原位杂交诊断法

ICS 65．020．30
B 41
S B 中华人民共和国水产行业标准
SC／T 7206．3—2007
牡蛎单孢子虫病诊断规程
第3部分：原位杂交诊断法
Diagnostic Protocols for Haplosporidiosis of Oyste卜
Pa r t3：in situ Hybridization Method
2007—06—14发布2007-09—01实施中华人民共和国农业部发布
前言
SC／T 7206《牡蛎单孢子虫病诊断规程》分为三个部分：
——第1部分：组织印片的细胞学诊断法；
——第2部分：组织病理学诊断法；
——第3部分：原位杂交诊断法。

本部分
为sc／T 7206的第3部分。

本部分的附录
A为规范性附录。

本部分由中华人民共和国
农业部提出。

本部分由全国水产标准化技
术委员会归口。

本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站、深圳出入境检验检疫局。

本部分主要起草人：杨冰、黄健、陈爱平、江育林、王崇明、王秀华、魏琦、刘莉。

牡蛎单孢子虫病诊断规程
第3部分：原位杂交诊断法
1范围
S C／T7206的本部分规定了牡蛎尼氏单孢子虫病的原位杂交诊断方法的原理、试剂与材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。

本部分根据尼氏单孢子虫在组织中的定位与感染程度对牡蛎单孢子虫病进行确诊。

2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。

凡是注日期的引用文
件，其随后所有
的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

s c／T7202．3—2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法S C
／T7205．1—2007牡蛎包纳米虫病诊断规程第1部分：组织印片的细胞学诊断法S C
／T7206．1—2007牡蛎单孢子虫病诊断规程第1部分：组织印片的细胞学诊断法
3原理
3．1牡蛎尼氏单孢子虫及其病理学特征
见SC／T 7206．1—2007(牡蛎单孢子虫病诊断规程第1部分：组织印片的细胞学诊断法)中3．1
的规定。

3 2技术原理
原位杂交检测方法是以非放射性标记物——地高辛(DIG)标记的WSSV核酸探针与存在于切片中
的WSS V D N A进行核酸分子杂交，并通过抗原一抗体反应和酶一底物的化学显色反应在组织切片上
显示出WSSV的存在位点。

原位杂交可完整地保持组织与细胞的形态，能在复杂的组织中针对单一细
胞进行病毒检测，准确地反映出组织细胞中病毒的分布。

4试剂和材料
4．1除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。

4．2寡聚核苷酸探针M SXl347：序列为：5’一ATG-TG T—TG G—TGA—CGC—TAA—CCG一3’，合成时用地高
辛(DIG)标记的脱氧核糖核苷尿嘧啶残基(DIG-dU)代替脱氧核糖核苷胸腺嘧啶残基(dT)。

4．3碱性磷酸酶偶联的DIG抗体(A P一抗D IG，0．75U／“L，4"C)：生化试剂。

4．4二甲苯。

4．5无水乙醇。

4．6 95％乙醇。

4．7中性树胶：生物染色用。

4．8石蜡(熔点52℃-54℃)：切片级
4．9戴维森氏AFA(Davidson’s AFA)固定液按SC／T 7202．3—2007(斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法)附录A的规定。

1
SC／T7206．3—2007
4 10 80％乙醇按SC／T 7202．3—2007(斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法)附录A的规定。

4．1170％乙醇按SC／T 7202．3—2007(斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法)附录A的规定。

4．12 50％乙醇按SC／T 7202．3—2007(斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法)附录A的规定。

