程序化设计兼并引物
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图 " 简并引物设计流程图
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致倦库蚊的酯酶基因序列一致性为 VWUM证明
由表 =可知P克隆 的 小 菜 蛾 +QR- 所 编 码 这段 +QR- 为小菜蛾%_%XZ_‘的同源性结果
序列相似性比较
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E结 果
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选取 f2d和 f,i为简并引物进行 f,B扩 增/得到高度特异性的 f,B产物!产物大小为 _iQ$)/与预测产物大小一致*见图 i3!
递交序列
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选择相关蛋白序列
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再次递交被选序列
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简并引物
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酯酶基因扩增是昆虫抗药性形成的主要机
理-但目前与抗性相关酯酶基因的克隆还仅限 于蚊虫9蚜虫9果蝇等少数模式昆虫 - :&; 小菜蛾 n^YWZ^^e.‘^[VWZ^^e是 世 界 性 的 害 虫%主 要 危 害 十 字 花 科 蔬 菜 -近 年 研 究 表 明 %小 菜 蛾 的 抗 药 性 形 成 也 与 酯 酶 活 性 的 增 加 密 切 相 关 - :2; 但 从 GqFq#KF$中%尚无小菜蛾酯 酶基因 被 克隆 的 报 道-已发表的应用于克隆昆虫抗性相关酯酶基 因 的 简 并 引 物%因 简 并 性 高%!&M~R! 产 物 假 阳 性 多%限 制 了 对 小 菜 蛾 抗 性 分 子 机 理 的 深 入 研究-因此针对昆虫酯酶序列设计一对高度特 异性的简并引物进行昆虫抗性相关基因的克隆
克隆后测序m测序结果以n5c6o检索9l4ln54进行相似性比较m由表可知p克隆的小菜蛾qr所编码的氨基酸序列与蚊虫酯酶有高度相似性p其中与尖音库蚊的酯酶n序列一致性高达stup与致倦库蚊的酯酶基因序列一致性为vwum证明这段qr为小菜蛾酯酶的表达序列m表g用xyz检索xz的同源性结果序列相似性比较a
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技术与方法
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程序化设计简并引物与克隆小菜蛾酯酶基因#
黄 菁 王少丽 乔传令##
$中国科学院动物研究所%农业虫鼠害综合治理研究国家重点实验室 北京 &’’’(’)
*+,-./,01 23-43/..564-71040603/,0235.038/61 ,90:;-6564-7,9015/.-61</:= 08,03/804060> ?@ABC DEFG%HABC IJKLMNE%OPAQ RJSKFMNEFG## $TUVWXWYWZ[\][[^[_‘%abXUZVZcdefZg‘[\hdXM ZUdZV%WbZhWeWZiZ‘ jek[leW[l‘ [\ TUWZ_leWZf meUe_ZgZUW[\ nZVWTUVZdWVeUf o[fZUWV%pqErEFG &’’’(’%RJEFK)> *<8,3/:, PsEtKFLuvKwtsuKsqGxsLywLFqzuLsqEF{KvEwxy|BA StEFGsJq}qGqFquKyxL{sJqyL}qsL}qM tEGF~R! zuEvqut{uLv zuLsqEFvSwsEzwqMtq"SqFyqKwEGFvqFst>HEsJsJqsLLwtL{#wKtsz%#wLy$vK$qu% RL}q?Lz%I%Ett~uLs%KF}Iz&u’(pN%}qGqFquKsqzuEvqut%quq}qtEGFq}{LuywLFEFGL{sJqEFtqysqtM squKtqy|BA>@tEFGLFqzKEuL{zuEvqut%KzKusEKwy|BA %KtL#sKEFq}{uLv sJq}EKvLF}#Ky$vLsJ#x !&M~R!>IEvEwKuEsxKwEGFvqFstJL%q}sJKssJqzuL}SystL{sJqywLFq}y|BA %quq)quxtEvEwKusLsJLtq L{EFtqysqtsquKtqt>&JquqtSwstEF}EyKsq}sJKssJqtq}qGqFquKsqzuEvqut}qtEGFq}#xsJEttL{s%KuqyLSw} #qStq}sLL#sKEFEFGtzqyE{Ey!&M~R! zuL}Sys> *0+,-318 }qGqFquKsqzuEvqu}qtEGF%RL}q?LzEFtqysqtsquKtqGqFq%!&M~R!
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变 得 尤 为 重万要方-数据
本 文 介 绍 的 方 法 是 先 从 I%Ett~uLs< IzM &u’(pN蛋 白 数 据 库 中 检 索 出 =条 抗 性 相 关 昆虫酯酶序列-经多序列比对软件 #wLy$vK$qu 分 析%得 出 它 们 无 间 隙 的 氨 基 酸 序 列 保 守 区 $pwLy$t)- 最 后 用 RL}q?Lz$RQFtqFtStM|’M GqFquKsq?x#uE}QwEGLFSywqLsE}q~uEvqut)针 对 这些保守区设计出多条简并引物-以其中 &对 引 物 对小 菜蛾 y|BA 进 行扩增%得到 &条 单 一 的 |BA 条 带- ~R! 产 物 经 克 隆 测 序%并 经 #wKts/检索 GqFq#KF$%证明 此段 y|BA 为酯 酶
摘 要 利用遗传密码简并性%针对特定的氨基酸序列设计简并引物%是克隆蛋白质家族 y|BA 的 常 规 方法-文章介绍了利用 #wKtsz%#wLy$vK$qu%RL}q?Lz%I%Ett~uLs%Iz&u’(pN等 网 络 工 具 及 数 据 库 设 计 昆 虫抗性酯酶的简并引物-用这对引物从抗有机磷杀虫剂的小菜蛾 n^YWZ^^e.‘^[VWZ^^e中克隆了 &段 y|M BA-经 #wKts/检索 GqFq#KF$%发现此 y|BA 产物与其它昆虫抗性酯酶基因有高度的相似性-研究表明% 程 序 化 设 计 的 简 并 引 物 可 信 性 强 %阳 性 率 高 %能 迅 速 得 到 满 意 结 果 关键词 简并引物设计%RL}q?Lz%昆虫酯酶基因%!&M~R!
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昆虫知识 cR3)$)f)2d1-f*R)+fcQ2c
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表 ! 由 "#$%&#’列出的简并引物
同源区序号
正义链简并引物
反义链简并引物
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家族新基因!
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"#E#E B万VC方f,数B据扩 增 小 菜 蛾 酯 酶 6S+2 按
文献{t|提取小菜 蛾 B+2/并以 Z%@}&<V为 引
物反转录 6S+2/用设计的简并引物进行扩增!
所 用 简 并 引 物 如 下eT&端 引 物eT&C,2\\2\C V2,V,,VV,,2\\\A&(?66A(&~}CP&4P&端 引
物e
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蛋白质数据库
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注0引物分为 ;<端小写字母简并区E核心区F和 @<端大写字母为非简并区E夹板区F
GHI .1J产物分析
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简并引物
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