实验室压力蒸汽灭菌器生物安全性研究

中国疾病预防控制中心
硕士学位论文
实验室压力蒸汽灭菌器生物安全性研究
姓名：沈瑾
申请学位级别：硕士
专业：劳动卫生与环境卫生学
指导教师：张流波
20070601
—ｊ＠：ｊ！实验室压力蒸汽灭菌器生物安全性研究４）胰蛋白胨大豆琼脂培养基（ＴＳＡ）：
将１６９ＴＳＡ成品溶于４００ｒａｌ蒸馏水中，并调节ｐＨ值在７．Ｏ±０．２，经１２１＂Ｃ压力蒸汽灭菌后使用。

５）０．１％的胰蛋白胨生理盐水溶液（０．Ｉ％ＴＰＳ）：
胰蛋白胨０．４９；ＮａＣＩ３．４９：ＴＷＥＥＮ一８００．４ｍｌ；加４００ｍｌ蒸馏水溶解，并调节ｐＨ值在７．０±０．２，经１２１℃压力蒸汽灭菌后使用。

６）固体负载：空试管、三角瓶、吸管、镊子等
７）液体负载：水、试剂、培养基等
８）温度压力测定仪（图卜１）
９）下排气式压力蒸汽灭菌器：日本ＨＩＲＡＹＡｂｌＡ公司ＨＶＥ一５０容积５０Ｌ
１０）脉动真空式压力蒸汽灭菌器：ＸＨＪＣ－Ａ型ＢＤ抗力综合检测器（图卜２）
１１）两个贮物铝盒（图卜３）：Ａ盒上下均有透气小孔，Ｂ盒仅上盖有透气小孔。

图卜１温度压力测定仪
图卜２）【ＨＪＣ＿Ａ型肋抗力综合检测器
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铝盒Ａ（上下通气）铝盒Ｂ（仅上盖通气）
图卜３贮物铝盒
１．２．２方法
实验室灭菌固体一般用１１５＂Ｃ、１２１＂Ｃ、１２６＂Ｃ、１３２＂Ｃ、１３４＂Ｃ：斤种温度““，下排气式压力蒸汽灭菌器用１１５＂Ｃ、１２１℃和１２６＂Ｃ，预（脉动）真空式压力蒸汽灭菌器一般用１３２℃和１３４℃。

实验室灭菌液体一般用１１５。

Ｃ和１２１＂Ｃ两种不同的温度，最常用的是１２１。

Ｃ，但在灭菌含糖试剂或含糖培养基时必须用１１５＂Ｃ，以免高温破坏试剂的成分。

实验剩余的菌悬液和培养物是实验室最常见的废弃物，现以嗜热脂肪杆菌芽孢作为实验指示菌，观察下排气式压力蒸汽灭菌器在灭菌温度为１２１℃时，不同灭菌时间下悬液和培养物的灭菌情况。

１．２．２．１实验前物品的灭菌情况（固体负载）
１）下排气式压力蒸汽灭菌器
①灭菌器内装入７０％的固体负载，靠近排气口处横放一个装有十支中试管的试管包（图卜４），内含两支装入化学指示卡和生物指示剂的试管（其中一支有试管帽另一支没有）；竖放一个装有十支中试管的试管包（图１—５），内含三支装入化学指示卡和生物指示剂的试管（一支竖放有试管帽，一支竖放没有试管帽，一支倒放有试管帽）；并放置温度压力探头。

设定固体灭菌程序（表１－１），开启灭菌器。

实验室压力蒸汽灭菌器生物安全性研究
图卜４横放试管包的组成图卜５竖放试管包的组成
②灭菌循环结束后，取出化学指示卡观察其变色情况，若变为标准色或超过标准色则变色合格；取出生物培养指示剂，将其内含培养基的玻璃管捏碎后于５６。

Ｃ培养４８ｄ＇，时，观察变色情况，同时设阴、阳性对照，阳性对照变色，阴性对照和实验用生物培养指示剂不变色，则灭菌合格；探头取出后联机读数（图１－６），确定灭菌周期所有时间点的温度和压力，判定灭菌温度、时间是否与设定值一致。

表卜１下排气式压力蒸汽灭菌器灭菌固体的实验灭菌程序
灭菌程序重复实验次数
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一
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图卜６温度压力探头联机读数
２）脉动真空式压力蒸汽灭菌器（肋抗力综合检测器）
灭菌器置物筐中装入７０％的固体负载，横放一试管包，竖放一试管包（试管包的组成同上），放入温度压力探头。

