实验六：薄层层析与柱层析
柱层析的分离原理和分离步骤
柱层析的分离原理和分离步骤：
柱层析是一种广泛应用于化学和生物学领域中的分离技术，其基本原理是利用混合物中各组分物理化学性质的差异，如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等，使各组分在固定相和流动相之间进行不同的分配和移动速度，从而达到分离的目的。
在柱层析中，固定相通常是由不溶性基质形成，如硅胶、大孔吸附树脂、聚酰胺等，而流动相则是由溶剂组成。
样品被加到柱子上后，用流动相洗脱，在洗脱过程中，样品中的各组分根据其在固定相和流动相中的分配系数不同，经历多次反复的吸附、解吸、再吸附、再解吸过程，最终实现分离。
柱层析的操作方式主要包括常压分离、减压分离和加压分离，其中，常压分离是最简单的分离模式，适用于大于50-100g的产品，但洗脱时间较长；减压分离可以节省填料的使用量，但由于大量的空气通过填料会使溶剂挥发，且有时易分解的化合物难以得到；加压分离可以加快淋洗剂的流动速度，缩短样品的洗脱时间。
薄层色谱层析操作规程
薄层色谱层析操作规程1. 引言薄层色谱（TLC）是一种常用的分离和分析技术，适用于有机物和天然产物的检测、纯化和鉴定。
本操作规程旨在提供一种标准化的TLC操作步骤，以确保结果的准确性和可重复性。
2. 实验材料和仪器设备•薄层色谱板：选择合适的固定相和基底材料的薄层色谱板。
•检测溶剂：根据需要选择合适的溶剂，常用的有乙醚、醋酸乙酯、甲醇、正己烷等。
•样品：准备待测物的溶液或提取液。
•试剂：例如显色剂、定位剂等。
•色谱槽：用于放置色谱板的槽状容器。
•喷雾开发箱：用于显色和可视化样品。
3. 操作步骤3.1 准备工作1.检查薄层色谱板是否完整，如有损坏需更换。
2.在色谱板上使用铅笔标记出样品和参比物的位置。
3.2 样品处理1.准备待测物的溶液或提取液，并将其过滤以去除杂质。
2.如需测定混合物中的成分，可先进行分离提取。
3.3 上样1.使用微量锥或玻璃管在标记位置上均匀地涂抹样品。
2.上样后务必避免接触色谱板其他区域。
3.4 开发1.将色谱板放置在色谱槽中，加入适当的检测溶剂。
注意溶剂的选择应根据待测物的性质和溶解性来确定。
2.等待溶剂上升至足够高度，将色谱板取出并迅速标记并扫描涂点位置。
3.5 显色和观察1.将色谱板放入喷雾开发箱中，并加入适当的显色剂。
2.等待显色剂完全插入后，将色谱板取出并进行观察。
3.6 数据处理1.使用适当的测量工具，如图像分析软件，测量色谱带的迁移距离和Rf值。
2.进行定性和定量分析，根据需要绘制色谱图。
4. 安全注意事项1.使用化学品和有机溶剂时必须戴上防护手套和防护眼镜，以防止溅入眼睛或与皮肤接触。
2.所有操作需在通风良好的实验室中进行，避免吸入有害气体。
3.注意操作时避免产生火源，如禁止吸烟和使用明火。
4.做好废弃物的处理工作，避免对环境造成污染。
5. 结论本操作规程提供了一套标准化的薄层色谱层析操作步骤，涵盖了样品准备、上样、开发、显色和观察、数据处理等关键步骤。
通过遵守操作规程和安全注意事项，可以准确、高效地进行薄层色谱层析实验，并获得可靠的结果。
柱层析和薄层层析实验报告
柱层析和薄层层析实验报告篇一：柱层析实验报告柱层析分离色素一、【实验目的】1．了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。
2．熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。
二、【实验原理】叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。
利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇或无水乙醇提取。
分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。
柱层析法是色谱法中的一种，它是根据混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分离。
常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。
吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面积很大，经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶），当混合物的溶液流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。
由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速度下移，形成色带。
继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。
用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。
本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。
由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行洗脱，从而达到叶绿体主要的4种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。
三、【实验材料】原料：新鲜的菠菜叶试剂：1．无水乙醇或95%乙醇 5.三氧化二铝2．石英砂6．饱和氯化钠溶液3．丙酮7.水硫酸钠4．石油醚（60-90℃）8洗脱液：丙酮：石油醚＝1：9 器材：层析柱（1×30cm），研钵，蒸馏装置，脱脂棉，天平，烧杯，过滤漏斗，玻璃棒，锥形瓶，分液漏斗，试管，铁架台四、【实验操作】1．色素的提取：20克菠菜，加少许石英砂，再加20毫升无水乙醇研磨成浆，脱脂棉过滤，保存滤液，滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤渣再加入30毫升石油醚提取一次，过滤，合并滤液，转移至分液漏斗中,再加入40毫升饱和氯化钠溶液震荡，弃去下层溶液，再分别加入20毫升水震荡洗涤几次，直至下层无色，保留上层溶液，转移至三角瓶中，加入无水硫酸钠干燥5分钟，备用.2．样品的浓缩：将提取液放入蒸馏烧瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩余液体5-8毫升左右，以备加样使用。
实验柱层析和薄层层析
实验柱层析和薄层层析层析法是通过分离混合物组分的一种方法，主要有柱层析和薄层层析两种。
本文将介绍它们的原理、步骤和应用。
实验柱层析原理实验柱层析是一种液相色谱分离技术，基于混合物组分在固定相和流动相之间相互分配的差异进行分离。
实验柱层析一般采用正交试验法，即通过改变柱填料、流动相、流速和溶质质量浓度等参数，以缩小响应面，得到最佳分离条件。
步骤1.选择合适的柱径和柱高，并选用合适的柱填料。
2.准备流动相，并过滤除杂质。
将柱填料与流动相充分浸泡，使柱填料达到平衡状态。
3.将混合物加到柱顶，并开始淋洗。
此时各组分在流动相和固定相之间交替分配，被固定相吸附或溶解，同时前进，终于分离。
4.根据检测结果，确定样品组分并计算出分离效果和纯度。
应用实验柱层析作为一种分离技术，广泛应用于医药、化学、生物学等领域。
常见的应用包括：1.分离蛋白质、核苷酸等生物大分子。
2.对化合物进行分离、纯化和定量分析。
3.分离和提取天然产物和药物。
薄层层析原理薄层层析是一种比较简单、快速的分离方法，其原理与柱层析类似，只是采用了薄层硅胶或氧化铝等作为固定相，可直接对液态和固态样品进行分离。
步骤1.准备薄层柱。
2.准备固定相毛细管与混合样品。
3.在薄层柱上涂上一层液态固定相，然后将其晾干。
4.将样品分别点于薄层柱的一端，放入发展槽中，加入足量发展剂。
5.等到液面距离薄层柱顶端约0.5cm时取出，划线，停发展，晾干。
