一种小鼠原代角质细胞和原代免疫细胞非接触共培养的方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010607662.0
(22)申请日 2020.06.29
(71)申请人 安徽医科大学第一附属医院
地址 230022 安徽省合肥市蜀山区绩溪路
218号
(72)发明人 孙良丹　俞亚芬　甄琪　李报　
雍亮　葛荟瑶　毛艺文　陈微微　
(74)专利代理机构 北京东方盛凡知识产权代理
事务所(普通合伙) 11562
代理人 谢秀娟
(51)Int.Cl.
C12N 5/071(2010.01)
C12N 5/078(2010.01)
(54)发明名称
一种小鼠原代角质细胞和原代免疫细胞非
接触共培养的方法
(57)摘要
本发明公开了一种小鼠原代角质细胞和原
代免疫细胞非接触共培养的方法，属于生物技术
领域，包括小鼠原代角质细胞分离、小鼠原代角
质细胞培养、小鼠皮肤免疫细胞的分离、小鼠原
代角质细胞与免疫细胞非接触共培养；本发明原
代角质细胞分离方法进行改造，并建立了完善的
原代角质细胞与原代免疫细胞共培养体系，简化
细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测
实验结果，为研究免疫缺陷小鼠中角质形成细胞
的改变提供技术手段。

权利要求书1页 说明书5页 附图1页CN 111676186 A 2020.09.18
C N 111676186
A
1.一种小鼠原代角质细胞和原代免疫细胞非接触共培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)小鼠原代角质细胞分离：将清洗消毒后的新生小鼠皮肤样品，切成小块，表皮朝上真皮朝下，立即放入HBSS配制的Dispase II中，使皮肤漂浮在液体中，4℃避光消化过夜；将表皮剥离下来放入预冷的HBSS中洗涤以去除残留在表皮上的Dispase II；将表皮迅速放入5mL 0.05％的胰酶中，37℃水浴消化5min后摇晃数次，再放入37℃水浴中继续消化5mi n；加入10mL预冷的TNS终止消化，过70μm细胞筛获得分离的角质细胞，所述TNS为含5％螯合FBS的HBSS；1500rpm的转速下离心5分钟，收集角质细胞沉淀，并用HBSS洗涤一次；1500rpm 的转速下离心5分钟后弃上清；
(2)小鼠原代角质细胞培养：收集的角质细胞沉淀使用无血清培养基重悬，按照1*107cells/cm 2接种到I型胶原包被的细胞培养板或细胞培养皿中，接种2d首次换液并在显微镜下观察并记录细胞贴壁生长情况，此后，每天更换新鲜培养基，并观察和记录细胞生长状态；
(3)小鼠皮肤免疫细胞的分离：取成年小鼠皮肤，切碎后用30ml消化酶溶液于37℃摇床中消化1.5h，转速250rpm，然后加入150ul 1mg/ml DNase I，继续消化30min，将处理好的皮肤碎片用70um细胞滤器过滤后经1400rpm，8min离心收集，收集的细胞沉淀用淋巴细胞分离液处理，获得高纯度的皮肤免疫细胞；
(4)小鼠原代角质细胞与免疫细胞非接触共培养：以12孔细胞培养板为例，小鼠原代角质细胞接种于12孔板下室中培养，接种后第2天起每天换液，培养基为1ml 154CF完全培养基，培养至3-7d；步骤(3)分离出的免疫细胞，用RPMI -1640完全培养基调整细胞密度为1*106cells/ml，接种于培养皿中培养复活，2-3h后，取0.5ml免疫细胞悬液转移到trans well 上室，常规培养12-48h后进行后续分析，时间点的选择根据后续试验分析的方法而定。

2.根据权利要求1所述的小鼠原代角质细胞和原代免疫细胞非接触共培养的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述HBSS配制的Dispase II不含钙、镁离子，浓度为2mg/mL。

3.根据权利要求1所述的小鼠原代角质细胞和原代免疫细胞非接触共培养的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述0.05％的胰酶采用HBSS稀释。

4.根据权利要求1所述的小鼠原代角质细胞和原代免疫细胞非接触共培养的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述无血清培养基的成分包括：154CF培养基+1％HKGS+1％Pen Strep/Fungizone+0.05mM CaCl 2。

5.根据权利要求1所述的小鼠原代角质细胞和原代免疫细胞非接触共培养的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述消化酶溶液的成分包括：D MEM+1.2g BSA+0.12g胶原酶I+0.06g 胶原酶4+0.06g透明质酸酶。

