染色体分散仪在外周血染色体标本制备中的应用

染色体分散仪在外周血染色体标本制备中的应用
作者：明盛金马洪熹黄滢钟锦萍吴文跃黄瑶陈学杰
来源：《右江医学》2021年第12期
【摘要】目的探讨Thermotron Model CDS-5染色体分散仪在外周血染色体制备中的应用。

方法使用染色体分散仪控制染色体滴片时的环境温度及湿度，在不同温度/湿度组合下制备染色体并对制备成功率、分散效果进行分析。

同时与传统滴片法制备染色体的成功率、分散效果进行比较。

结果在一定温度和相对湿度范围内，升高温度和湿度可以提高染色体的制备成功率和分散效果。

超过温度和湿度阈值时，染色体制备成功率、分散效果反而下降。

将Thermotron Model CDS-5染色体分散仪温度设为25℃，湿度设为55%时，染色体分散效果最好。

染色体制备成功率、分散效果优于传统滴片法（P
结论 Thermotron Model CDS-5染色体分散仪在最佳温度/湿度组合下可制备出优质的染色体，提高染色体核型分析的准确性，值得向各实验室推广。

【关键词】染色体分散仪; 染色体; 制备成功率;分散效果
中图分类号：R440 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.12.008
【Abstract】 Objective To investigate the application of Thermotron Model CDS-5 chromosome disperser in the preparation of chromosomes in peripheral blood.
Methods Chromosome dispersing apparatus was used to control the ambient temperature and humidity of chromosome drops. Chromosomes were prepared under different temperature/humidity combinations， and the success rate of preparation and dispersion effect were analyzed.At the same
time， the success rate and dispersion effect of chromosome preparation were compared with that with traditional dropping method.
Results In a certain range of temperature and relative humidity， increasing temperature and humidity could improve the success rate of chromosome preparation and dispersion quality.When the temperature and humidity threshold were exceeded， the success rate of chromosome preparation and the dispersion quality decreased.When the temperature of Thermotron Model CDS-5 chromosome disperser was set to 25℃ and humidity was set to 55%， the chromosome dispersion effect was the best. The success rate of chromosome preparation and the dispersion effect were better than than those of the traditional dropping method.
Conclusion Thermotron Model CDS-5 chromosome disperser can produce high quality chromosomes and improve the accuracy of chromosome karyotype analysis under the optimal combination of temperature and humidity.It is worth popularizing to various laboratories.
【Key words】 chromosome disperser; chromosome; preparation success rate; dispersion effect
随着高通量测序技术在染色体病检测中的应用与推广，检测范围进一步扩大，检测成本大幅下降，在临床应用中被越来越多的医务工作者和患者所接受[1]。

但是，染色体核型分析依然是染色体病诊断的金标准[2]。

在染色体核型分析工作中，高质量的染色体是核型分析准确性的重要保证。

理想的染色体核型应该是分散均匀、很少或无相互交叠、分辨率高、带纹清晰的。

由于染色体的制备过程复杂，标本制备的质量与多种因素有关，包括培养基的质量、低渗过程中吹打的力度、低渗时间、固定液中甲醇和冰醋酸的比例、滴片的方式、滴片环境中的温湿度、气流的控制等等[3～6]。

