全自动生化分析仪常用检测方法
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污染造成 ➢杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值。
（一）光学因素
3．反射光和散色光的影响： ➢反射光和散色光均是入射光谱带宽度内
的光直接对T产生影响。 ➢散射和反射使T↓，A↑，吸收光谱变形
注：一般可用空白对比校正消除 4．非平行光的影响： ➢使光程↑，A↑，吸收光谱变形
（二）化学因素
• 溶液中的溶质可因 c 的改变而有离解、 缔合、配位以及与溶剂间的作用等原因而 发生偏离 L-B 定律的现象 。
E1＝E2 E1≠E2 （E2-E1)↑
A=E1C·L A与C不成线性关系，偏离Beer定律
A与C偏离线性关系越严重
结论： ● 选择较纯单色光（Δλ↓，单色性↑） ● 选λmax作为测定波长
（一）光学因素
2. 杂散光的影响 ➢杂散光是指从单色器分出的光不在入射 光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远。 ➢杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件
• 例：在水溶液中，Cr(Ⅵ)的两种离子存在 如下平衡
•
Cr2O42- + H2O ⇌ 2CrO42- + 2H+
定量分析方法
• (1) 标准曲线法 • (2) 标准溶液对比法（外标一点法） • (3) 吸光系数法
标准曲线法——最经典方法
• 前提：固定仪器和固定条件
A K B C A C
• 过程：配置标准溶液系列 分别测定 A
得C~A曲线
样品
测定A样
查得C样
标准曲线法
标准溶液对比法
➢在相同的条件下，配制浓度为cs的标准溶 液和浓度为cx的试样溶液，在最大吸收波 长处，分别测定二者的吸光度值为As、Ax
，依据朗伯-比尔定律得:
➢
As=Kbcs
Aຫໍສະໝຸດ Baidu=Kbcx
则: cx = cs*Ax /As
标准溶液对比法
C
Cs
Ci
吸光系数法
溶液中同时存在两种或两种以上的吸光性物质 ,则测得的该溶液的吸光度等于溶液中各吸光性 物质吸光度的总和，即：
A（a+b+c）＝Aa＋Ab＋Ac
✓ 应用：多组分测定
偏离Beer定律的因素
• 依据Beer定律,A与C关系 应为经过原点的直线 • 偏离Beer定律的主要因素 表现为以下两个方面：
✓（一）光学因素 ✓（二）化学因素
即：A/C=const
• 故：只要测出某种溶液的吸光度，将它与 已知浓度的标准溶液吸光度进行比较，就 可以算出该溶液的浓度。
讨论：
1.Lamber-Beer定律的适用条件（前提）: ➢ 入射光为单色光 ➢ 溶液是均匀，无散射溶液 2.该定律适用于固体、液体和气体样品 3.在同一波长下，各组分吸光度具有加和性如果
（一）光学因素
1．非单色光的影响： Beer定律应用的重前提—入射光为单色光
• 照射物质的光经单色器分光后 并非真正单色光
• 其波长宽度由入射狭缝的宽度 和棱镜或光栅的分辨率决定
• 为了保证透过光对检测器的响 应，必须保证一定的狭缝宽度
• 这就使分离出来的光具一定的 谱带宽度
讨论
入射光的谱带宽度严重影响吸光系数和吸收光谱形状
Lamber-Beer定律：吸收光谱法基本定律
描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和 待测物浓度的关系 Lamber定律：A∝l
Beer定律：A ∝C
入射光强度I0 透射光强度I 物体截面为S
厚度为l
Lambert-Beer（朗伯-比尔）定律
• 当一束平行单色光通过均匀的非散射样品 时，样品对光的吸光度与样品的浓度及厚 度成正比
生化分析仪的常用检测方法
2010-8
内容
• 一 概述
• 二 基本原理 • 三 检测方法
终点法 固定时间法 连续监测法
功能特点
• 特点：自动化——机械化的仪器设备模仿 代替手工操作
• 优点：提高了工作效率 减少了主观误差
• 灵敏 准确 快速 标准化
分类
• 按结构原理分
管道连续流动式 分立式——常用 离心式 干片式——急诊常用
•
A = kcb
• A---吸光度 k---吸光系数 c---溶液浓度 b---液层厚度
吸光度
• 透光度的负对数 表示物质对光的吸收程度