6.根据权利要求1所述的小鼠原代角质细胞和原代免疫细胞非接触共培养的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述154CF完全培养基的成分包括：154CF培养基+1％HKGS+1％Pen Strep/Fungizone+0.05mM CaCl 2。

7.根据权利要求1所述的小鼠原代角质细胞和原代免疫细胞非接触共培养的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述RPMI -1640完全培养基的成分包括：RPMI -1640+10％螯合FBS+1％Pen Strep/Fungizone。

权　利　要　求　书1/1页CN 111676186 A
一种小鼠原代角质细胞和原代免疫细胞非接触共培养的方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种小鼠原代角质细胞和原代 免疫细胞非接触共培养的方法。

背景技术
[0002]从新生和成年小鼠表皮制备和培养原代角质形成细胞的方法常应用于 体外信号通路、分化和细胞转化的研究，而小鼠原代角质细胞与原代免疫 细胞共培养是评估免疫缺陷小鼠细胞移植中角质形成细胞表型改变重要手 段，对于建立皮肤疾病小鼠模型具有重要意义。

目前普遍的小鼠原代角质 细胞分离方法为胰蛋白酶冷温两步消化法。

现有的小鼠原代角质细胞分离 方法中存在细胞存活率低、细胞纯度低、其他细胞污染的问题。

此外原代 角质细胞与免疫细胞共培养体系中完全使用适合角质细胞的无血清培养基 可能会造成免疫细胞生长所必需的的成分缺失，影响免疫细胞生长代谢， 而完全使用传统培养基，可能造成角质细胞终末端分化，对相关细胞因子 的释放、角质细胞生理造成干扰。

发明内容
[0003]本发明的目的是提供一种小鼠原代角质细胞和原代免疫细胞非接触共 培养的方法，以解决上述现有技术存在的问题。

[0004]为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
[0005]本发明提供一种小鼠原代角质细胞和原代免疫细胞非接触共培养的方 法，包括以下步骤：
[0006](1)小鼠原代角质细胞分离：将清洗消毒后的新生小鼠皮肤样品，切 成小块，表皮朝上真皮朝下，立即放入HBSS配制的Dispase II中，使皮 肤漂浮在液体中，4℃避光消化过夜；将表皮剥离下来放入预冷的HBSS中 洗涤以去除残留在表皮上的Dispase II；将表皮迅速放入5mL 0.05％的胰 酶中，37℃水浴消化5min后摇晃数次，再放入37℃水浴中继续消化5mi n；加入10mL预冷的TNS终止消化，过70μm细胞筛获得分离的角质细胞， 所述TNS为含5％螯合FBS的HBSS；1500rpm的转速下离心5分钟，收集角 质细胞沉淀，并用HBSS洗涤一次；1500rpm的转速下离心5分钟后弃上清；
[0007](2)小鼠原代角质细胞培养：收集的角质细胞沉淀使用无血清培养基 重悬，按照1*107cells/cm2接种到I型胶原包被的细胞培养板或细胞培养 皿中，接种2d首次换液并在显微镜下观察并记录细胞贴壁生长情况，此后， 每天更换新鲜培养基，并观察和记录细胞生长状态；
[0008](3)小鼠皮肤免疫细胞的分离：取成年小鼠皮肤，切碎后用30ml消 化酶溶液于37℃摇床中消化1.5h，转速250rpm，然后加入150ul 1mg/ml DNase I，继续消化30min，将处理好的皮肤碎片用70um细胞滤器过滤后 经1400rpm，8min离心收集，收集的细胞沉淀用淋巴细胞分离液处理，获 得高纯度的皮肤免疫细胞；
[0009](4)小鼠原代角质细胞与免疫细胞非接触共培养：以12孔细胞培养 板为例，小鼠
原代角质细胞接种于12孔板下室中培养，接种后第2天起每 天换液，培养基为1ml 154CF完全培养基，培养至3-7d；步骤(3)分离 出的免疫细胞，用RPMI-1640完全培养基调整细胞密度为1*106cells/ml， 接种于培养皿中培养复活，2-3h后，取0.5ml免疫细胞悬液转移到trans well上室，常规培养12-48h后进行后续分析，时间点的选择根据后续试 验分析的方法而定。

[0010]进一步地，步骤(1)中，所述HBSS配制的Dispase II不含钙、镁离 子，浓度为2mg/ mL。

[0011]进一步地，步骤(1)中，所述0.05％的胰酶采用HBSS稀释。

[0012]进一步地，步骤(2)中，所述无血清培养基的成分包括：154CF培养 基+1％HKGS+ 1％Pen Strep/Fungizone+0.05mM CaCl2。