早在1996年SPURBECK等[7]就提出了染色体分散动力学这一概念，为染色体的分散问题与研究提供了理论基础。

在此基础上有学者[8]提出滴片环境的温度和湿度是最重要的影响因素。

为此，基于染色体分散动力学原理设计出的染色体分散仪，通过仪器控制滴片环境的温度、湿度，进而控制载玻片表面固定液的挥发速度，影响染色体的分散效果。

本实验室利用新购买的Thermotron Model CDS-5染色体分散仪进行滴片环境温度、湿度的控制，进行适当的技術改良，获得良好的制片效果，现作如下介绍。

1 材料与方法
1.1 材料
410份血液标本来自梧州市工人医院生殖中心门诊就诊的患者的外周静脉血。

1.2 实验设备与耗材
Model CDS-5分散仪购自美国Thermotron， Axio Imager Zeiss & Meta systems全自动扫描染色体图像分析系统购自德国美达思软件和硬件技术有限公司，CO2培养箱购自赛默飞世尔科
技（中国）有限公司，滴片用免洗载玻片购自上海乐辰生物技术有限公司，淋巴细胞培养基、秋水仙素、吉姆萨染液购自广州达晖生物技术有限公司，氯化钾购自广东西陇科学股份有限公司，甲醇，冰醋酸购自四川西陇科学有限公司，胰蛋白酶购自GIBCO。

1.3 方法
1.3.1 细胞悬液的制备
无菌采集静脉血0.4 mL并接种于外周血淋巴细胞培养基中，37℃培养箱内培养72 h，加入秋水仙素继续培养0.5 h。

收获细胞，经0.075 mol/L氯化钾低渗液低渗处理、甲醇与冰乙酸之比为3∶1配成的固定液预固定1次、正式固定2次后制成细胞悬液放置4℃冰箱过夜，第二天再固定一次后根据收获的细胞沉淀量配制成一定浓度的细胞悬液滴片。

1.3.2 滴片
Thermotron Model CDS-5分散仪温度范围为20～40℃，湿度范围为25%～75%。

设置20℃、25℃、30℃3个温度梯度，40%、45%、50%、55%、60%、65% 6个湿度梯度。

根据不同的温度/湿度组合，在分散仪内放入干的载玻片，于载玻片正上方1 cm向每张载玻片滴2滴细胞悬液，每个温度/湿度组合滴片2张，分散仪内自然晾干。

实验室常规滴片法参考医学细胞遗传学国家培训中心教材[9]。

1.3.3 消化显带及观察
胰酶消化，吉姆萨染色。

使用Axio Imager Zeiss & Meta systems全自动扫描染色体图像分析系统上机扫描，每个温度/湿度组合扫描2张玻片，每张玻片计算机系统自动选取排名前60的60幅核型图，每个组合选取120幅核型图供分析。

对不同温度/湿度组合，染色体制备成功率和染色体重叠交叉少于3条的分裂象个数占可供分析分裂象百分比进行分析。

取10份细胞悬液标本进行重复研究，最终结果取平均值，确定最佳温度/湿度组合。

1.3.4 染色体制备成功评定标准
日常工作中常用的評价染色体质量的指标包括有丝分裂指数、异常核型检出率、染色体制备成功率;每张片子上至少有5个可供分析的细胞分裂象即可认为成功，可供分析的分裂象占分裂象总数的百分比即为染色体制备成功率;有丝分裂指数、异常核型检出率等指标均以“可供分析的分裂象”为基础进行评定。

因此本研究取较直观获取的染色体制备成功率作为标准[10]。

随机选取200例应用染色体分散仪（最佳温度/湿度）改良滴片法滴片的日常标本作为实验组，200例传统滴片法滴片的日常标本作为对照组，每例选取一张玻片，取排名前60的核型图，每组12 000个核型图进行染色体制备成功率、染色体重叠交叉少于3条的分裂象个数占可供分析分裂象百分比统计比较。

1.4 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件统计分析，率的比较采用卡方检验，检验水准：α=0.05，双侧检验。

2 结果
2.1 不同温度/湿度组合下，染色体制备成功率
每个组合分别统计120个分裂象，染色体分裂象呈类圆形均匀分布，染色体交叉少，核型分辨率高，条带清晰，达320条带水平以上[11]。