A=-lgT=lg1/T=lgI0/It
T---透光度
I0--入射光强度
It--透射光强度 T=It/I0
吸光系数
• 定义：吸光物质在单位浓度及单位厚度时 测得的吸光度。
➢吸光系数法又称绝对法，是直接利用朗伯-
比尔定律的数学表达式A＝Kbc进行计算的
定量分析方法。在手册中查出待测物质在
最大吸收波长max处的吸光系数
或 , E 1% 1cm
并在相同条件下测量样品溶液的吸光度A，
则其浓度为：
c A L
或
A
E 1% 1cm
L
内容
• 临床生化分析仪最常使用的是——分光光 度法
• 分光光度法——是通过测定被测物质在特 定波长处或一定波长范围内光的吸收度， 对该物质进行定性和定量分析的方法。
分光光度计组成
光源
单色器
样品池
记录装置
检测器
光吸收曲线
• 溶液对不同波长光的吸收程度，通常用 光吸收曲线来描述。
讨论
• 不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状
相似λmax不变。而对于不同物质，它们的 吸收曲线形状和λmax则不同。
• 不同浓度的同一种物质，在某一定波长下 吸光度 A 不同，在λmax处吸光度A 的差异 最大。此特性可作为物质定量分析的依据 。
在分光光度法中, 以吸__光__度__为纵坐标, 以 _波_长__为横坐标作图可得光吸收曲线。
浓度不同的同种溶液, 在该种曲线中其最 大吸收波长_相__同____，相应的吸光度大小 则__不__同___，同一波长下摩尔吸数 相同 。
• K值的大小取决于吸光物质的性质、入射 光波长、溶液温度和溶剂性质等，与溶液 浓度大小和液层厚度无关。但K值大小因 溶液浓度所采用的单位的不同而异。
吸光系数
• 三种表现形式：摩尔吸光系数ε 吸光系数a 百分吸光系数E1%1cm
Lambert-Beer（朗伯-比尔）定律
• 郎伯-比尔定律表明：当液层厚度固定时， 溶液的吸光度与溶液的浓度成正比。
• 按测定速度分
小型 中型 大型 超大型（模块式）
• 按自动化程度分 半自动 全自动
主要构成
• 加样系统（样品转盘 试剂仓 取样装置） • 比色系统（光源 比色杯 单色器 检测器） • 供排水系统 • 数据处理系统
内容
• 一 概述
• 二 基本原理 • 三 检测方法
终点法 固定时间法 连续监测法
基本原理
（一）光学因素
3．反射光和散色光的影响： ➢反射光和散色光均是入射光谱带宽度内
的光直接对T产生影响。 ➢散射和反射使T↓，A↑，吸收光谱变形
注：一般可用空白对比校正消除 4．非平行光的影响： ➢使光程↑，A↑，吸收光谱变形
（二）化学因素
• 溶液中的溶质可因 c 的改变而有离解、 缔合、配位以及与溶剂间的作用等原因而 发生偏离 L-B 定律的现象 。
E1＝E2 E1≠E2 （E2-E1)↑
A=E1C·L A与C不成线性关系，偏离Beer定律
A与C偏离线性关系越严重
结论： ● 选择较纯单色光（Δλ↓，单色性↑） ● 选λmax作为测定波长
（一）光学因素
2. 杂散光的影响 ➢杂散光是指从单色器分出的光不在入射 光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远。 ➢杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件
• 例：在水溶液中，Cr(Ⅵ)的两种离子存在 如下平衡
•
Cr2O42- + H2O ⇌ 2CrO42- + 2H+
定量分析方法
• (1) 标准曲线法 • (2) 标准溶液对比法（外标一点法） • (3) 吸光系数法
标准曲线法——最经典方法
• 前提：固定仪器和固定条件
A K B C A C
• 过程：配置标准溶液系列 分别测定 A
得C~A曲线
样品
测定A样
查得C样
标准曲线法
标准溶液对比法
➢在相同的条件下，配制浓度为cs的标准溶 液和浓度为cx的试样溶液，在最大吸收波 长处，分别测定二者的吸光度值为As、Ax
，依据朗伯-比尔定律得:
➢
As=Kbcs
Aຫໍສະໝຸດ Baidu=Kbcx
则: cx = cs*Ax /As
标准溶液对比法
C
Cs
Ci
吸光系数法
溶液中同时存在两种或两种以上的吸光性物质 ,则测得的该溶液的吸光度等于溶液中各吸光性 物质吸光度的总和，即：
A（a+b+c）＝Aa＋Ab＋Ac
✓ 应用：多组分测定