6.在笼罩于发展剂蒸汽中的小钵中烘干至静止。
应用薄层层析作为快速分离、纯化和检测生物和化学样品的一种常用手段，其应用包括：1.对合成的物质进行纯化和分离。
2.植物药的含量测定。
3.对复杂化学物质进行溶剂系统选择和定性分析。
实验柱层析和薄层层析都是常见的层析法，虽然原理类似但有各自的优缺点和应用场景。
在实际应用中，需要根据具体的分离任务选择合适的方法。
薄层色谱和柱色谱分离法
Rf = 溶质的最高浓度中心至原点中心的距离/溶剂前沿至原点中心的距离
薄层层析可适用小量样品（几到几十微克甚至0.01μg）的分离：也可用于多达５００mg样 品的分离，是近代有机化学中用于定性，定量的一种重要手段。
三、 仪器及试剂
硅胶薄板、展开缸、苏丹红乙醇溶液、间硝基苯胺乙醇溶液、苏丹红间硝基苯胺混合溶液、 乙酸乙酯：石油醚（5:95）
薄层色谱和柱色谱分离法
一、 实验目的
１．了解色谱分离的原理及其应用。
2．初步掌握薄层色谱和柱色谱的操作技能。
二、 实验原理
色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（即分配）的不同， 使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组份分开。 流动的液体称为流动相，流动相可以是气体，也可以是液体；固定不动的物质称为固定相，可 以是固体也可以是液体（需吸附在支持剂上）。根据组分在固定相中的作用不同，分为吸附色 谱、分配色谱、离子交换色谱等。按操作条件可分为柱色谱、薄层色谱、纸色谱、气相色谱和 液相色谱等。层析缸ຫໍສະໝຸດ 层析板 试样点展开剂
展开版
四、 操作要点和说明
１． 铺板 本实验直接使用购买的薄层硅胶板，每人一块
２． 点样 用毛细管点样，样点距玻璃板１cm，样点直径不超过２mm，三个样点间距５-６mm。
３． 展开 薄层色谱的展开，需要在展开缸中进行如图。展开方式采用倾斜上行法。
４． 计算Rf值 准确地找出原点，溶剂前沿以及三个样品展开后斑点的中心，分别测量溶剂前沿和样点 在薄层板上移动的距离（如图），求出其Ｒf值。
柱色谱是利用各组分在固定相上的吸附能力和流动相的解析能力不同，使混合物随流动相 流过固定相，发生反复多次的吸附和解析过程，从而使混合物各组分分离开。所用仪器为色谱 柱。纸色谱、气相色谱和液相色谱看教材。
薄层色谱与柱层析
叶绿素 叶绿素
叶黄素'， " 叶黄素
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色谱法的分类(fēn lèi)
1)根据流动相分类: 气相色谱—以气体作流动相 液相色谱—以液体作流动相 超临界色谱—流动相是在接近它的临界温度
和压力下工作(gōngzuò)的液体 2)根据固定相的附着方式分类 —固定相装在圆柱管中—柱色谱 —固定相涂敷在玻璃或金属板上—薄层色谱 —液体固定相涂在纸上—纸色谱
反相分配色谱：以亲脂性有机溶剂作固定(gùdìng)（液 ）相，以水或亲水性溶剂作移动相的分配色谱称为 反相分配色谱。当分离脂溶性或极性较小的成分， 如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等物质时，常用反 相分配色谱。实践中有70%以上的分配色谱都采用 反相色谱。
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分配柱色谱的应用 分配柱色谱往往适用于分离水溶性或极性较大的组分，如生物
。
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Rf值测量(cèliáng)示意图
Rf与组分性质 (xìngzhì)、流动相 及溶解度有关 极性组分→易保留 ，Rf 小 非极性组分→易流 出, Rf大
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薄层固定相
按照固定相的种类，薄层板可分为正相薄层板（如 硅胶薄层板、聚酰胺薄层板）、反相薄层板（如 C18键合相薄层板）等。
） Rf值＋斑点颜色特征（原位化学反应） 多种展开剂体系展开进行验证 与其他技术联用
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展 开 (z hǎ n kā i) 后 的 薄 层 板
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（二）定 量
目视比较法
将不同量的标准品作为系列，同样样品分 别点在同一薄层上展开，显色后，目测比较斑点颜色的 深浅和面积大小，求出未知物含量的近似值，作为半定 量法，精密度为±10%。
实验六：薄层层析与柱层析
实验六薄层层析及柱层析实验目的1.了解偶氮苯的光学异构反应，加深对光化学反应的理解。
2.掌握薄层层析的基本操作,薄层层析分离顺、反式偶氮苯。
3.了解柱层析分离有机化合物的原理，初步掌握层析柱装填和洗脱的操作方法4.采用柱层析分离反式偶氮苯及靛红的混合物实验原理偶氮苯是最简单的芳香偶氮化合物，众多偶氮染料的母体结构。
含有两个苯基分别及偶氮基–N=N–两端相连的结构。
偶氮苯有毒，易燃。
偶氮苯有顺（Z）-反（E）-异构体。
反式为橙红色棱形晶体，蒸气为深红色，溶于乙醇、乙醚、醋酸和水。
反式的热力学性质稳定。
当溶于乙醇的偶氮苯用一定强度的紫外光照射时，顺式的比例逐渐增大，直至达到平衡，形成顺反异构体的混合物。
偶氮苯的光致异构是很多偶氮类功能材料光响应的基础。
顺式为橙红色片状晶体，不稳定，在加热或可见光照射下能够变成反式。
色谱方法是通过在固定相和流动相间分配的不同而将物质分离开。
待分离混合物各组分在固定相上的吸附强度不同，及流动相一起移动的速度也不同，因此被分离开。
薄层色谱属于固-液吸附色谱。
薄层色谱板中的固定相中的微孔结构使得溶剂在毛细管作用下能够沿着色谱板向上移动。
由于混合物中各组分对吸附剂（固定相）的吸附能力不同，当展开剂（流动相）流经吸附剂时发生无数次吸附解附过程，吸附力弱的组分随流动相迅速向前移动，吸附力强的组分滞留在后，由于各组分具有不同的移动速度，最终在固定相薄层析上分离。
TLC除了用于分离外，还可以通过及已知结构的的化合物比对，鉴定少量有机混合物的组成，它也是柱色谱寻求最佳展开剂的手段。
上图中红色化合物的R f等于竖直红线的长度除以竖直蓝线的长度。
柱层析也属于固-液吸附色谱。
在一根玻璃“分离柱”中进行。
管中装上适当的粉末作为国定相。
待分离或纯化物质的溶液（流动相）在重力作用下流经吸附剂时，不同物质对溶剂和吸附剂的亲和力不同，因而被吸附的程度不同，从而以不同速度流动，使化合物得以分离。
靛红及偶氮苯在极性上具有较大差异，从而可以使用极性适中的展开剂，通过柱层析将二者分离。
柱层析实验报告
柱层析分离色素一、【实验目的】1．了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。
2．熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。
二、【实验原理】叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。
利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇或无水乙醇提取。
分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。
柱层析法是色谱法中的一种，它是根据混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分离。
常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。
吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面积很大，经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶），当混合物的溶液流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。
由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速度下移，形成色带。
继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。
用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。
本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。
由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行洗脱，从而达到叶绿体主要的4种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。
三、【实验材料】原料：新鲜的菠菜叶试剂：1．无水乙醇或95%乙醇 5.三氧化二铝2．石英砂 6．饱和氯化钠溶液3．丙酮 7.水硫酸钠4．石油醚（60-90℃） 8洗脱液：丙酮：石油醚＝1：9 器材：层析柱（1×30cm），研钵，蒸馏装置，脱脂棉，天平，烧杯，过滤漏斗，玻璃棒，锥形瓶，分液漏斗，试管，铁架台四、【实验操作】1．色素的提取：20克菠菜，加少许石英砂，再加20毫升无水乙醇研磨成浆，脱脂棉过滤，保存滤液，滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤渣再加入30毫升石油醚提取一次，过滤，合并滤液，转移至分液漏斗中,再加入40毫升饱和氯化钠溶液震荡，弃去下层溶液，再分别加入20毫升水震荡洗涤几次，直至下层无色，保留上层溶液，转移至三角瓶中，加入无水硫酸钠干燥5分钟，备用. 2．样品的浓缩：将提取液放入蒸馏烧瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩余液体5-8毫升左右，以备加样使用。
中药分离的实验报告
一、实验目的1. 掌握中药分离的基本原理和方法。
2. 学习使用中药分离的常用设备和技术。
3. 通过实验，提高对中药有效成分的认识和提取能力。
二、实验原理中药分离是指将中药中的有效成分从药材中提取出来，以便于进一步的研究和应用。
常用的中药分离方法有：溶剂萃取、柱层析、薄层层析等。
本实验主要采用溶剂萃取和柱层析方法对中药中的有效成分进行分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 药材：丹参、川芎、当归等- 溶剂：甲醇、乙醇、水等- 非极性溶剂：石油醚、乙酸乙酯等- 极性溶剂：正己烷、氯仿等2. 实验仪器：- 超声波清洗器- 柱层析柱- 薄层层析板- 漏斗- 烧杯- 玻璃棒- 烧瓶- 移液管- 蒸发皿- 酒精灯- 铁架台四、实验步骤1. 溶剂萃取：（1）将药材粉碎成粗粉，过筛。
（2）取药材粗粉50g，加入100ml甲醇，超声提取30分钟。
（3）将提取液过滤，滤液置于蒸发皿中，低温蒸发至干，得浸膏。
2. 柱层析：（1）取10g氧化铝，加入少量水，搅拌，制成氧化铝柱。
（2）将浸膏溶于适量石油醚中，缓慢加入氧化铝柱中。
（3）用不同极性的溶剂（如乙酸乙酯、甲醇等）进行梯度洗脱。
（4）收集不同极性的洗脱液，分别进行蒸发、浓缩，得不同极性的化合物。
3. 薄层层析：（1）取少量不同极性的化合物，点于薄层层析板上。
（2）将薄层层析板置于展开剂中，上行展开。
（3）取出薄层层析板，晾干，观察化合物在薄层板上的展开情况。
五、实验结果与分析通过溶剂萃取和柱层析，成功分离出丹参、川芎、当归等药材中的有效成分。
薄层层析结果显示，不同极性的化合物在薄层板上有明显的展开，说明分离效果良好。
六、实验总结1. 本实验通过溶剂萃取和柱层析方法，成功分离出中药中的有效成分。
2. 在实验过程中，要注意操作规范，确保实验结果的准确性。
3. 中药分离技术在中药研究、开发和应用中具有重要意义，值得进一步研究和推广。
七、注意事项1. 在实验过程中，要注意安全，避免发生意外。
柱色谱和薄层色谱分离技术
样品的收集
用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸 附比较强的话，就不容易流出。这样就会发生，后面的点先出，而前面的点后出。这时可 以采用氧化铝作固定相。另外，收集的试管大小要以样品量而定，特别是小量样品，如果 用大试管，可能一根就收到了三个样品， 如果都用小试管那工作量又太大。
减压柱层析在进行溶剂洗脱时是将溶剂在真空下全部抽出,使固定相“干”后才加入新的 洗脱剂作下一组分的收集.其原理相当于薄层层析的多次展开,它的分离效果可与薄层层析 媲美。
加压实例就不一一详举了，下面几个是最好。柱子长了，相应的塔板数就高。 柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较 薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样 品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶 剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易 得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂 了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保 的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。现在见到的柱 子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具 体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所 需组分rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用 小柱子（例如200毫克的样品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不 到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的， 也可以减小淋洗剂的极性等等。
薄层色谱（TCL） 柱色谱
TLC的作用 •跟踪反应进程 •为柱层析选择适当的淋洗剂
a/l或b/l
=0.2~0.3
选择适当的展开剂是首要任务.。一般常用溶剂按照极性 从小到大的顺序排列大概石油迷<己烷<苯<乙醚 <THF<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇使用单一溶剂，往 往不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂通常使 用一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，高极性的 溶剂还有增加区分度的作用，常用的溶剂组合有： Petroleum ether/Ethyl acetate, Petroleum ether/Ac etone, Petroleum ether/Ether, Petroleum ether/CH 2Cl2, CH2Cl2/ethyl acetate, ethyl acetate/ MeOH, CHCl3/ ethyl acetate
薄层色谱(实验ppt)
思考题
1．为什么极性大的组分要用极性较大的溶剂洗脱？根据本次
实验，在展开剂（四氯化碳：氯仿=7：3）比例条件下进行 偶氮苯和对-二甲氨基偶氮苯薄层色谱时，若增加展开剂中四 氯化碳的量，你认为二者的Rf值将有何变化？为什么?