在一定的温度和湿度阈值范围内，染色体制备成功率随着温度、湿度的上升而增高。

相对于温度而言，湿度对染色体制备成功率的影响更大。

但当超过一定的温湿度阈值时，染色体制备成功率呈下降趋势，镜下可见染色体条带缩短，形态模糊，交叉重叠。

本实验研究数据表明，外周血标本染色体滴片时，分散仪的温度设置为25℃，湿度为55%时，染色体制备成功率最高，达到74.17%。

制备成功率越高，则说明制备染色体的条件越好。

见图1。

2.2 不同温度/湿度组合下染色体重叠交叉少于3条的分裂象个数占可供分析分裂象百分比
每个组合分别统计120个分裂象，每个分裂象中染色体重叠交叉
2.3 基于分散仪的改良滴片法与常规滴片法的比较
显微镜下观察，基于分散仪的改良滴片法每张玻片上的核型分散均一，重复性好，获得的分裂象多呈圆形或椭圆形分散，染色体交叉少（图3）。

而常规滴片法获得的分裂象与前者相比，染色体分散的重复性较差;获得的分裂象染色体分散不足、交叉相对较多;或者分散过度，导致核型不完整（图4、5）。

基于染色体分散仪的实验组染色体制备成功率、染色体重叠交叉少于3条的分裂象个数占可供分析分裂象百分比与常规滴片法相比，差异均有统计学意义（P<0.001）。

见表1。

3 讨论
染色体核型分析是染色病诊断的金标准，在产前诊断、出生缺陷防控等领域广泛应用[12]。

理想的染色体核型应该是分散均匀、相互交叠少、分辨率高、带纹清晰的。

优质的染色体是核型分析的前提，直接关系到核型分析的准确性和病例分析的效率。

根据染色体分散动力学原理，中期染色体的分散质量受环境温度、湿度和气流等因素的影响，通过温度和湿度影响载玻片上固定液的挥发程度，进而影响染色体的分散程度。

固定液蒸发太快，染色体分散不开，固定液蒸发太慢，染色体卷曲成团，太过于分散。

湿度和温度的升高可以增加染色体分散程度，湿度是染色体分散的主要影响因素[7]。

本研究利用分散仪提供稳定的温度、湿度环境
进行滴片，在此基础上研究最佳的温度和湿度组合。

研究发现，随着相对湿度的上升，染色体的制备成功率、重叠交叉<3条的核型所占的比例也在不断升高，但是在超过55%湿度之后，染色体的制备成功率、分散效果呈下降趋势。

温度高，湿度低，固定液蒸发快，染色体还没来得及分散，玻片已被干燥，造成染色体重叠，此现象在30℃条件下表现尤为明显。

温度低，湿度高，固定液蒸发慢，染色体固缩、细小、不易显带，在65%湿度条件下表现明显。

相同湿度条件下，25℃比20℃具有更高的染色体的制备成功率及更好的分散效果。

尤其在温度25℃、55%湿度条件下染色体的制备成功率、分散效果达到最佳。

与韦世录等[13]基于ChromprepS4恒温系统对染色体展开面积进行直接测量研究的最佳温度30℃、55%湿度的结论及谢志威等[14]基于Maxchrome染色体分散仪对染色体展开面积研究认为温度25℃、50%湿度条件下最佳分散效果的结论存在一些差异。

我们分析认为一方面与仪器不同有关，我们的Thermotron Model CDS-5分散仪立体空间大，实验箱密闭，有可伸进手臂的操作孔，相对独立，滴片操作全程均在仪器内部预先设定好的参数下进行，室温和室内相对湿度对滴片干扰不大;而ChromprepS4恒温系统、Maxchrome染色体分散仪由于恒温系统与室内存在温度及湿度差，滴片时仪器抽屉打开，受室内温湿度干扰，仪器抽屉一开一关过程中，预设的温度与湿度可能有变化，导致以上结果存在差异。

另一方面，谢志威、韦世录二人通过对染色体分散面积进行直接测量评估分散效果，而本研究是从镜下对染色体制备条件、分散效果进行间接评价，可能受实验人员经验、对染色体优良的主观判断的影响更大。

