胃癌患者组织中TGF-α、TGF-β1和miR-302a的表达及其与胃癌的相关性研究

现代消化及介入诊疗　２０２０年第２５卷第５期ＭｏｄｅｒｎＤｉｇｅｓｔｉｏｎ＆Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ２０２０牞Ｖｏｌ．２５牞Ｎｏ．５６２９
　·基础研究·
胃癌患者组织中ＴＧＦ α、ＴＧＦ β１和ｍｉＲ ３０２ａ的表达及其与胃癌的相关性研究
邵建富１，李兴海１，马文杰１，李文１，王敬蠧１，韩素桂２
【摘要】目的　探讨转化生长因子 α（ＴＧＦ α）、转化生长因子 β（ＴＧＦ β１）和微小ＲＮＡ ３０２ａ（ｍｉＲ ３０２ａ）在胃癌患者组织中的表达及其与胃癌的相关性。

方法　选取２０１６年６月至２０１８年６月唐山市人民医院收治的９２例胃癌患者作为研究对象，患者均接受手术治疗，手术过程中取病灶组织，设为胃癌组；选择癌旁组织（距离病灶≥３ｃｍ），设为对照组。

采用实时荧光ＰＣＲ检测技术测定９２组织样本中ｍｉＲ ３０２ａ的表达量，同时采用免疫组化法检测组织样本中ＴＧＦ α和ＴＧＦ β１的表达水平；并分析其与胃癌分级、淋巴转移和ＴＮＭ分期等的相关性。

结果　胃癌组织中ＴＧＦ β１呈强阳性表达，在胃癌组织旁增殖区域及旺盛增殖区域呈现弱阳性表达，在正常黏膜中呈现弱阳性或阴性表达。

胃癌组中ＴＧＦ α和ＴＧＦ β１表达水平明显高于对照组（Ｐ＜０ ０１），胃癌组ｍｉＲ ３０２ａ表达水平明显低于对照组（Ｐ＜０ ０１）。

胃癌组织中ＴＧＦ α、ＴＧＦ β１和ｍｉＲ ３０２ａ表达水平与年龄、性别无统计意义（Ｐ＞０ ０５）；胃癌组织中ＴＧＦ α、ＴＧＦ β１和ｍｉＲ ３０２ａ表达水平与组织分化程度、淋巴结转移、ＴＮＭ分期相关（Ｐ＞０ ０５）。

胃癌组织中ＴＧＦ α、ＴＧＦ β１和ｍｉＲ ３０２ａ表达水平与患者临床分期呈正相关性（Ｐ＜０ ０５）。

结论　ＴＧＦ α、ＴＧＦ β１和ｍｉＲ ３０２ａ在胃癌组织中表达量显著改变，且与肿瘤细胞的ＴＮＭ分期、分化程度和淋巴结转移相关，提示ＴＧＦ α、ＴＧＦ β１和ｍｉＲ ３０２ａ可能在胃癌的发生、分化和转移过程中起一定作用。

【关键词】　胃癌；ｍｉＲ ３０２ａ；转化生长因子 α；转化生长因子 β
；表达中图分类号：Ｒ７３５．２；Ｒ５７３　文献标志码：Ａ　ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－２１５９．２０２０．０５．０１７
作者单位：０６３０００唐山市人民医院（１普外科；２核医学检验科）基金项目：唐山市重点研发计划项目（１７１３０２４４ａ）
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【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒ牷Ｍｉ ３０２ａ牷Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ牷Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ牷Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
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　现代消化及介入诊疗　２０２０年第２５卷第５期ＭｏｄｅｒｎＤｉｇｅｓｔｉｏｎ＆Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ２０２０牞Ｖｏｌ．２５牞Ｎｏ．５
胃癌是一种消化道常见恶性肿瘤。

随着现代生活水平的提高，饮食习惯和饮食结构的改变，生活压力的不断加大，环境污染的持续加重，胃癌在我国的发病率呈现逐年上升的趋势［１］。

胃癌发病的分子生物学机制目前尚不清楚。

转化生长因子α（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ α，ＴＧＦ α）与转化生长因子β１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ β１，ＴＧＦ β１）被认为与细胞周期转化、细胞凋亡调控和促进新血管生成等生理过程相关［２～３］。

ｍｉＲ ３０２ａ是一类与细胞分化与发育密切相关的ｍｉＲＮＡ，参与众多分子生物学过程［４］。

现已证实ｍｉＲ ３０２ａ在卵巢癌和乳腺癌中低表达，提示可能在肿瘤发生发展过程中发挥抑癌基因的作用。

ＴＧＦ β１在体内、体外对血管内皮细胞（ＥＣ）增殖起到相反作用，ＴＧＦ β１可通过表面的特异性受体结合调节细胞功能。

为了进一步研究胃癌发生发展、分化转移的内在分子生物学机制，本研究选择了ＴＧＦ α、ＴＧＦ β１和ｍｉＲ ３０２ａ三种被认为在肿瘤中发挥关键调控作用的因子，深入研究其在胃癌组织中的表达情况，并分析其与胃癌分化、转移等的相关性为后续胃癌的治疗提供科学依据。

