PCR法获取目的基因

荧光定位PCR技术（FQ-PCR）
FQ-PCR的工作原理是利用Taq 酶的5′→ 3′外切酶活性，在 PCR反应系统中加入一个荧光标记的探针。该探针可与引物 包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5′端标以荧 光报告基团，靠近3′端标以荧光淬灭基团，两者之间构成能 量传递结构。 当PCR反应每复制一个特异核酸片 段，就有一个探针被切断，伴随一 个荧光信号的释放。由于被释放的 荧光基团数目和PCR产物是一对一 的关系，因此用荧光检测技术检测 出的荧光信号有无或强弱，即代表扩增产物有无或多少。由 于荧光信号是代表扩增产物的有效特异信号,实现了仪器实 时检测，为新的PCR定量原理创造了条件。
四、PCR法获取目的基因
1. T载体克隆PCR获取的目的基因
由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有 一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A， 因为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突 出碱基的存在，克隆时可以使用T载体克隆目的基因。
具有3‘-5’ 外切酶活性的DNA 聚合酶（如pfu聚合酶），其 扩增的PCR 产物是平末端, 要对这种平末端的PCR 产物进 行克隆, 应首先对PCR产物的3‘末端进行加A的工作。工作 程序如下
二、 PCR技术的原理
1. PCR技术
在微量离心管中,加入 适量的缓冲液, 微量的模 板DNA,四种脱氧核苷酸, 耐热性DNA聚合酶, 一对 合成DNA的引物,通过高 温变性、低温退火和中温 延伸三个阶段的循环合成 DNA，每一次循环使特 异区段的基因拷贝数放大 一倍。一般样品经过30次 循环,可使基因的拷贝数 达到数百万。
（3）重复“变性--退火--延伸”的循环，可获得大量的新DNA链，而 且这种新链又可成为下次循环的模板，从而指数级地获得大量DNA产 物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。
2. PCR技术的特点
1）速度快，灵敏度高：经过30轮循环，理论上目的产物的 扩增量达230个拷贝（109拷贝）。 2）特异性：引物的序列及其与模板结合的特异性是决定 PCR反应结果的关键；引物设计的最大原则是最大限度地提
设计酶切位点克隆pcr获取的目的基因35限制性内切酶的识别序列目的基因的pcr片段35限制性内切酶的识别序列经限制酶切割得到的具有粘性末端的线性载体经限制酶切割得到粘性末端体外连接获得目的基因的克隆文档仅供参考如有不当之处请联系本人改正
PCR法获取目的基因
农学112班
马晴晴 孙婷婷 张 娜 金漪倩 胡 斐 徐振鹏
扩增出 的目的 基因
琼脂糖凝胶电泳
3. PCR反应条件 循环参数
（1）预变性：94 ℃ 5 min
（2）变性：94 ℃ 20 s-45 s 使双链DNA解链为单链
（3）退火：温度由引物的解链温度Tm决定，时间45 s左右。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；降低温度 可增加反应的灵敏性。 （4）延伸：一般为72℃，时间由扩增片段长度决定。 （5）循环次数：主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次 次数过多，导致扩增效率降低，错误掺入 率增加。到达平 台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。 （6）延伸补齐：72 ℃ 5 min—10 min
PCR原理
（1）类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物的存 在
（2）PCR过程：由变性—复性（退火）--延伸三个 基本反应步骤构成 ①变性：94℃左右，使双链DNA模板解离成为 单链； ②复性：55℃左右，引物与模板DNA单链互补 配对结合； ③延伸：72℃左右，“模板-引物结合物”在 DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，以靶序 列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成 新的DNA链
2. 基本程序
PCR排管
TaqDNA聚合酶
模板DNA dNTP
模板DNA
预变性
dNTP 引物
引物
Buffer Mg2+
94℃ 5min
Buffer
Mg2+
72 ℃ 5～7 min
Taq 酶
模板DNA
dNTP 引物 Buffer Mg2+
循 环 仪
94℃
55 ℃ 72 ℃
扩增出 的目标 基因
转移点样 进行电泳
高扩增效率和特异性，同时尽可能减少非特异性扩增。
3）操作简便易行：只需要数小时就可以用电泳法检出1μg基 因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。