分散面积大分散效果固然好，但是分散面积太大，也容易存在染色体丢失的情况。

因此在评价滴片分散效果时也应兼顾核型完整性和核型分析的准确性。

1 材料与方法
1.1 材料
410份血液标本来自梧州市工人医院生殖中心门诊就诊的患者的外周静脉血。

1.2 实验设备与耗材
Model CDS-5分散仪购自美国Thermotron， Axio Imager Zeiss & Meta systems全自动扫描染色体图像分析系统购自德国美达思软件和硬件技术有限公司，CO2培养箱购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，滴片用免洗载玻片购自上海乐辰生物技术有限公司，淋巴细胞培养基、秋水仙素、吉姆萨染液购自广州达晖生物技术有限公司，氯化钾购自广东西陇科学股份有限公司，甲醇，冰醋酸购自四川西陇科学有限公司，胰蛋白酶购自GIBCO。

1.3 方法
1.3.1 细胞悬液的制备
无菌采集静脉血0.4 mL并接种于外周血淋巴细胞培养基中，37℃培养箱内培养72 h，加入秋水仙素继续培养0.5 h。

收获细胞，经0.075 mol/L氯化钾低渗液低渗处理、甲醇与冰乙酸之比为3∶1配成的固定液预固定1次、正式固定2次后制成细胞悬液放置4℃冰箱过夜，第二天再固定一次后根据收获的细胞沉淀量配制成一定浓度的细胞悬液滴片。

1.3.2 滴片
Thermotron Model CDS-5分散仪温度范围为20～40℃，湿度范围为25%～75%。

设置20℃、25℃、30℃3个温度梯度，40%、45%、50%、55%、60%、65% 6个湿度梯度。

根据不同的温度/湿度组合，在分散仪内放入干的载玻片，于载玻片正上方1 cm向每张载玻片滴2滴细胞悬液，每个温度/湿度组合滴片2张，分散仪内自然晾干。

实验室常规滴片法参考医学细胞遗传学国家培训中心教材[9]。

1.3.3 消化显带及观察
胰酶消化，吉姆萨染色。

使用Axio Imager Zeiss & Meta systems全自动扫描染色体图像分析系统上机扫描，每个温度/湿度组合扫描2张玻片，每张玻片计算机系统自动选取排名前60的60幅核型图，每个组合选取120幅核型图供分析。

对不同温度/湿度组合，染色体制备成功率和染色体重叠交叉少于3条的分裂象个数占可供分析分裂象百分比进行分析。

取10份细胞悬液标本进行重复研究，最终结果取平均值，确定最佳温度/湿度组合。

1.3.4 染色体制备成功评定标准
日常工作中常用的评价染色体质量的指标包括有丝分裂指数、异常核型检出率、染色体制备成功率;每张片子上至少有5个可供分析的细胞分裂象即可认为成功，可供分析的分裂象占分裂象总数的百分比即为染色体制备成功率;有丝分裂指数、异常核型检出率等指标均以“可供分析的分裂象”为基础进行评定。

因此本研究取较直观获取的染色体制备成功率作为标准[10]。

随机选取200例应用染色体分散仪（最佳温度/湿度）改良滴片法滴片的日常标本作为实验组，200例传统滴片法滴片的日常标本作为对照组，每例选取一张玻片，取排名前60的核型图，每组12 000个核型图进行染色体制备成功率、染色体重叠交叉少于3条的分裂象个数占可供分析分裂象百分比统计比较。

1.4 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件统计分析，率的比较采用卡方检验，检验水准：α=0.05，双侧检验。

2 结果
2.1 不同温度/湿度组合下，染色体制备成功率
每个组合分别统计120个分裂象，染色体分裂象呈类圆形均匀分布，染色体交叉少，核型分辨率高，条带清晰，达320条带水平以上[11]。