2．如何利用Rf值来鉴定化合物？
4．显色 (1) 紫外灯照射法 (2) 碘蒸气法： (3) 碳化法： (4) 专属显色剂显色法：
5．Rf值的计算
仪器和试剂
载玻片，烘箱，烧杯，点样毛细管，层析缸，铅笔
硅胶G，1%偶氮苯对照品溶液，0.01%对-二甲氨基偶氮苯对照品溶液， 偶氮苯和对-二甲氨基偶氮苯样品溶液
展开剂（四氯化碳：氯仿=7：3）
实验六 薄层色谱
实验目的
1．薄层层析的操作技术。 2．了解色谱法分离提纯有机化合物的基本原理和应用。
实验原理
色谱法（Chromatography）亦称色层法、层析法等。 色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。 色谱法的基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸 附或溶解性能（分配）的不同，或其亲和性的差异，使混
薄层色谱的操作步骤
1．薄层板的制备 使表面均匀光滑且厚度为0.2mm～1mm， 在110℃下活化30min，冷后，备用。 2．点样 每个斑点直径不超过0.3cm，间距为1cm～1.5cm为宜。 3．展开 注意：点样斑点必须保持在展开剂液面之上。展开剂升到距离顶 端1cm～1.5cm）或各组分已分开时，取出，标出前沿位置。
合物的溶液流经该种物质进行反复的吸附或分配作用，从
而使各组分分离。
薄层色谱法属固-液吸附色谱. 在有机化学中的主要用途为： 1．确证两个化合物是否相同； 2．测定混合物中组分数目； 3．监控合成反应的进程； 4．监控柱层析分离的有效程度。 薄层色谱可用于定性分析外，还可与比色法相配合起来作定量分析。
蛋白质纯化实验步骤
蛋白质纯化实验步骤引言:蛋白质是生物体内重要的基本组成部分，对于深入了解蛋白质的结构和功能具有重要意义。
蛋白质纯化是一个关键步骤，可以从复杂的混合物中分离出目标蛋白质，并去除杂质。
下面将介绍一种常用的蛋白质纯化实验步骤。
一、样品制备在开始蛋白质纯化实验之前，首先需要准备样品。
样品可以是细胞提取物、培养基中的蛋白质等。
样品制备的关键是要保证样品的完整性和纯度，避免蛋白质的降解和杂质的污染。
二、离心将样品进行离心，以去除细胞碎片和细胞核等大颗粒物质。
离心过程中，可以根据颗粒物质的大小和密度来选择合适的离心条件，如转速、离心时间等。
三、初步分离将离心后的上清液取出，进行初步分离。
可以采用一些常用的分离技术，如离子交换色谱、凝胶过滤等。
这些技术可以根据蛋白质的电荷、大小等特性进行分离，从而使目标蛋白质得到部分纯化。
四、亲和层析亲和层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过利用目标蛋白质与某种亲和剂之间的特异性相互作用来实现纯化。
亲和剂可以是金属离子、抗体、配体等，可以根据目标蛋白质的性质和特点来选择合适的亲和剂。
五、凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术，通过电场作用使蛋白质在凝胶中迁移，根据蛋白质的大小和电荷来实现分离。
凝胶电泳可以用于检测和鉴定目标蛋白质，同时也可以用于纯化蛋白质。
六、柱层析柱层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过将样品溶液通过填充在柱子中的吸附剂层析，实现蛋白质的分离和纯化。
柱层析可以根据蛋白质的性质和特点来选择合适的吸附剂，如离子交换柱、凝胶过滤柱等。
七、透析透析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过溶液之间的渗透压差来实现目标蛋白质的分离和杂质的去除。
透析可以用于去除一些小分子杂质，如盐类、小分子药物等。
八、浓缩浓缩是一种常用的蛋白质纯化技术，通过去除大量的水分来提高目标蛋白质的浓度。
常用的浓缩技术有深度过滤、超滤等，可以根据蛋白质的分子量和颗粒大小来选择合适的浓缩方法。
九、纯化验证在蛋白质纯化实验结束之后，需要对纯化后的目标蛋白质进行验证。
柱 层 析、薄 层 层 析
柱色谱、薄层色谱一、实验目的1、了解色谱法分离提纯有机化合物的基本原理和应用。
2、掌握柱层析、薄层层析的操作技术。
二、实验原理色谱法（Chromatography）亦称色层法、层析法等。
色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。
色谱法的基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（分配）的不同，或其亲和性的差异，使混合物的溶液流经该种物质进行反复的吸附或分配作用，从而使各组分分离。
色谱法在有机化学中的应用主要包括以下几方面:1、分离混合物一些结构类似、理化性质也相似的化合物组成的混合物，一般应用化学方法分离很困难，但应用色谱法分离，有时可得到满意的结果。
2、精制提纯化合物有机化合物中含有少量结构类似的杂质，不易除去，可利用色谱法分离以除去杂质，得到纯品。
3、鉴定化合物在条件完全一致的情况，纯粹的化合物在薄层色谱或纸色谱中都呈现一定的移动距离，称比移值（Rf值），所以利用色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。
但影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂颗粒的大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、挥发性等。
所以，要获得重现的比移值就比较困难。
为此，在测定某一试样时，最好用已知样品进行对照。
4、观察一些化学反应是否完成，可以利用薄层色谱或纸色谱观察原料色点的逐步消失，以证明反应完成与否。
吸附色谱主要是以氧化铝、硅胶等为吸附剂，将一些物质自溶液中吸附到它的表面上，而后用溶剂洗脱或展开，利用不同化合物受到吸附剂的不同吸附作用，和它们在溶剂中不同的溶解度，也就是利用不同化合物在吸附剂上和溶液之间分布情况的不同而得到分离。
吸附色谱分离可采用柱色谱和薄层色谱两种方式。
柱色谱常用的有吸附色谱和分配色谱两种。
吸附色谱常用氧化铝和硅胶为吸附剂。
分配色谱以硅胶、硅藻土和纤维素为支持剂，以吸收较大量的液体作为固定相。
柱色谱常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。
最全的TLC经验_薄层层析_显色剂
最全的TLC经验薄层色谱(TLC)是一种非常有用的跟踪反应的手段,还可以用于柱色谱分离中合适溶剂的选择。
薄层色谱常用的固定相有氧化铝或硅胶,它们是极性很大(标准)或者是非极性的(反相)。
流动相则是一种极性待选的溶剂。
在5.301中以及大多数实验室实验中,都将使用标准硅胶板。