三、PCR的反应体系和基本步骤
1 .反应体系组成成分（总体积：50 L）
H2O 10×PCR反应缓冲液 25mmol/L MgCl2 4种dNTP 上游引物（引物１） 下游引物（引物２） 模板DNA (约1ng) Taq酶 35μL 5μL 4μL 4μL 0.5μL 0.5μL 0.5μL 0.5μL
PCR技术的应用举例：
研究：基因克隆；DNA测序；分析突变；基因重组与融合；鉴定与 调控蛋白质结 合DNA序列；转座子插入位点的绘图；检测基因的 修饰；人类基因组工程：用散布重复序列产生DNA标志；遗传图 谱的构建(检测DNA、 多态性或精子绘图)；物理图谱的构建；测 序，表达图谱 法医：犯罪现场标本分析，DNA检测比对，DNA安保标记。 医疗：肿瘤：胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液恶 性肿瘤等癌症的筛查。 组织和群体生物学：遗传聚类研究；动物保护研究。 古生物学：考古与博物馆标本分析。 动物学：动物传染病的诊断等。 植物学：检测植物病原等。
PCR技术的定义及其发展历史
PCR技术的原理
PCR的反应体系和条件 PCR法获取目的基因
PCR技术的未来展望
PCR技术 多聚酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction)
PCR技术即多聚酶链式反应，又称聚合酶 链式反应。是一种选择性体外扩增DNA或 RNA的方法。 在生物学实验中做为基础存在，可以说是 现代分子生物学研究中最重要的技术。
PCR技术的注意事项
1.合理分隔实验室 将样品的处理、配制PCR反应液、PCR 循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注 意样本处理及PCR产物的鉴定应与其他步骤严格分开。 2.吸样枪 由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘 上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要 十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸 ，以免交叉污染或产生气溶胶污染。 3.试剂分装 所有的PCR试剂都应小量分装，-20℃保存，以 减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂和PCR 反应液应与样品及PCR产物分开保存。 4.防止操作人员污染 一次性手套、吸头、小离心管应一次 性使用。
方案一 胶回收平末端 PCR产物，进入5µ l 10×Tag DNA Polymerase Buffer、4种 dNTP或dATP（终浓度为200nM）、2.5U Tag DNA Polymerase，加水至 终反应体积为 50µ l，72℃ 保温10min，纯化 PCR片段后进行TA克隆 方案二 PCR 反应（50µ l 反应体积）结束以后，加入1µ l 20mM dATP 和2.5U 的 Tag 酶，72℃ 保温10min ，然后进行直接进行TA克隆
PCR技术的未来展望
到2030年，由于基因技术的空前发展，一 个人的全部基因组序列可能只需要1000美 元就能得到。 基因定制，基因医疗，基因药物都不会再 是设想，而将逐渐成为现实，而这一切，都 建立于PCR技术所树立起来的基础之上。随 着技术发展，个人基因信息也许会成为新的 重要隐私。
谢谢！
请老师和同学们批评指正。
一、PCR技术的创建
1.Khorana等1971年提出在体外经DNA变性、 与适当引物杂交、再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。
2.1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 3.1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。 4.1988年，第一台PCR仪问世。 5.1989年美国《Science》杂志比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获 1993年度诺贝尔化学奖。
2 .设计酶切位点克隆PCR获取的目的基因
5’
目的基因的PCR片段
3’Leabharlann 5’经限制酶切割得到的具有 粘性末端的线性载体
3’
限制性内切酶的识别序列
限制性内切酶的识别序列
经限制酶切 割得到粘性 末端
体外连接
获得目的基因的克隆
五、PCR的类型
1 、不对称PCR 2 、反向PCR (reverse PCR) 3 、多重PCR（复合PCR） 4、 LP-PCR（Labelled primers) 5 、锚定PCR（anchored PCR, A-PCR） 6 、PCR固相分析法 7 、原位PCR 8 、反转录PCR（RT-PCR) 9、 荧光定量 PCR（real-time PCR)