4 13 500 txg／mL多聚赖氨酸按附录A的规定。

4．14 2×SS C按附录A的规定。

4．15 1xSSC按附录A的规定。

4 16 0．5×SSC按附录A的规定。

4．17 n厄按附录A的规定。

4．18 100t*g／m L蛋白酶K按附录A的规定。

4．19 0．4％甲醛按附录A的规定。

4．20杂交缓冲液按附录A的规定。

4．21缓冲液I按附录A规定。

4．22缓冲液Ⅱ按附录A规定。

4．23缓冲液Ⅲ按附录A规定。

4．24缓冲液Ⅳ按附录A规定。

4．25显影液按附录A规定。

4．26 0．5％俾斯麦棕Y(Bis mark brown Y)按附录A规定。

4。

27阳性对照为受尼氏单孢子虫感染且组织病理学上有明显病灶的牡蛎组织切片(未脱蜡)。

4．28阴性对照为未受尼氏单孢子虫感染且经原位杂交证明为阴性的牡蛎组织切片(未脱蜡)。

5器材和设备
5．1石蜡切片机：满足4“m--7tan厚度的石蜡连续切片要求。

5．2水浴锅：室温～10012，±112。

5．3显微镜：带高倍镜(40x)和油镜(100×)。

5 4微量移液器：量程0．5 t tL--10 t*L、5pL--40 t*L、40 t i L--200b t L、200 b L L--1000bLL各1支。

5．5普通冰箱：具冷藏箱，并带一18℃以下冷冻箱体。

5．6程控组织脱水机或使用手工脱水步骤。

5．7石蜡包埋机或使用手工包埋步骤。

5．8程控切片染色机或使用手工染色步骤。

5．9切片保湿孵育箱：室温--5012，±112或使用自制的简易湿盒放置于恒温箱中。

5 10展片水浴锅：敞口，无盖水浴锅或使用自制保温盒内加一定温度的水代替。

5．11平板烘片机：室温～10012或使用恒温箱代替。

5．12切片染色杯。

5 13医用镊子。

5．14毛笔。

5 15玻片架。

2
SC／T7206．3—2007
5．16吸管。

5．17载玻片。

5．18盖玻片。

5．19吸水纸。

5．20暗盒：可用任何能避免强光直射的盒子。

6操作步骤
6 1组织切片制备
6．1．1样品的采集按SC／T 7205．1—2007(牡蛎包纳米虫病诊断规程第1部分：组织印片的细胞学
诊断法)附录B执行。

6．1．2取活体牡蛎，沿着牡蛎的纵向剖面切取内脏团组织块，置于Davidson’sAFA固定液中固定24 h (固定液的体积应超出样品体积10倍以上)，随后换为70％乙醇保存。

组织切片前先要取材切块，将固定样品根据其病灶定位，切削成约3 mm--5 mlTl的小块，厚度不超过5mm。

6。

1．3按S C／T7202。

3—2007(斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法)中6．2～6．5的规定将样品置于程控组织脱水机中依次进行脱水、透明、浸蜡，完毕后取出在石蜡包埋机上
进行包埋。

用石蜡切片机进行切片，切片厚度6,um，用毛笔将切片移人展片水浴锅内展片，用已被500 ,ttg／mL多聚赖氨酸预先包被的载玻片将切片捞起，置于温箱中40℃温干过夜。

6．2原位杂交
6．2．1组织切片(包括阴性对照和阳性对照)在程控切片染色机中依次通过二甲苯(2次，10min／次)、无水乙醇(2次，10m in／次)、95％乙醇(2次，10 s／次)、80％乙醇(2次，10 s／次)、50％乙醇(1次，10 s)，然后用P B S冲洗6次(勿让切片干燥)。

6．2 2组织切片置于T N E中5m in，而后平放在切片保湿孵育箱中，吸取500t,L100p．g／m L蛋白酶K 溶液，加到每张组织切片上，37℃孵育15 min。

6．2．3把组织切片上的蛋白酶K溶液吸净，然后将其放入预冷到4"C的0．4％甲醛溶液中浸5m i n以终止反应。

6．2．4室温下，用2×SSC浸洗组织切片5rain。

6．2．5把组织切片平放在切片保湿孵育箱中，吸取500弘L杂交缓冲液加到每张组织切片上，42℃孵育30rain。

6．2 6按每张切片500"L的体积，在杂交缓冲液中配制含2ng／／uL的DIG标记的寡聚核苷酸探针的杂交混合液，吸取杂交混合液加到组织切片上，置于90"C-95"C平板烘片机上保温12min，使组织DNA 变性。

