥，邹联柱（陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西西安710021）摘要：通过控制还原剂的加入量（20mL 0.01%四氯金酸溶液中1%柠檬酸钠和抗坏血酸添加量分别为300μL 与400μL ），利用柠檬酸钠和抗坏血酸还原两种方法制备得到了平均粒径为20nm 的胶体金颗粒，并对其进行了抗体标记比较研究.结果显示：抗坏血酸还原法制备得到的胶体金标记的蛋白量为15.18μg/mL （蛋白质量/胶体金体积，下同），高于柠檬酸钠还原法的5.07μg/mL ，间接ELISA 法测得其效价（1∶800）也比柠檬酸钠还原法制备的颗粒标记物高（1∶400），这表明抗坏血酸还原法更适合于标记用胶体金颗粒的制备.关键词：柠檬酸钠还原法；抗坏血酸还原法；胶体金标记；抗体中图分类号：TS201.2文献标志码：BDOI ：0引言胶体金是以金核为中心，通过静电作用形成的多相不均匀体系，粒径范围属于胶体，是法拉第于1857年发现的[1]. 胶体金的大规模应用要得益于其抗体标记技术的出现，1971年Faulk 等[2]将抗沙门氏菌抗血清与胶体金连接，开创了免疫胶体金技术的先河，推动了胶体金应用领域的不断扩展，现今，胶体金技术已广泛应用到了细胞组织定位[3]、免疫诊断[4-5]、食品安全检测[6]和环境质量检测[7]等多个领域中. 随着胶体金应用范围的不断扩展，其制备方法也成为了人们研究的热点，主要有化学还原法、相转移法和反胶团法等[8]，其中化学还原法由于制备工艺简单、易于操作，仍然为研究工作者们所青睐，使用不同种类还原剂制备胶体金已有研究报道，但大部分都是以制得的胶体金的粒径、均匀度等来对胶体金进行评价[9]，对于对后续标记步骤的影响的研究较少. 本试验对抗坏血酸法和柠檬酸钠法制备的相同粒径的胶体金进行了抗体标记，并对标记效果进行了检测，得到了使用不同还原剂对标记效果存在影响的结论，为免疫标记用胶体金制备方法的选择提供了重要的参考依据.1材料与方法1.1试剂与仪器1.1.1主要试剂四氯金酸、BSA ：美国Sigma 公司；HRP 酶标记羊抗兔IgG ：北京博奥森生物技术有限公司；抗大肠杆菌O 157∶H 7 IgG 样品：实验室自制（抗体蛋白含量0.43 mg/mL ，纯度为电泳单点纯）；考马斯亮蓝G-250试剂：美国Amresco 公司；其他均为国产分析纯试剂. 1.1.2主要仪器高速冷冻离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司；SP756型紫外-可见扫描分光光度计：上海光谱仪器有限公司；移液器：德国Eppendorf 公司；酶标仪：Thermo Electron Corporation. 1.2方法1.2.1柠檬酸钠还原法还原剂添加量的确定取3个经超纯水冲洗过的洁净烧杯，加入0.01%（W /V ）四氯金酸20 mL ，加热至沸腾，分别加入1%柠檬酸钠300 μL 、400 μL 和500 μL ，搅拌条件下继续加热反应10 min ，撤去热源，继续搅拌使之冷却，并补加超纯水至20 mL ，4 ℃避光保存待检. 1.2.2抗坏血酸还原法还原剂添加量的确定同上在4个烧杯中加入四氯金酸溶液，分别加入1%抗坏血酸溶液250 μL 、300 μL 、350 μL 和收稿日期：2011-09-09作者简介：宋宏新（1959-），男，陕西咸阳人，教授，主要从事食品营养安全及分子免疫检测方面的科研与教学工作.文章编号：1673-2383（2012）01-0053-04网络出版网址：网络出版时间：河南工业大学学报（自然科学版）Journal of Henan University of Technology （Natural Science Edition ）第33卷第1期2012年2月Vol.33，No.1Feb.2012CNKI:41-1378/N.20120208.0844.0132012-02-08 08:44网络出版地址：/kcms/detail/41.1378.N.20120208.0844.013.html河南工业大学学报（自然科学版）第33卷400 μL ，加热搅拌条件下反应5 min ，撤去热源，继续搅拌使之冷却后补超纯水至20 mL ，4 ℃避光保存待检. 1.2.3胶体金颗粒质量评价及粒径的确定通过目测可以得到胶体金的外观特征，而经400~800 nm 下的分光光度扫描可以得到胶体金的最大吸收峰波长，由最大吸收峰波长与粒径存在的线性关系Y =0.427 1X +514.56（Y 为最大吸收峰波长，X 为平均粒径）[10]，可得到平均粒径，由相对峰宽（峰宽/峰高）大小可以知道胶体金颗粒的均匀度. 