[0013]进一步地，步骤(3)中，所述消化酶溶液的成分包括：DMEM+1.2g B SA+0.12g胶原酶I+0.06g胶原酶4+0.06g透明质酸酶。

[0014]进一步地，步骤(4)中，所述154CF完全培养基的成分包括：154CF 培养基+1％HKGS +1％Pen Strep/Fungizone+0.05mM CaCl2。

[0015]进一步地，步骤(4)中，所述RPMI-1640完全培养基的成分包括：R PMI-1640+10％螯合FBS+1％Pen Strep/Fungizone。

[0016]本发明公开了以下技术效果：
[0017]本发明原代角质细胞分离方法进行改造，并建立了完善的原代角质细 胞与原代免疫细胞共培养体系，简化细胞的生长环境，方便施加实验因素， 便于观测实验结果，为研究免疫缺陷小鼠中角质形成细胞的改变提供技术 手段。

[0018]本发明采用Dispase II代替胰酶分离表皮真皮，可以分离出完整的表 皮层，避免了成纤维细胞的污染；胰酶对细胞膜上粘附蛋白损伤较大，原 代角质细胞贴壁能力差，对胰酶敏感，选择浓度为0.05％的胰酶对细胞膜 伤害较小，能提高细胞活性；采用0.05％的胰酶代替0.25％的胰酶消化表皮， 分离角质细胞，大大提高了角质细胞的增殖效率。

[0019]本发明选择低钙培养基，钙离子不仅会诱导角质细胞分化，还会抑制 原代角质细胞的增殖，角质细胞分离过程中的液体要使用无钙、镁离子的 HBSS，中和胰酶的血清要事先经过Chelex树脂螯合以去除钙离子，角质细 胞培养使用的也是低钙离子浓度的培养基(本发明培养基的钙离子浓度为 0.05mM)，免疫细胞使用的培养基中添加的血清为事先经过树脂螯合的低钙 血清；使用无血清培养液培养角质细胞，含血清的培养基中配制过程复杂， 培养基中的异种血清成分复杂，可能对角质细胞的生长分化造成干扰，产 生不利影响，无血清培养基可以消除异种蛋白的影响，且明显抑制成纤维 细胞的污染。

[0020]原代免疫细胞的复活：本发明从成年小鼠皮肤组织中分离出的免疫细 胞在与角质细胞共培养前，需要在有血清培养基中进行复活，相较于分离 出的免疫细胞立即与角质细胞共培养，复活过的免疫细胞的活性在共培养 过程中存活率大大提高。

[0021]本发明利用transwell建立小鼠原代角质细胞与免疫细胞的非接触共 培养体系：采用上下室中分别加入不同培养基的非接触共培养体系。

tran swell下室培养角质细胞，培养基为154CF培养基+1％HKGS+1％Pen Stre p/Fungizone+0.05mM CaCl2，transwell小室培养免疫细胞，培养基为R PMI-1640+10％螯合FBS+1％Pen Strep/Fungizone。

使用transwell小室 中的半透膜等起分隔作用的薄膜将两种细胞分隔开进行共培养，起到隔离
作用的分隔薄膜允许细胞分泌的生长因子自由交换，同时将不同类型的细 胞进行了免疫隔离，有利于细胞分离，上下室中分别加入不同培养基，提 高了两种细胞的细胞活性，降低培养基成分对两种细胞生长代谢造成干扰， 提高了安全性。

[0022]本发明从成年小鼠皮肤组织中分离出的免疫细胞在与角质细胞共培养 前，在有血清培养基中进行复活，相较于分离出的免疫细胞立即与角质细 胞共培养，复活过的免疫细胞的活性在共培养过程中存活率大大提高。

附图说明
[0023]图1为不同浓度胰酶分离角质细胞对细胞活性的影响；
[0024]图2为流式细胞仪检测的两种细胞的凋亡情况，其中，A、B、C组培 养基分别为154CF、154CF+RPMI1640和RPMI1640。

具体实施方式
[0025]现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对 本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更 详细的描述。

[0026]应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于 限制本发明。

另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该 范围的上限和下限之间的每个中间值。

在任何陈述值或陈述范围内的中间 值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也 包括在本发明内。

这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围 内。

[0027]除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述 领域的常规技术人员通常理解的相同含义。

虽然本发明仅描述了优选的方 法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等 同的任何方法和材料。

本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公 开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。