将溶液中的反应混合物点在薄板上,然后利用毛细作用使溶剂(或混合溶剂)沿板向上移动进行展开。
根据混合物中组分的极性,不同化合物将会在薄板上移动不同的距离。
极性强的化合物会“粘”在极性的硅胶上,在薄板上移动的距离比较短。
而非极性的物质将会在流动的溶剂相中保留较长的时间从而在板上移动较大的距离。
化合物移动的距离大小用Rf值来表达。
这是一个位于0~1之间的数值,它的定义为:化合物距离基线(最先点样时已经确定)的距离除以溶剂的前锋距离基线的距离。
薄层色谱(TLC)实验步骤:1) 切割薄板。
通常,买来的硅胶板都是方形的玻璃板,必需用钻石头玻璃刀按照模板的形状进行切割。
在切割玻璃之前,用尺子和铅笔在薄板的硅胶面上轻轻地标出基线的位置(注意不要损坏硅胶面)。
借助锋利的玻璃切割刀和一把引导尺,你便可方便地进行玻璃切割。
当整块玻璃被切割后,你就可以进一步将其分成若干独立的小块了。
(开始的时候,也许你会感到有一些难度,但经过一些训练以后,你便会熟练地掌握该项技术。
)2) 选取合适的溶剂体系。
化合物在薄板上移动距离的多少取决于所选取的溶剂不同。
在戊烷和己烷等非极性溶剂中,大多数极性物质不会移动,但是非极性化合物会在薄板上移动一定距离。
相反,极性溶剂通常会将非极性的化合物推到溶剂的前段而将极性化合物推离基线。
一个好的溶剂体系应该使混合物中所有的化合物都离开基线,但并不使所有化合物都到达溶剂前端,Rf值最好在0.15~0.85之间。
虽然这个条件不一定都能满足,但这应该作为薄层色谱分析的目标(在柱色谱中,合适的溶剂应该满足Rf在0.2~0.3之间)。
那么,应该选取哪些溶剂呢?一些标准溶剂和他们的相对极性(从LLP中摘录)列于如下:强极性溶剂:甲醇〉乙醇〉异丙醇中等极性溶剂:乙氰〉乙酸乙酯〉氯仿〉二氯甲烷〉乙醚〉甲苯非极性溶剂:环己烷,石油醚,己烷,戊烷常用混合溶剂:乙酸乙酯/己烷:常用浓度0~30%。
层析技术实验报告
一、实验目的1. 了解层析技术的原理和方法。
2. 学习并掌握薄层层析和凝胶过滤层析两种层析技术的操作步骤。
3. 通过实验，分离和鉴定混合物中的不同组分。
二、实验原理层析技术是一种基于物质在固定相和流动相之间分配系数的差异，使混合物中的各组分分离的方法。
本实验采用薄层层析和凝胶过滤层析两种技术进行分离。
1. 薄层层析（TLC）：利用样品中各组分在固定相（薄层板）和流动相（溶剂）中的吸附或溶解性能差异，使各组分在薄层板上分离。
2. 凝胶过滤层析：利用凝胶介质中的孔径梯度，只允许小分子通过，而大分子被阻拦，从而实现不同大小分子的分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：混合物、硅胶薄层板、氧化铝薄层板、凝胶柱、凝胶片、溶剂、显色剂等。
2. 实验仪器：薄层层析仪、凝胶过滤层析仪、显微镜、电子天平等。
四、实验步骤1. 薄层层析分离实验（1）制备薄层板：将硅胶或氧化铝均匀涂布在玻璃板上，晾干后切成小块。
（2）点样：用微量移液器吸取混合物，点在薄层板上，点样原点尽量小而圆，直径不超过2mm。
（3）展开：将点样后的薄层板放入装有溶剂的层析缸中，使溶剂前沿距离薄层板边缘约2cm，盖上盖子，待溶剂前沿到达预定位置时取出薄层板。
（4）显色：将分离后的薄层板放入显色剂中，观察各组分在薄层板上的位置。
2. 凝胶过滤层析分离实验（1）准备凝胶柱：将凝胶柱固定在层析架上，用溶剂冲洗凝胶柱，使凝胶均匀填充柱内。
（2）上样：将混合物样品通过注射器注入凝胶柱中。
（3）洗脱：用溶剂洗脱凝胶柱，收集洗脱液。
（4）显色：将收集到的洗脱液进行显色，观察各组分在凝胶柱上的位置。
五、实验结果与分析1. 薄层层析分离实验通过观察薄层板上的分离结果，可以看出混合物中的各组分在薄层板上的位置，从而分离出不同组分。
2. 凝胶过滤层析分离实验通过观察凝胶柱上的分离结果，可以看出混合物中的不同大小分子在凝胶柱上的位置，从而分离出不同大小的分子。
六、实验结论1. 通过薄层层析和凝胶过滤层析两种技术，成功分离了混合物中的不同组分。
菠菜色素的提取及薄层色谱和柱色谱分离
菠菜色素的提取及薄层色谱和柱色谱分离一、实验目的1.通过对菠菜色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法；2.了解薄层色谱和柱色谱分离的基本原理，掌握柱色谱和薄层色谱分离的操作；3.通过柱色谱和薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。
二、实验原理1.菠菜叶中的叶绿体含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类天然色素。
这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。
2.柱色谱法又称为柱层析法，固定相装于柱内，流动相为液体，样品沿竖直方向由上而下移动而达到分离的色谱法。
本法主要用于分离，有时也起到浓缩富集作用。
柱色谱法分为吸附柱层析法和分配柱层析法，本实验仅介绍吸附柱层析法。
它是根据混合物中各组分的分子结构和性质（极性）来选择合适的吸附剂和洗脱剂，从而利用吸附剂对各组分吸附能力的不同及各组分在洗脱剂中的溶解性能不同达到分离目的。
3.薄层色谱法（TLC），是将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层。
待点样、展开后，根据比移值（R f）与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值（R f）作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。
薄层色谱法是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术。
三、仪器与试剂1.仪器: 布氏漏斗、抽滤瓶、研钵、分液漏斗、显微载玻片、毛细管、层析柱( 20×3cm )、分液漏斗、普通漏斗、玻璃棒、锥形瓶、胶头滴管、烧杯（250ml和50ml）、食品保鲜膜、橡皮筋2.试剂和原材料: 石油醚（60℃~90℃）、甲醇( AR )、无水乙醇( AR )、乙醇( AR ) 、乙酸乙酯(AR) 、丙酮（化学纯）、苯( AR )、无水硫酸钠( AR )、硅胶G60型（青岛海洋化工厂，薄层层析用）、中性氧化铝（150目~160目）、菠菜叶、脱脂棉。
四、实验步骤1.硅胶板的制备：硅胶液配制→铺板→干燥→活化（1）硅胶液配制：称取20g硅胶G60型在研钵中，加入约50ml 4%CMC溶液，用研棒不断搅拌，直至感到液体变得较粘稠状，且用研棒蘸取硅胶液可见粘丝状即可；（2）铺板：用药勺取适量硅胶液置于玻璃片上，并用药勺均匀地摊开，然后将该玻璃片放在桌面上，做上下地颠动几次直至硅胶液均匀铺满即可；（3）干燥：自然晾干1小时左右；（4）活化：放在恒温干燥箱里于105-110℃干燥2~3h，然后冷却室温，取出存放在干燥器保存，待用。