在一定的温度和湿度阈值范围内，染色体制备成功率随着温度、湿度的上升而增高。

相对于温度而言，湿度对染色体制备成功率的影响更大。

但当超过一定的温湿度阈值时，染色体制备成功率呈下降趋势，镜下可见染色体条带缩短，形态模糊，交叉重叠。

本实验研究数据表明，外周血标本染色体滴片时，分散仪的温度设置为25℃，湿度为55%时，染色体制备成功率最高，达到74.17%。

制备成功率越高，则说明制备染色体的条件越好。

见图1。

2.2 不同温度/湿度组合下染色体重叠交叉少于3条的分裂象个数占可供分析分裂象百分比
每个组合分别统计120个分裂象，每个分裂象中染色体重叠交叉
2.3 基于分散仪的改良滴片法与常规滴片法的比较
显微镜下观察，基于分散仪的改良滴片法每张玻片上的核型分散均一，重复性好，获得的分裂象多呈圆形或椭圆形分散，染色体交叉少（图3）。

而常规滴片法获得的分裂象与前者相比，染色体分散的重复性较差;获得的分裂象染色体分散不足、交叉相对较多;或者分散过度，导致核型不完整（图4、5）。

基于染色体分散仪的实验组染色体制备成功率、染色体重叠交叉少于3条的分裂象个数占可供分析分裂象百分比与常规滴片法相比，差异均有统计学意义（P<0.001）。

见表1。

3 讨论
染色体核型分析是染色病诊断的金标准，在产前诊断、出生缺陷防控等领域广泛应用[12]。

理想的染色体核型应该是分散均匀、相互交叠少、分辨率高、带纹清晰的。

优质的染色体是核型分析的前提，直接关系到核型分析的准确性和病例分析的效率。

根据染色体分散动力学原理，中期染色体的分散质量受环境温度、湿度和气流等因素的影响，通过温度和湿度影响载玻片上固定液的挥发程度，进而影响染色体的分散程度。

固定液蒸发太快，染色体分散不开，固定液蒸发太慢，染色体卷曲成团，太过于分散。

湿度和温度的升高可以增加染色体分散程度，湿度是染色体分散的主要影响因素[7]。

本研究利用分散仪提供稳定的温度、湿度环境进行滴片，在此基础上研究最佳的温度和湿度组合。

研究发现，随着相对湿度的上升，染色体的制备成功率、重叠交叉<3条的核型所占的比例也在不断升高，但是在超过55%湿度之后，染色体的制备成功率、分散效果呈下降趋势。

温度高，湿度低，固定液蒸发快，染色体还没来得及分散，玻片已被干燥，造成染色体重叠，此现象在30℃条件下表现尤为明显。

温度低，湿度高，固定液蒸发慢，染色体固缩、细小、不易显带，在65%湿度条件下表现明显。

相同湿度条件下，25℃比20℃具有更高的染色体的制备成功率及更好的分散效果。

尤其在温度25℃、55%湿度条件下染色体的制备成功率、分散效果达到最佳。

与韦世录等[13]基于
ChromprepS4恒温系统对染色体展开面积进行直接测量研究的最佳温度30℃、55%湿度的结论及谢志威等[14]基于Maxchrome染色体分散仪对染色体展开面积研究认为温度25℃、50%湿度条件下最佳分散效果的结论存在一些差异。

我们分析认为一方面与仪器不同有关，我们的Thermotron Model CDS-5分散仪立体空间大，实验箱密闭，有可伸进手臂的操作孔，相对独立，滴片操作全程均在仪器内部预先设定好的参数下进行，室温和室内相对湿度对滴片干扰不大;而ChromprepS4恒温系统、Maxchrome染色体分散仪由于恒温系统与室内存在温度及湿度差，滴片时仪器抽屉打开，受室内温湿度干扰，仪器抽屉一开一关过程中，预设的温度与湿度可能有变化，导致以上结果存在差异。

另一方面，谢志威、韦世录二人通过对染色体分散面积进行直接测量评估分散效果，而本研究是从镜下对染色体制备条件、分散效果进行间接评价，可能受实验人员经验、对染色体优良的主观判断的影响更大。

分散面积大分散效果固然好，但是分散面积太大，也容易存在染色体丢失的情况。

因此在评价滴片分散效果时也应兼顾核型完整性和核型分析的准确性。