在与任何并入的文献冲突时， 以本说明书的内容为准。

[0028]在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实 施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。

由本 发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。

本申 请说明书和实施例仅是示例性的。

[0029]关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为 开放性的用语，即意指包含但不限于。

[0030]实施例1
[0031]一种小鼠原代角质细胞和原代免疫细胞非接触共培养的方法，包括以 下步骤：[0032](1)小鼠原代角质细胞分离：新生小鼠放置于CO2安乐死室20min处 死，然后浸泡于75％乙醇中去除皮肤表面微生物污染；切除四肢和尾巴， 将小鼠躯干皮肤分离下来，剪成4小块，表皮朝上真皮朝下，立即放入HB SS(不含钙、镁离子)配制的Dispase II(2mg/mL)中，使皮肤漂浮在 液体中，4℃避光消化过夜；用尖头镊子轻轻将表皮剥离下来放入预冷的H BSS中洗涤以去除残留在表皮上的Dispase II；迅速放入5mL 0.05％的胰 酶(HBSS稀释)中，37℃水浴消化5min后摇晃数次，再放入37℃水浴中 继续消化5分钟；加入10mL预冷的TNS终止消化，过70μm细胞筛获得 分离的角质细胞，TNS为含5％螯合FBS的HBSS；1500rpm的
转速下离心5 分钟，收集角质细胞沉淀，并用HBSS洗涤一次；1500rpm的转速下离心5 分钟后弃上清；
[0033](2)小鼠原代角质细胞培养：收集的角质细胞沉淀使用无血清培养基 (154CF培养基+1％HKGS+1％Pen Strep/Fungizone+0.05mM CaCl2)重悬， 按照1*107cells/cm2接种到I 型胶原包被的细胞培养板或细胞培养皿中， 接种2d首次换液并在显微镜下观察并记录细胞贴壁生长情况，此后，每天 更换新鲜培养基，并观察和记录细胞生长状态；
[0034](3)小鼠皮肤免疫细胞的分离：取成年小鼠皮肤，切碎后用30ml消 化酶溶液(DMEM +1.2g BSA+0.12g胶原酶I+0.06g胶原酶4+0.06g透明质 酸酶)于37℃摇床中消化1.5h，转速250rpm，然后加入150ul 1mg/ml D Nase I，继续消化30min，将处理好的皮肤碎片用70um 细胞滤器过滤后经 1400rpm，8min离心收集，收集的细胞沉淀用淋巴细胞分离液处理，获得 高纯度的皮肤免疫细胞；
[0035](4)小鼠原代角质细胞与免疫细胞非接触共培养：以12孔细胞培养 板为例，小鼠原代角质细胞接种于12孔板下室中培养，接种后第2天起每 天换液，培养基为1ml 154CF完全培养基(154CF培养基+1％HKGS+1％Pe n Strep/Fungizone+0.05mM CaCl2)，培养至5d；步骤(3)分离出的免 疫细胞，用RPMI-1640完全培养基(RPMI-1640+10％螯合FBS+1％Pen Str ep/Fungizone)调整细胞密度为2*105cells/ml，接种于培养皿中培养复活， 2.5h后，取0.5ml免疫细胞悬液转移到transwell上室，常规培养36h后 进行后续分析，时间点的选择根据后续试验分析的方法而定。

[0036]试验：
[0037]1、不同胰酶浓度对原代角质细胞分离后的细胞活性的影响
[0038]方法：取新生小鼠皮肤样本，采用分离酶法(Dispase II)去除真皮 组织后获得表皮部分，将表皮迅速放入5mL的胰酶中，37℃水浴消化10m in，按照胰酶浓度不同分为0.05％组、0.25％组、0.75％组，分离获得的角 质细胞接种于I型胶原包被的细胞培养板，37℃、5％CO2培养箱中培养24h 后，对应相同浓度胰酶，37℃消化20min,经台盼蓝染色后，细胞计数仪检 测细胞活率。

[0039]结果如图1所示，其分别为细胞计数仪检测所得的台盼蓝染色后的0.05％ 组、0.25％组、0.75％组角质细胞，及0.05％组、0.25％组、0.75％组角质细胞活 性统计分别为85.75±0.8539％、70.50±2.901％、52.00±1.732％，组 间比较差异有显著性(F＝70.55, P<0.0001)，结果显示0.05％胰酶消化后的角质 细胞活性最高。