薄层色谱层析
实验六薄层色谱层析一、实验目的1、学习薄层色谱法的原理和方法；2、学会利用薄层色谱分离提纯有机化合物的规范操作；2、掌握比移值的计算方法；3、了解比移值的影响因素。
二、实验原理层析的基本原理：所有的层析系统都由互不相溶的两相组成，一个是固定相，另一个是流动相。
利用混合物中各组分物理化学性质上的差异（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲合力、分配系数（是指在一定温度下达到平衡后溶质在两相中浓度的比值是一个常数）等），使各组分以不同程度分布在两相中，它们以不同的速度移动，最终彼此分开。
层析分类：柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱、液相色谱薄层色谱(thin layer chromatography)常用TLC表示，又称薄层层析，属于固－液吸附色谱。
依其所采用的薄层材料性质和物理、化学原理的不同，可分为吸附薄层色谱、分配薄层色谱、离子交换薄层色谱和排阻薄层色谱等。
吸附薄层色谱采用硅胶、氧化铝等吸附剂铺成薄层，将样品以毛细管点在原点处，用移动的展开剂将溶质解吸，解吸出来的溶质随着展开剂向前移动，遇到新的吸附剂，溶质又会被吸附，新到的展开剂又会将其解吸，经过多次的解吸-吸附-解吸的过程，溶质就会随着展开剂移动。
吸附力强的溶质随展开剂移动慢，吸附力弱的溶质随展开剂移动快，这样不同的组分在薄层板上就得以分离。
一个化合物在吸附剂上移动的距离与展开剂在吸附剂上移动的距离的比值称为该化合物比移值Rf三、主要试剂和材料蒽（A）、芴酮（B）、香草醛（C）及其混合物（D）；薄层层析硅胶G；薄玻璃板；环己烷：乙酸乙酯（5：1或6：1）；0.5%羧甲基纤维钠(CMC-Na)水溶液；毛细管(内径小于1mm)CHOOOCH3OHA 蒽B 芴酮C 香草醛四、实验装置薄层色谱示意图五、实验步骤制板（简易平铺法）（1）二块7.5cm×2.5cm玻片，洗净，控水。
取7.5cm×2.5cm载玻片2块，用去污粉搽洗，再用水淋洗，最后浸入无水乙醇中，取出晾干。
柱层析实验报告材料
柱层析分离色素一、【实验目的】1．了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。
2．熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。
二、【实验原理】叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。
利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇或无水乙醇提取。
分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。
柱层析法是色谱法中的一种，它是根据混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分离。
常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。
吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面积很大，经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶），当混合物的溶液流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。
由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速度下移，形成色带。
继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。
用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。
本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。
由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行洗脱，从而达到叶绿体主要的4种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。
三、【实验材料】原料：新鲜的菠菜叶试剂：1．无水乙醇或95%乙醇 5.三氧化二铝2．石英砂 6．饱和氯化钠溶液3．丙酮 7.水硫酸钠4．石油醚（60-90℃） 8洗脱液：丙酮：石油醚＝1：9 器材：层析柱（1×30cm），研钵，蒸馏装置，脱脂棉，天平，烧杯，过滤漏斗，玻璃棒，锥形瓶，分液漏斗，试管，铁架台四、【实验操作】1．色素的提取：20克菠菜，加少许石英砂，再加20毫升无水乙醇研磨成浆，脱脂棉过滤，保存滤液，滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤渣再加入30毫升石油醚提取一次，过滤，合并滤液，转移至分液漏斗中,再加入40毫升饱和氯化钠溶液震荡，弃去下层溶液，再分别加入20毫升水震荡洗涤几次，直至下层无色，保留上层溶液，转移至三角瓶中，加入无水硫酸钠干燥5分钟，备用. 2．样品的浓缩：将提取液放入蒸馏烧瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩余液体5-8毫升左右，以备加样使用。
叶绿素层析实验报告
一、实验目的1. 学习叶绿素提取和分离的方法。
2. 了解柱层析（薄层层析）的原理及其操作步骤。
3. 掌握天然色素的鉴定和分离技术。
二、实验原理叶绿素是植物体内重要的光合色素，主要包括叶绿素a和叶绿素b。
这两种色素都含有镁离子，具有特殊的吸收光谱，对光的吸收能力较强。
在有机溶剂中，叶绿素可以溶解，从而从植物组织中提取出来。
柱层析是一种常用的分离技术，利用不同物质在固定相和流动相之间的分配系数不同，实现混合物的分离。
三、实验器材1. 新鲜植物叶片2. 研钵3. 漏斗4. 100mL三角瓶5. 无水乙醇6. 石棉板7. 层析板8. 硅胶9. 烧杯10. 移液管11. 显微镜四、实验步骤1. 叶绿素提取：- 将新鲜植物叶片洗净，晾干。
- 将叶片剪碎，放入研钵中。
- 加入少量无水乙醇，研磨至叶片完全破碎。
- 将研磨液倒入三角瓶中，用滤纸过滤。
- 将滤液转移至烧杯中，加入适量无水乙醇，搅拌均匀。
2. 柱层析：- 将层析板固定在石棉板上，并在层析板的一端涂上一层薄薄的硅胶。
- 将提取液用移液管滴加在硅胶层上，注意不要使液滴过大。
- 将层析板放入层析槽中，加入适量的无水乙醇作为流动相。