将置物筐放置于排气口上方，关闭灭菌器柜门，选择“抗力测定程序”，脉动三次，设定灭菌程序（表１—２），启动灭菌。

灭菌循环结束后，取出化学指示卡、生物指示剂及温度压力探头，结果判断同上。

表卜２脉动真空式压力蒸汽灭菌器灭菌固体的实验灭菌程序
灭菌程序重复实验次数
ｉ．国ｊ竺竺兰曼垄苎釜圣堕兰竺竺塞全堡！壅
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３）相同灭菌程序下，不同包装固体的灭菌效果比较
贮物铝盒Ａ、Ｂ各装入十支中试管（图卜７），每层中间两支试管装有生物指示剂和化学指示卡；另将十支中试管（中间两支试管装有生物指示剂和化学指示剂）用新牛皮纸包成试管包Ｃ（图卜８）。

铝盒Ａ、Ｂ，试管包Ｃ和温度压力探头放置于下排气式压力蒸汽灭菌器中，装入其他固体负载，使灭菌器总的装载量为７０％，设定固体灭菌程序（表卜３）。

灭菌循环结束后，取出化学指示卡、生物指示剂及温度压力探头，结果判断同上。

表卜３实验灭菌程序
灭菌程序重复实验次数
铝盒下层指示剂的放置铝盒上层指示剂的放置
图卜７贮物铝盒中试管及指示剂的放置方式
图ｌ一８试管包Ｃ的组成
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１．２．２．２实验前物品的灭菌情况（液体负载）
下排气式压力蒸汽灭菌器内装入７０％的液体负载，靠近排气口处竖放一个装有十支中试管的试管包，每支试管底部有３ｍｌ水，内含两支装入化学指示卡和生物指示剂的试管（其中一支有试管帽另一支没有），化学指示卡紧贴水面但未沾水（图卜９），生物指示剂２／３浸入水中（图ｉ－１０），并放置温度压力探头。

设定液体灭菌程序（表卜４），开启灭菌器。

灭菌循环结束后，取出化学指示卡、生物指示剂及温度压力探头，结果判断同上。

图卜９试管包中化学指示卡图Ｉ－１０试管包中生物指示剂
表卜４下排气式压力蒸汽灭菌器灭菌液体的实验灭菌程序
灭菌程序重复实验次数
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平），再进行两两比较。

两两比较时，采用多个样本率比较的Ｘ２分割法，为保证检验假设中Ｉ型错误ａ的概率不变，需重新规定检验水准，本章节中资料三组间的两两比较，有公式得新检验水准ａ’＝Ｏ．０１２５；五组间的两两比较，有公式得新检验水准Ⅱ’＝Ｏ．００４５。

１．３结果
１．３．１灭菌温度、压力和时间的测定结果
实验中，两台灭菌器在不同的灭菌程序下，温度、时间的实测值均与设定值一致，下面分别列举不同灭菌程序的温度压力变化图。

１）ＨＶＥ一５０下排气式压力蒸汽灭菌器，灭菌程序为１１５＂Ｃ２５ｍｉｎ，实测灭菌温度范围为１１５～１１５．２。

Ｃ，实测灭菌时间为２５．１ｍｉｎ，其温度压力曲线图如下（图１－１１）。

图卜１１下排气式压力蒸汽灭菌器灭菌程序为１１５。

Ｃ２５ｍｉｎ的温度压力曲线图
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２）ＨＶＥ一５０下排气式压力蒸汽灭菌器，灭菌程序为１１５＂Ｃ３０ｒａｉｎ，实测灭菌温度范围为１１５～１１５．２１２，实测灭菌时间为３０ｒａｉｎ，其温度压力曲线图如下（图１－１２）。

图卜１２下排气式压力蒸汽灭菌器灭菌程序为１１５。

Ｃ３０ｍｉｎ的温度压力曲线图３）ＨＶＥ一５０下排气式压力蒸汽灭菌器，灭菌程序为１２１℃ｌＯｍｉｎ，实测灭菌温度范围为１２１～１２１．３。

Ｃ，实测灭菌时间为１０．１ｍｉｎ，其温度压力曲线图如下（图１－１３）。

图卜１３下排气式压力蒸汽灭菌器灭菌程序为１２１４ＣｌＯｍｉｎ的温度压力曲线图
实验室压力蒸汽灭菌器生物安全性研究
４）ＨＶＥ一５０下排气式压力蒸汽灭菌器，灭菌程序为１２１℃１５ｍｉｎ，实测灭菌温度范围为１２１～１２１．４。