1.2.4抗体的胶体金标记抗体标记前，先采用Mey 氏稳定化试验[11]确定最佳蛋白标记量和最佳标记pH ，然后在该条件下进行胶体金标记，取两种不同方法制备的胶体金各5 mL ，用0.1 moL/L HCl 和K 2CO 3调pH 至最佳，加入最佳蛋白标记量的抗体样液，混匀让其反应10 min ，低速离心（1 000 r/min ，30 min ），弃沉淀，上清高速离心（10 000 r/min ，4 ℃，60 min ），沉淀用PBS 洗涤3次，最后一次用1/3原体积的PBS 溶解，并加入1%BSA ，4 ℃避光保存备用. 1.2.5胶体金标记效果的比较采用考马斯亮蓝法测定高速离心后上清液的蛋白含量，并通过加入的蛋白总量确定蛋白的实际标记量，采用间接ELISA 方法，测得金标后抗体的效价，具体过程如下：将两种金标抗体用稀释液按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600稀释成不同浓度，以阴性血清作为对照，按照文献[8]方法进行测定，得到450 nm 下的OD 值（OD 450），以与阴性血清OD 值之比大于等于2.1（P/N ≥2.1）判定为阳性，阳性的最大稀释度即为金标抗体的效价，效价反映了抗体活性的大小.2结果与讨论2.1柠檬酸钠添加量的确定1%柠檬酸钠添加量分别为300 μL 、400 μL 和500 μL 时，制备得到的胶体金外观效果良好，透明，无悬浮物出现. 经400~800 nm 扫描，得到扫描图谱如图1所示.由图1可知，3种柠檬酸钠添加量的扫描曲线相对峰宽接近，均匀度状态接近，400 μL 添加量制得的颗粒相对均匀，而300 μL 添加量制得的胶体金颗粒最大吸收峰波长为523 nm ，由1.2.3中的线性关系，得到其平均粒径为20 nm ，因此，选择300 μL 为1%柠檬酸钠添加量. 2.2抗坏血酸添加量的确定4种抗坏血酸添加量制备得到的胶体金溶液呈红色，透明，无漂浮物，符合外观要求. 经400~800 nm 分光光度扫描得到曲线如图2所示.由图2可知，当1%抗坏血酸添加量为350 μL 时，相对峰宽较小，均匀度较好，但其最大吸收峰波长为530 nm ，粒径较大，而添加量为400 μL 时，最大吸收峰波长为524 nm ，平均粒径为20 nm ，因此，选择400 μL 为1%抗坏血酸加入量. 2.3抗体的胶体金标记及其标记效果的测定2.3.1标记最佳条件的选择通过Mey 氏稳定性试验，得到两种胶体金颗粒与抗大肠杆菌O 157∶H 7 IgG 进行标记时的最佳pH 值均为8.0，而最佳蛋白标记量不同，柠檬酸钠还原法制备的胶体金颗粒的最佳蛋白标记量为26 μL/mL （抗体样液体积/胶体金体积，下同），抗坏血酸还原法制得的颗粒为65 μL/mL. 2.3.2实际蛋白标记量的确定对两种胶体金溶液各5 mL 进行了IgG 抗体的标记，根据蛋白添加量以及蛋白浓度，得到柠檬酸钠法与抗坏血酸法制备的胶体金加入的蛋白总量分别为55.90 μg 和139.75 μg ，由考马斯亮蓝法测得离心上清液中的蛋白量分别为30.54 μg 和63.85 μg ，因此，实际的蛋白标记量为5.07 μg/mL 和15.18 μg/mL ，图2不同抗坏血酸添加量胶体金扫描图谱图1不同柠檬酸钠添加量胶体金扫描图谱54第1期稀释度柠檬酸钠法抗坏血酸法OD 450P/N OD 450P/N 1∶501∶1001∶2000.9710.6350.427 6.994.573.07 1.2330.8340.6018.876.004.32抗坏血酸法制备得到的胶体金颗粒的实际蛋白标记量较大，能连接上更多的IgG 抗体. 2.3.3两种胶体金标记抗体活性的测定经间接ELISA 检测，获得了两类不同稀释度抗体的效价结果，如表1所示. 粒所能标记的蛋白量较大，标记后抗体的活性较高，比柠檬酸钠还原法得到的颗粒更适合于后续的免疫标记. 参考文献：白丽荣，毛占伟，王慧，等.氨苄青霉素标记的胶体金颗粒的制备及活性研究［J ］.生物加工过程，2008，6（2）：66-69.Faulk W P ，Taylor G M.An immunocolloid method for the electron microscope ［J ］.Imm 蛳unochemistry ，1971，8（11）：1081-1083.丁明孝，梁凤霞，焦仁杰，等.胶体金标记技术-DNA 、RNA 、蛋白质和糖的定性与定位研究［J ］.电子显微学报，1994，13（5）：377.Piras L ，Reho S.Colloidal gold based electro 蛳chemical immunoassays for the diagnosis of a 蛳cute myocardial infarction ［J ］.Sensors and Ac 蛳tuators B ，2005，111-112：450-454.Jiang Z L ，Sun S J ，Liang A H ，et al.A new spectral assay for nanoparticle label ，2006，571：200-胶体金免疫层析J ］.