- 观察层析过程，当溶剂前沿接近层析板底部时，取出层析板。
- 将层析板放置在显微镜下观察，记录各色素带的颜色、位置和宽度。
3. 叶绿素鉴定：- 根据各色素带的颜色、位置和宽度，确定叶绿素a和叶绿素b的位置。
- 叶绿素a呈蓝绿色，位于层析板较窄的位置。
- 叶绿素b呈黄绿色，位于层析板较宽的位置。
五、实验结果与分析1. 在层析板上，成功分离出叶绿素a和叶绿素b两种色素。
2. 叶绿素a的色素带位于层析板较窄的位置，颜色为蓝绿色。
3. 叶绿素b的色素带位于层析板较宽的位置，颜色为黄绿色。
六、实验结论通过本实验，我们成功从植物叶片中提取和分离出叶绿素a和叶绿素b两种色素。
柱层析是一种简单、有效的分离技术，可以用于分离和鉴定天然色素。
七、实验注意事项1. 在研磨叶片时，注意不要用力过猛，以免破坏叶绿素结构。
薄层层析法具体操作注意事项
薄层层析法具体操作注意事项铺板铺板用的匀浆不宜过稠或过稀：过稠，板容易出现拖动或停顿造成的层纹；过稀，水蒸发后，板表面较粗糙。
匀浆配比一般是硅胶G:水=1：2～3,硅胶G:羧甲基纤维素钠水溶液=1:2.研磨匀浆的时间，根据经验来定，与空气湿度有关,一般通过拿起研棒时匀浆下滴的情况来判断,越稠越难下滴。
匀浆的稀稠除影响板的平滑外，也影响板涂层的厚度,进一步影响上样量。
涂层薄,点样易过载；涂层厚，显色不那么明显。
通常，板的质量对薄层鉴别的影响不是很大，影响最大的是展开剂的配制和展开系统的饱和。
点样尽量用小的点样管。
如果有足够的耐性，最好只用1微升的点样管。
这样,点的斑点较小,展开的色谱图分离度好，颜色分明。
样品溶液的含水量越小越好，样品溶液含水量大,点样斑点扩散大。
样品溶液的溶剂一般是无水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。
点好样的薄层板用电吹风的热风吹干或放入干燥器里晾干.展开剂配制选择合适的量器把各组成溶剂移入分液漏斗，强烈振摇使混合液充分混匀,放置,如果分层,取用体积大的一层作为展开剂。
绝对不应该把各组成溶液倒入展开缸，振摇展开缸来配制展开剂。
混合不均匀和没有分液的展开剂，会造成层析的完全失败。
各组成溶剂的比例准确度对不同的分析任务有不同的要求，尽量达到实验室仪器的最高精确度，比如：取1ml的溶剂，应使用1ml的单标移液管，移液管应符合计量认证要求,尽管多数时候这不是必须的。
展开系统的饱和一般使用的是双槽的展开缸,一槽用来放展开剂，另一槽可加入氨水或硫酸。
把待展开的板放入两槽间的平台，斜架着,盖上展开缸的盖子。
让展开剂的蒸气充满展开缸，并使薄层板吸附蒸气达到饱和，防止边沿效应，饱和时间在半个小时左右。
展开时难免要打开盖子把薄层板放入展开剂中，不过对薄层板与蒸气的吸附平衡影响不大，当然动作应该尽量轻、快。
温湿度的控制温湿度对薄层影响都很大。
不冻结的前提下,通常温度越低分离越好，较难的分离需在低温下分离，例如人参皂苷。
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实验六薄层层析与柱层析实验目的1. 了解偶氮苯的光学异构反应，加深对光化学反应的理解。
2. 掌握薄层层析的基本操作，薄层层析分离顺、反式偶氮苯。
3. 了解柱层析分离有机化合物的原理，初步掌握层析柱装填和洗脱的操作方法4. 采用柱层析分离反式偶氮苯与靛红的混合物实验原理偶氮苯是最简单的芳香偶氮化合物，众多偶氮染料的母体结构。
含有两个苯基分别与偶氮基-N=N~两端相连的结构。
偶氮苯有毒，易燃。
偶氮苯有顺（Z） -反（巳-异构体。
反式为橙红色棱形晶体，蒸气为深红色，溶于乙醇、乙醚、醋酸和水。
反式的热力学性质稳定。
当溶于乙醇的偶氮苯用一定强度的紫外光照射时，顺式的比例逐渐增大，直至达到平衡，形成顺反异构体的混合物。
偶氮苯的光致异构是很多偶氮类功能材料光响应的基础。
顺式为橙红色片状晶体，不稳定，在加热或可见光照射下能够变成反式。
色谱方法是通过在固定相和流动相间分配的不同而将物质分离开。
待分离混合物各组分在固定相上的吸附强度不同，与流动相一起移动的速度也不同，因此被分离开。
剂在毛细管作用下能够沿着色谱板向上移动。
由于混合物中各组分对吸附剂（固定相）的吸附能力不同，当展开剂（流动相）流经吸附剂时发生无数次吸附解附过程，吸附力弱的组分随流动相迅速向前移动，吸附力强的组分滞留在后，由于薄层色谱属于固-液吸附色谱。
薄层色谱板中的固定相中的微孔结构使得溶各组分具有不同的移动速度，最终在固定相薄层析上分离。
TLC除了用于分离外，还可以通过与已知结构的的化合物比对，鉴定少量有机混合物的组成，它也是柱色谱寻求最佳展开剂的手段。
上图中红色化合物的R f等于竖直红线的长度除以竖直蓝线的长度。
柱层析也属于固-液吸附色谱。
在一根玻璃“分离柱”中进行。
管中装上适当的粉末作为国定相。
待分离或纯化物质的溶液（流动相）在重力作用下流经吸附剂时，不同物质对溶剂和吸附剂的亲和力不同，因而被吸附的程度不同，从而以不同速度流动，使化合物得以分离。
靛红与偶氮苯在极性上具有较大差异，从而可以使用极性适中的展开剂，通过柱层析将二者分离。
仪器与试剂分析天平，TLC，锥形瓶，毛细管，层析柱，棉花，量筒，硅胶，蒸发皿，展缸；EtOAc, CH2CI2,石油醚，靛红；请自带尺子（用于计算 R值）颜老师在实验开始之前已经准备好的试剂：a.偶氮苯的溶液（15 mg in 1mL EtOH）；b.靛红的溶液（15 mg in 1mL CH2CI2）；c.靛红与偶氮苯的均匀混合物（靛红1.4 g +偶氮苯3.5 g）。
实验内容a）光照异构化取0.1 g反式偶氮苯溶于5 mL无水乙醇中，将此溶液放于试管中，密封，置于可见光下二星期，以便与光照前的溶液进行对比。
b）薄层层析取管口平整的毛细管吸取光照后的偶氮苯溶液，在离薄层板边沿约0.5 cm的起点线上点样。
再用另一毛细管吸取未经光照的反式偶氮苯溶液点样。
待乙醇挥发后，将点好样品的薄层板放入内衬滤纸的展缸中。
展缸内已放置展开剂（乙酸乙酯/石油醚=1/40）。
薄层板的点样端在下方，浸入展开剂，展开剂不要没过起点Isatin管中装上适当线，也不要碰到样品点。
待展开剂前沿上升到离板的上端约 1 cm处时，取出薄层板，立即用铅笔在展开剂上升的前沿处划一记号，置于空气中晾干。
可观察到薄层板上经光照后的偶氮苯溶液点样处上端有两个黄色斑点（哪一个斑点是顺式的？哪一个斑点是反式的？）。
计算异构体的R f 值。
用上述相同的方法，采用 Ethyl Acetate : Petroleum Ether= 1:1 为展开剂，对靛红与偶氮苯的混合物进行 TLC ，为下面的柱层析选择展开剂。
c）柱层析1．将层析柱固定在铁架台上，一定要保持柱子竖直。
2．将层析柱洗净后在柱底部放入一小团脱脂棉花。
3 .在锥形瓶中称重7g 硅胶（SiO2）,并用Ethyl Acetate : Petroleum Ether （1:40）调匀。