注意补充切片上过度蒸发的杂交缓冲液。

6 27把组织切片放在平整的冰面上淬冷5min。

6．2．8在切片保湿孵育箱内42℃下孵育16 h-18h。

6．2．9依次用缓冲液2×SSC(2．5min，室温)、2×SS C(2．5m in，室温)、1×ssc(2．5min，室温)、1×ssc(2．5min，室温)、0．5×ssc(5min，42℃)、0．5×ssc(5min，42℃)、缓冲液I(5min，室温)洗组织切片。

6．2．10用500pL／片缓冲液Ⅱ封闭组织切片，37℃温浴30min。

6．2．11将AI)一抗DIG用缓冲液Ⅱ稀释至0．75单位／mL(1／LL0．75单位／,uLAP一抗DIG加到1 n1L缓冲液Ⅱ中)，把组织切片乎放在湿盒中，每片吸250弘L已用缓冲液Ⅱ稀释的AP一抗DIG于组织切片上，37℃温浴l h。

6．2．12用缓冲液I(2次，5m in／次，室温)、缓冲液Ⅲ(2次，5m in／次，室温)洗玻片。

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Sc／T7206．3—2007
6．2．13吸500“L显影液于每张组织切片上，在暗处于室温放置1 h～3 h。

中间可取出短时间在显微镜下观察显色情况，当阳性对照有明显显色时可中止反应，如果阴性对照的组织细胞开始普遍出现非特异性显色，则应立即终止显色。

5．2．14把组织切片置于缓冲液Ⅳ中15min终止反应。

6．2．15组织切片上依次滴加双蒸水(1次，10 s)、0．5％俾斯麦棕Y(1次，1min)、95％乙醇(3次，10 s／次)、无水乙醇(3次，10 s／次)、二甲苯(4次，10 s／次)。

6．2．16滴加2滴中性树胶封片。

6．2．17在明视野显微镜下寻找蓝黑色到黑色细胞沉淀物并拍照。

7结果判定
7．1受感染的牡蛎组织显示阳性反应，即尼氏单孢子虫胞内有较深的蓝黑色颗粒沉淀，而未受感染的牡蛎组织则无此沉淀呈现阴性结果。

寄生虫感染程度越重，则着色越明显。

7．2若阳性对照未出现相应的阳性反应或阴性对照和阳性对照样品均出现与阳性显色反应程度相当的明显非特异性反应，表明操作过程不符合要求，结果无效，重新取样检测。

4
sC／T7206．3—2007
附录A
(规范性附录)
试剂配方
1 20×S SC
NaCl 175．32
g
柠檬酸三钠(2H20)88．239
加水溶解定容至 1
000mI．调节p H至
7．0高压蒸气灭菌后，室温贮存。

2 2xSS C
20×S SC100m L
水
900m L
混匀，0．45 btm滤膜过滤除菌，4"12贮存。

31xS SC
20×S S c50mL
水950m L 混匀，0．45Fm滤膜过滤除菌，
4℃贮存。

4 0 5×SS C
20xSSC 50mL
水 1 950m L
混匀，O．45ta n滤膜过滤除菌，4℃贮存。

5 10×缓冲液I
Tris
N a a
加水溶解至m盯咖
用浓HCl调节pH至
加双蒸水定容至咖地弧札"乩
高压蒸气灭菌，4℃贮存。

6缓冲液I
10x缓冲液I 100m L
水900mL 混匀，0．45／an滤膜过滤除菌，4℃
贮存。

5
SC／T7206．3—2007
7 10x缓冲液Ⅲ
Tr i s
NaCl
队融咖加水溶解至
用浓HCI调节pI-I至
MgCl2·61420
m㈣h锻札¨砸乩加双蒸水定容至
混匀，0．45,u m滤膜过滤除菌，4℃贮存，出现沉淀后丢弃。