偏离Beer定律的因素
• 依据Beer定律,A与C关系 应为经过原点的直线 • 偏离Beer定律的主要因素 表现为以下两个方面：
✓（一）光学因素 ✓（二）化学因素
即：A/C=const
• 故：只要测出某种溶液的吸光度，将它与 已知浓度的标准溶液吸光度进行比较，就 可以算出该溶液的浓度。
讨论：
1.Lamber-Beer定律的适用条件（前提）: ➢ 入射光为单色光 ➢ 溶液是均匀，无散射溶液 2.该定律适用于固体、液体和气体样品 3.在同一波长下，各组分吸光度具有加和性如果
（一）光学因素
1．非单色光的影响： Beer定律应用的重前提—入射光为单色光
• 照射物质的光经单色器分光后 并非真正单色光
• 其波长宽度由入射狭缝的宽度 和棱镜或光栅的分辨率决定
• 为了保证透过光对检测器的响 应，必须保证一定的狭缝宽度
• 这就使分离出来的光具一定的 谱带宽度
讨论
入射光的谱带宽度严重影响吸光系数和吸收光谱形状
Lamber-Beer定律：吸收光谱法基本定律
描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和 待测物浓度的关系 Lamber定律：A∝l
Beer定律：A ∝C
入射光强度I0 透射光强度I 物体截面为S
厚度为l
Lambert-Beer（朗伯-比尔）定律
• 当一束平行单色光通过均匀的非散射样品 时，样品对光的吸光度与样品的浓度及厚 度成正比
生化分析仪的常用检测方法
2010-8
内容
• 一 概述
• 二 基本原理 • 三 检测方法
终点法 固定时间法 连续监测法
功能特点
• 特点：自动化——机械化的仪器设备模仿 代替手工操作
• 优点：提高了工作效率 减少了主观误差
• 灵敏 准确 快速 标准化
分类
• 按结构原理分
管道连续流动式 分立式——常用 离心式 干片式——急诊常用
•
A = kcb
• A---吸光度 k---吸光系数 c---溶液浓度 b---液层厚度
吸光度
• 透光度的负对数 表示物质对光的吸收程度
A=-lgT=lg1/T=lgI0/It
T---透光度
I0--入射光强度
It--透射光强度 T=It/I0
吸光系数
• 定义：吸光物质在单位浓度及单位厚度时 测得的吸光度。
➢吸光系数法又称绝对法，是直接利用朗伯-
比尔定律的数学表达式A＝Kbc进行计算的
定量分析方法。在手册中查出待测物质在
最大吸收波长max处的吸光系数
或 , E 1% 1cm
并在相同条件下测量样品溶液的吸光度A，
则其浓度为：
c A L
或
A
E 1% 1cm
L
内容
• 临床生化分析仪最常使用的是——分光光 度法
• 分光光度法——是通过测定被测物质在特 定波长处或一定波长范围内光的吸收度， 对该物质进行定性和定量分析的方法。
分光光度计组成
光源
单色器
样品池
记录装置
检测器
光吸收曲线
• 溶液对不同波长光的吸收程度，通常用 光吸收曲线来描述。
讨论
• 不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状
相似λmax不变。而对于不同物质，它们的 吸收曲线形状和λmax则不同。
• 不同浓度的同一种物质，在某一定波长下 吸光度 A 不同，在λmax处吸光度A 的差异 最大。此特性可作为物质定量分析的依据 。
在分光光度法中, 以吸__光__度__为纵坐标, 以 _波_长__为横坐标作图可得光吸收曲线。
浓度不同的同种溶液, 在该种曲线中其最 大吸收波长_相__同____，相应的吸光度大小 则__不__同___，同一波长下摩尔吸数 相同 。
• K值的大小取决于吸光物质的性质、入射 光波长、溶液温度和溶剂性质等，与溶液 浓度大小和液层厚度无关。但K值大小因 溶液浓度所采用的单位的不同而异。
吸光系数
• 三种表现形式：摩尔吸光系数ε 吸光系数a 百分吸光系数E1%1cm
Lambert-Beer（朗伯-比尔）定律
• 郎伯-比尔定律表明：当液层厚度固定时， 溶液的吸光度与溶液的浓度成正比。
• 按测定速度分
小型 中型 大型 超大型（模块式）
• 按自动化程度分 半自动 全自动
主要构成
• 加样系统（样品转盘 试剂仓 取样装置） • 比色系统（光源 比色杯 单色器 检测器） • 供排水系统 • 数据处理系统
内容
• 一 概述
• 二 基本原理 • 三 检测方法
终点法 固定时间法 连续监测法
基本原理