[0040]2、不同的培养基成分对小鼠原代角质细胞与免疫细胞非接触共培养时 2种细胞活性的影响
[0041]方法：将分离获得的小鼠原代角质细胞接种于12孔板下室中培养，接 种后第2天起每天换液，培养基为1ml 154CF完全培养基(154CF培养基+ 1％HKGS+1％Pen Strep/ Fungizone+0.05mM CaCl2)，培养至3d，换液， 取成年小鼠皮肤分离的免疫细胞，用培养基调整细胞密度为2*105cells/m l，取0.5ml免疫细胞悬液置于transwell上室，培养24h后收细胞，流式 细胞仪检测细胞凋亡。

按照培养基成分不同分为三组，A组：transwell 下室和小室内加入的培养基均为154CF完全培养基；B组：transwell下室 内为1ml 154CF完全培养基，transwell小室内为0.5ml RPMI-1640完全 培养基；C组：transwell下室和小室内均为RPMI-1640完全培养基。

[0042]结果如表1和图2所示，表1为不同的培养基组合下角质细胞与免疫 细胞的细胞凋亡比例，图2为流式细胞仪检测的两种细胞的凋亡情况；结 果显示，A组培养基成分使免疫细胞凋亡增加，C组成分使角质细胞凋亡增 加，B组免疫细胞和角质细胞凋亡细胞率均低于单一培养基组，所以选择B 组培养基组合时，角质细胞和免疫细胞的共同活性最高。

[0043]表1
[0044]
[0045]实施例2
[0046]一种小鼠原代角质细胞和原代免疫细胞非接触共培养的方法，包括以 下步骤：[0047](1)小鼠原代角质细胞分离：新生小鼠放置于CO2安乐死室20分钟 处死，然后浸泡于75％乙醇中去除皮肤表面微生物污染；切除四肢和尾巴， 将小鼠躯干皮肤分离下来，剪成4小块，表皮朝上真皮朝下，立即放入HB SS(不含钙、镁离子)配制的Dispase II(2mg/mL)中，使皮肤漂浮在 液体中，4℃避光消化过夜；用尖头镊子轻轻将表皮剥离下来放入预冷的H BSS中洗涤以去除残留在表皮上的Dispase II；迅速放入5mL 0.05％的胰 酶(HBSS稀释)中，37℃水浴消化5min后摇晃数次，再放入37℃水浴中 继续消化5分钟；加入10mL预冷的TNS终止消化，过70μm细胞筛获得 分离的角质细胞，TNS为含5％螯合FBS的HBSS；1500rpm的转速下离心5 分钟，收集角质细胞沉淀，并用HBSS洗涤一次；1500rpm的转速下离心5 分钟后弃上清；
[0048](2)小鼠原代角质细胞培养：收集的角质细胞沉淀使用无血清培养基 (154CF培养基+1％HKGS+1％Pen Strep/Fungizone+0.05mM CaCl2)重悬， 按照1*107cells/cm2接种到I 型胶原包被的细胞培养板或细胞培养皿中， 接种2d首次换液并在显微镜下观察并记录细胞贴壁生长情况，此后，每天 更换新鲜培养基，并观察和记录细胞生长状态；
[0049](3)小鼠皮肤免疫细胞的分离：取成年小鼠皮肤，切碎后用30ml消 化酶溶液(DMEM +1.2g BSA+0.12g胶原酶I+0.06g胶原酶4+0.06g透明质 酸酶)于37℃摇床中消化1.5h，转速250rpm，然后加入150ul 1mg/ml D Nase I，继续消化30min，将处理好的皮肤碎片用70um 细胞滤器过滤后经 1400rpm，8min离心收集，收集的细胞沉淀用淋巴细胞分离液处理，获得 高纯度的皮肤免疫细胞；
[0050](4)小鼠原代角质细胞与免疫细胞非接触共培养：以12孔细胞培养 板为例，小鼠原代角质细胞接种于12孔板下室中培养，接种后第2天起每 天换液，培养基为1ml 154CF完全培养基(154CF培养基+1％HKGS+1％Pe n Strep/Fungizone+0.05mM CaCl2)，培养至3d；步骤(3)分离出的免 疫细胞，用RPMI-1640完全培养基(RPMI-1640+10％螯合FBS+1％Pen Str ep/Fungizone)调整细胞密度为1*106cells/ml，接种于培养皿中培养复活， 3h后，取0.5ml免疫细胞悬液转移到transwell上室，常规培养45h后进 行后续分析，时间点的选择根据后续试验分析的方法而定。

[0051]以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明 的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人 员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求 书确定的保护范围内。

图1
图2。