8缓冲液Ⅲ
10×缓冲液Ⅲ100mL
水900mL 混匀，0．45,u m滤膜过滤除菌，4"C贮存，出现沉淀后丢弃。

9 NBT贮存液
四氮唑蓝(NBT) 100mg 二甲基甲酰胺0．931mL 水0．402mL 避光，一20℃贮存。

10 BC IP贮存液
5一溴_4一氯_3一日引哚磷酸一甲苯胺盐(BCIP) 100na g
二甲基甲酰胺2m L 避光，一20℃贮存。

11 10×T NE
Tris
NaCl
ED TA’2H20驯铋”咖
加水溶解至
卯辨砣7用H C I调p H至
咖h 加水定容至
高压蒸气灭菌后，4℃贮存。

12 TN E
100mL 10×T NE
永900mL混匀，O．45,um滤膜过滤除菌，4℃保存。

13 10mg／mL蛋白酶K
蛋白酶K100mg
加水定容至10m L 6
SC／T7206．3—2007分装于无菌离心管中(0．25 mL／管)，20℃下保存。

14 100pg／m L蛋白酶K
10mg／mL蛋白酶K O．25m L
TN E 24．75m L
用前临时配制，混匀，4℃存放。

15 0．4％甲醛
甲醛(37％) 5．4mL
才( 500mL
倒掉前可重复使用4次，用前预冷。

16 20 x丹哈特氏液(D e nh ar d t’s J
牛血清白蛋白(组份5) 0．4 g
聚蔗糖400(Ficoll 400) 0．4 g
聚乙烯吡咯烷酮360(PVP 360) 0．4 g
加水溶解并定容至100mL
0．45 tan的滤器过滤，5 mL／支分装，一20℃贮存。

17 25％硫酸葡聚糖
硫酸葡聚糖(Dextran sulfate) 25 g
加水定容至100mL低热搅拌片刻使之溶解，
20℃保存。

18 10 m g／m L鲑精D N A
鲑精DNA250m g 水25mL 将鲑精DNA钠盐加入水中，用玻璃棒搅拌直至完全溶解。

用6号针头的注射器反复抽打数次。

在100"12水浴中加热10min，立即放于冰浴中淬冷，分装于无菌小试管中，2012保存。

使用前在10012水浴中加热5 min，然后淬冷。

19杂交缓冲液
20×S SC 10m L
100％甲酰胺25 mL
20×丹哈特氏液2．5mL
10m g／mL鲑精D NA2．5m L
25％硫酸葡聚糖10mL
混匀，412贮存。

闭
剂
20缓冲液Ⅱ封
59
0．
缓冲液I 100 rrlL
在60℃--80℃水浴中溶解，不断晃动，直至颗粒溶解。

412可贮存2周。

7
SC／T 7206．3-2007
21 10x缓冲液Ⅳ
Tris 12．1 g
EDTA-Na2·2HzO3．7 g 加水溶解。

并定容至 1 000mL 用HCI调pH至8．0，高压灭菌。

4℃贮存。

22缓冲液Ⅳ
10x缓冲液Ⅳ100mL
水900mL
混匀，0．45m滤膜过滤除菌。

4"C贮存。

23 10％聚乙烯醇
聚乙烯醇(分子量30 000--70 000) 10
g 加水溶解至100mL 搅拌溶解后，分装10 mL／管，～20"C贮存。

24显影液
缓冲液Ⅲ90mL 盐酸左旋咪唑24mg 10％聚乙烯醇10mL 4℃保存
用前在每1 nlL上述混合液中加入
NBT贮存液
4．5p L
BCI P贮存液
3．5“L 25 0．5％俾斯麦棕Y
俾斯麦棕Y(Bismark Brown Y) 2．5
g 水500m L 把染料溶于水中，过滤。

室温贮存。

26 500p哩／m L多聚赖氨酸
多聚赖氨酸(分子量25 000) 5m g 水10mL 溶解后，4℃贮存。

8。