在层析柱的下方放置一个锥形瓶，以收集流下的液体。
加入少量洗脱剂于层析柱中,以润湿棉花,使其贴在柱子下端。
4. 打开层析柱活塞,控制溶剂下流,将硅胶悬浊液沿柱子侧壁加入,并用少量的溶剂洗去残余的硅胶,并加入柱中。
用装有橡皮管或塞子由下向上轻轻敲击柱子外壁,将气泡赶出,使硅胶填装均匀。
并加压使硅胶紧密,以获得较好的分离效果。
轻轻敲击,使硅胶最上层成均匀平面,然后用药匙沿柱子侧壁, 轻轻地、慢慢地在硅胶表面覆盖一层海砂（注意：不要破坏硅胶的上平面）。
关闭活塞,备用。
5. 打开活塞,当溶剂液面降至海砂表面时,关闭活塞。
用滴管沿柱子侧壁加入靛红与偶氮苯混合物的溶液（称取 40 mg,置于1.5mL的塑料样品管，加入1 mL二氯甲烷（CH2CI2）,超声振荡使其溶解）。
打开活塞，使溶剂液面降至海砂表面，关闭活塞。
再用少量的展开剂洗塑料样品管，加入层析谱中，并注意洗去粘附在柱壁上的液滴，打开活塞，流到液面，关闭活塞。
重复上述操作，直到将所有化合物冲到硅胶里面。
6. 沿侧壁加入大量的洗脱剂 Ethyl Acetate : Petroleum Ether （1:40），打开活塞，加压保持一定的流速，观察色带的形成和分离。
7. 当第一个有色带到达柱底时，并且没有流出之前，关闭活塞，倒空锥形瓶，打开活塞，收集全部色带。
然后，改用Ethyl Acetate : Petroleum Ether （1:1）作为洗脱剂。
关闭活塞，换一个空的且干净的锥形瓶，打开活塞。
当第二个有色带到达柱底时，并且没有流出之前，关闭活塞，倒空锥形瓶，打开活塞，收集全部色带。
柱层析分离结束8 •柱层析分离结束后，采用 TLC对上述分离的两个溶液进行分析，总结分离效果。
同时，打开层析柱活塞，在加压下让展开剂流干，然后将硅胶倒入指定的固体废物桶中。
切勿倒入水槽或普通垃圾桶。
预习时的问题1. 在薄层层析实验中，为什么点样的样品斑点不可浸入展开剂的溶液中？为什么进行薄层层析时展缸要盖上盖？2. 当用混合物进行薄层层析时，如何判断各组分的在薄层板上的位置？靛红与偶氮苯，哪一个的极性较强？为什么？3. 柱层析时柱中若留有空气或者是填装不均匀，对分离效果有何影响？如何避免？4. 偶氮苯和靛红物理化学性质？毒性？有什么应用？偶氮苯光照异构化的机理？ why is trans-azobenzene more stable than cis-azobenzene?其它阅读材料1. 光化学由光的作用引起的化学反应近年来日益受到人们的重视，光合作用就是最重要的光化学反应。
研究激发态分子化学行为的光化学反应已经成为有机化学的一个重要分支。
光不仅可以引起多种多样的化学反应，合成各种前所未有的奇妙反应分子，而且与我们的日常生活及生命现象有着密切的联系。
2. 薄层色谱1. 固定相的选择氧化铝和硅胶是薄层层析色谱常用的固定相。
氧化铝多用于分离碱性或中性有机物；而硅胶的吸附性源于表面的 Si-OH 基，主要用于分离酸性、中性有机物质。
薄层色谱用的硅胶有薄层色谱用的硅胶有 60G 6OGF254 60H 60HF254和60HF254+366等类型，其中G表示含有13%硫酸钙（作为黏合剂）；H表示不含硫酸钙；F254表示含有2%无机荧光物质，在254 nm的紫外光照射下发出绿色荧光。
与硅胶相似，氧化铝也因含有黏合剂或荧光剂而分为氧化铝H、氧化铝G 氧化铝HF254和氧化铝GF254等类型。
黏合剂除硫酸钙外，还可用淀粉、羧甲基纤维素（CMC。
2. 操作方法①点样在薄层板一端约1cm处，用铅笔轻轻划一条作为起点线。
样品用易挥发性溶剂溶解后，用毛细管吸取样品溶液，轻轻接触到起点线的某一位置上。
如果溶液太稀，可多点几次，但要等第一次样品溶剂挥发后，再点第二次。
点好样品后，待溶剂挥发干净，才可以进行下面的展开过程。
②展开剂的选择选择展开剂，首先应考虑对被分离物有一定的溶解度和解吸能力。
由于硅胶和氧化铝都是极性吸附剂，所以展开剂的极性越大，试样在薄板上移动的距离越远，R f值（R f值是一个化合物在薄层板上上升的高度与展开剂上升的高度的比值）越大。
例如，在分离过程中常发现R f太小，说明展开剂极性不够，需要考虑加入一种极性强的展开剂进行调控。
发现R f值太小，说明展开剂极性不够，需要考虑加入一种极性强的展开剂进行调控。
常用展开剂的洗脱力由小到大的顺序为：石油醚、环己烷、四氯化碳、二氯甲烷、氯仿、乙醚、四氢呋喃、乙酸乙醋、丙酮、正丁醇、乙醇、甲醇、水、冰乙酸、吡啶、有机酸等。
此外，在展开过程中，展开缸内展开剂的蒸气须始终处于饱和状态。
一般可用一块方型滤纸贴于缸壁上（下端浸于展开剂中），盖好密封一段时间。
取放薄层板应迅速。
③显色展开后，要等溶剂挥发完才能显色。
若被分离的是有色组分，展开板上即呈现出有色斑点。
若化合物本身无色，则可以在紫外灯观察有无荧光斑点；或用碘蒸气熏的方法显色。
显色后，用铅笔轻轻画出斑点位置，计算R f 值。
3．柱色谱吸附层析柱的分离效果不仅依赖于吸附剂和洗脱溶剂的选择，而且与制成的层析柱有关；要求柱中的吸附剂用量为被分离样品量的 30-40 倍，若需要可增至 100 倍。
柱高与直径之比为4:1 至10:1，一般为7.5:1。
实验室常用的层析柱, 其直径在0.5-10 cm 之间。
当吸附物的色带占吸附剂高度的 1/10— 1/4 时，此层析柱已经可作层析分离了。
柱层析常用吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙及活性炭等，吸附剂要求颗粒大小均匀，越细分离效果越佳，但此时洗脱阻力会增大，所以要选择合适大小的吸附剂。
氧化铝分酸性、中性和碱性三种，本实验应用中性氧化铝。
化合物的吸附能力与它的极性成正比，具有较大极性基团的化合物，其在吸附剂上吸附能力较强。
氧化铝对各化合物的吸附性按以下次序递减：酸＞醇，胺，硫醇＞酯，醛，酮＞烃＞卤化物，醚＞烯＞饱和烃。
强吸附性的化合物要用强极性溶剂来洗脱。
作为洗脱剂的溶剂要求其具有一定极性，适合于被分离物的分离，体积尽量要小，此外要求易挥发，易除去（乙醚等挥发性太大的溶剂不合适）。
洗脱剂的极性按下列次序递增：己烷或石油醚＜环己烷＜四氯化碳＜三氯乙烯＜二硫化碳＜甲苯＜苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜丙醇＜乙醇＜甲醇＜水＜吡啶＜乙酸。
装柱要求吸附剂必须均匀填充于柱内，不能有气泡和裂缝，否则将影响洗脱和分离。
在装柱时，通常把柱子竖直固定好，关闭下端活塞，底部用少量脱脂棉轻轻塞紧，加入0.5 cm厚的海砂，然后加入溶剂到柱子体积的 1/4,用一定量的溶剂与吸附剂在烧杯中调成糊状，打开柱下端的活塞，让溶剂一滴一滴地滴入锥形瓶中，同时把糊状物快速倒入柱中，吸附剂通过溶剂慢慢下沉，进行均匀填充。
柱顶部 1/4 处一般不填充吸附剂：以便使吸附剂上面始终保持一液层。