食品工业科A sensitive im 蛳usingcolloidaldetection of in water samples ，2009，24：纳米胶体金的制2011，36四种化学还原法.湖北农业科学，A reusable ca 蛳pacitive immunosensor with a novel immobi 蛳lization procedure based on 1，6-hexanedithiol and nano-Au self-assembled layers ［J ］.Sen 蛳sors and Actuators B ，2005，111-112（2）：327-334.夏宝宣，杜美利.纳米胶体金最佳标记条件的一种简易方法研究［J ］.标记免疫分析与临床，2010，17（1）：36-38.［1］［2］［3］［4］［5］［11］表1间接ELISA 测得的两类金标抗体效价宋宏新，等：两种胶体金制备方法的比较研究55河南工业大学学报（自然科学版）第33卷The orthogonal experiments showed that the influence degree of the three factors on the adsorption effect was as follows: pH, adsorption temperature and adsorption time; and the optimum adsorption conditions were pH 2.0, adsorption temperature 40 ℃and adsorption time 4 hours. Freundlich adsorption isothermal equation could well describe the adsorption thermodynamic behavior of Pb 2+; a second kinetic model could describe the adsorption kinetic behavior; the adsorption process was fast firstly and then turned to slow adsorption after 60 minutes; and the optimum solid-to-liquid ratio was 12 g/L for the Pb 2+ solution with the mass concentration of 60 mg/L. Key words ：apple residue ；Pb 2+；biosorption ；adsorption isotherm ；dynamic adsorption curve ；solid-to-liquid ratioCOMPARISON OF TWO COLLOIDAL GOLD PREPARATION METHODSSONG Hong-xin, FU Hai-ying, XUE Hai-yan, ZHANG Yue, ZOU Lian-zhu（College of Life Science and Engineering,Shanxi University of Science and Technology,Xi'an 710021,China ）Abstract ：In this paper, colloidal gold particles with the average particle size of 20 nm were prepared by sodium citrate reduction method and ascorbic acid reduction method by controlling the addition amount of reductants, and we also compared the antibody labeling. The results showed that the amount of protein labeled by colloidal gold prepared by ascorbic acid reduction method was 15.18 μg/mL, which was higher than that of the sodium citrate reduction method (5.07 μg/mL); and the titer of the former determined by intermediate ELISA was 1∶800, which 56。