Ｃ，实测灭菌时间为１５．１ｍｉｎ，其温度压力曲线图如下（图１－１４）。

图卜１４下排气式压力蒸汽灭菌器灭菌程序为１２１℃１５ｍｉｎ的温度压力曲线图
５）ＨＶＥ－５０下排气式压力蒸汽灭菌器，灭菌程序为１２１℃２０ｌｌｌｉｎ，实测灭菌温度范围为１２１～１２１．４。

Ｃ，实测灭菌时间为１９．９ｍｉｎ，其温度压力曲线图如下（图卜１５）。

图卜１５下排气式压力蒸汽灭菌器灭菌程序为１２１℃２０ｍｉｎ的温度压力曲线图
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６）ＨＶＥ一５０下排气式压力蒸汽灭菌器，灭菌程序为１２６＂Ｃ５ｍｉｎ，实测灭菌温度范围为１２６～１２６．３＂Ｃ，实测灭菌时间为５ｍｉｎ，其温度压力曲线图如下（图卜１６）。

图１－１６下排气式压力蒸汽灭菌器灭菌程序为１２６℃５ｍｉｎ的温度压力曲线图７）ｆｉＶＥ一５０下排气式压力蒸汽灭菌器，灭菌程序为１２６℃ｌＯｍｉｎ，实测灭菌温度范围为１２６～１２６．４＂Ｃ，实测灭菌时间为１０．１ｍｉｎ，其温度压力曲线图如下（图卜１７）。

图１－１７下排气式压力蒸汽灭菌器灭菌程序为１２６℃ｌＯｍｉｎ的温度压力曲线图
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８）ＢＤ抗力综合测试仪，灭菌程序为１３２＂Ｃ４ｍｉｎ，脉动三次，实测灭菌温度范围为１３２～１３２．１℃，实测灭菌时间为４ｍｉｎ，其温度压力曲线图如下（图１－１８）。

图卜１８ＢＤ抗力综合检测器灭菌程序为１３２℃４ｍｉｎ的温度压力曲线图
１．３．２实验前物品的灭菌情况结果（固体负载）
１．３．２．１下排气式压力蒸汽灭菌器灭菌固体负载时（表１－５），同一负载在相同灭菌温度下，延长灭菌时间可增加灭菌合格数；不同放置方式的固体负载，经相同的灭菌程序后得到的灭菌结果也不同。

图２一ｌＡＧＩ一１０采样
图２—２Ａｎｄｅｒｓｅｎ采样使用真空泵图２—３Ａｎｄｅｒｓｅｎ采样器不使用真空泵
２．２．２．１制备菌悬液
将已有粘质沙雷氏菌肉汤培养物分纯，２５＂Ｃ培养４８小时，选择单个典型菌落普通斜面培养基传代，培养２４小时后取少量新鲜培养物放入肉汤，恒温摇床３７。

Ｃ培养２４小时备用。

（计数１．２～３．６Ｘ１０８ｃｆｕ／ｍ１）
现存枯黑芽孢为１．５～１．５８ｘ１０”ｃｆｕ／ｍｌ
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抽真空结束后（５０ｓ）取下采样器，２５℃培养４８ｈ（重复５遍）。

步骤同上，但不使用真空泵（重复５遍）。

步骤同上，但每层载体染３０ｒａｌ的粘质沙雷氏菌，使用真空泵的实验重复５遍，不使用真空泵的实验重复５遍。

２）Ａｎｄｅｒｓｅｎ六级采样器采灭菌器Ｂ排出的气体
所有步骤同灭菌器Ａ的采集方法。

２．２．２．５统计学方法
有关数据用ＳＡＳ９．１软件包分析，数据进行两样本的ｔ检验，取ｐ＜Ｏ．０５作为显著性差异水平。

２．３结果
粘质沙雷氏菌在２５℃培养时形成粉红色菌落（图２－４），枯草杆菌黑色变种芽孢培养后形成表面粗糙不透明的微黄色菌落，菌落中央有一黑点（图２－５）。

培养皿培养后有上述菌落即可计数。

图２－４粘质沙雷氏菌ＡＴＣＣｌ４７５６图２－５枯草黑色变种芽孢ＡＴＣＣ９３７２。