１　资料与方法
１．１　一般资料
选取２０１６年６月至２０１８年６月我院收治的９２例胃癌患者作为研究对象，患者均接受手术治疗，手术过程中取病灶组织，设为胃癌组；选择癌旁组织（距离病灶≥３ｃｍ），设为对照组。

患者中，男４８例，女４４例，年龄４０～７０岁，平均年龄（５８ ２３±１０ ４５）岁，病程０ ５～１ ５年，平均病程（０ ８±０ ５）年。

根据肿瘤分期系统（ＴＮＭ）分期：Ⅰ期１７例，Ⅱ期２３例，Ⅲ期３５例，Ⅳ期１７例。

其中淋巴结转移６０例，３２例患者无淋巴结转移，５３例患者高分化，３９例患者低分化。

１．２　纳入、排除标准
１．２．１　纳入标准　①患者符合胃癌诊断标准，并经手术组织检查最终确诊；②患者拟行手术，心智健全，有自主判断能力；
③入院前未接受任何形式的放疗或化疗；④属于首次发病；⑤患者同意纳入本研究，并签署同意书，本研究经我院医学伦理委员会批准。

１．２．２　排除标准　①合并肝肾等其他主要脏器耗损性疾病患者；②伴有其他主要脏器恶性肿瘤的患者；③精神疾病患者，长期服用精神类药物；④非原发胃癌，中途退出研究者。

１．３　试剂与方法
活体组织一经采集，一部分立即置于－８０℃的无菌无ＲＮＡ酶条件下保存，用于ｍｉＲ ３０２ａ检测，其余部分组织样本均放入１０％的中性甲醛溶液中进行固定，并进行石蜡包埋，而后将其制成４μｍ的组织切片，用于ＴＧＦ α和ＴＧＦ β１检测。

本研究共使用到如下试剂：美国Ｓａｍｔａ公司生产的ＴＧＦ α和ＴＧＦ β１抗体，保持１∶５０的抗体浓度，选择Ｖｅｃｔｏｒ选择的生物素标记的二抗及Ｓ Ｐ试剂盒。

应用Ｓ Ｐ免疫组活化化学方法对染色，采用微波炉法进行抗原修复，选择福州迈新生物制品公司提供的阳性玻片为阳性对照片，采用磷酸缓冲液代替抗染玻片为阴性对照组。

１．４　ｍｉＲ ３０２ａ的检测
胃癌组和对照组组织样本中ｍｉＲ ３０２ａ的检测采用实时荧光定量ＰＣＲ检测。

首先提取组织匀浆液中的目标ｍＲＮＡ，采用ＲＮＡ提取试剂盒在严格的无ＲＮＡ酶和无菌条件下按照试剂盒操作步骤提取ＲＮＡ。

采用实时荧光定量ＰＣＲ系统扩增和定量检测标本中两种ｍＲＮＡ表达量，将空白对照组的ｍＲＮＡ表达量为对照，定量为１，获得另外四组ｍＲＮＡ表达的相对值。

ＰＣＲ扩增循环参数设置如下：：５５℃２ｍｉｎ，９０℃１０ｍｉｎ，９５℃１５ｓ，５８℃３０ｓ，７２℃３０ｓ，重复５０个循环。

扩增时设置内参基因组和空白对照组（ＤＥＰＣ水）。

１．５　ＴＧＦ α和ＴＧＦ β１的检测
ＴＧＦ α和ＴＧＦ β１的检测方法为免疫组化法，以ＰＢＳ为阴性对照，首先采用缓冲液对组织切片进行２０ｍｉｎ抗原高温修复，而后用ＰＢＳ进行冲洗１５ｍｉｎ。

而后加入相应抗体，在４℃环境下放置超过８ｈ。

再用ＰＢＳ进行冲洗６ｍｉｎ。

顺序加入聚合物辅助剂ｐｖ ９０００试剂一和试剂二，分别放置２０ｍｉｎ后用ＰＢＳ进行冲洗６ｍｉｎ。

最后进行染色。

免疫组化检测结果的观察方式如下：采用ＣＭＩＡＳ真彩色医学图像分析系统对切片的染色情况进行分析，随机选择每张切片的５个视野（×２００），分别检测这些视野的积分光密度（ｉｎｔｅｇｒａｌｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ，ＩＯＤ），取平均值作为该染色切片中相应蛋白的表达情况。

１．６　统计处理
应用ＳＰＳＳ１８ ０软件对研究数据进行统计处理。

符合态分布的计量资料以珋ｘ±ｓ表示，采用ｔ检验。

对临床分期与ＴＧＦ α、ＴＧＦ β１和ｍｉＲ ３０２ａ表达进行Ｐｅａｒｓｏｎ相关性分析。

以Ｐ＜０ ０５为差异具有统计学意义。

２　结果
２．１　ＴＧＦ β１在胃癌中的表达
胃癌组织中ＴＧＦ β１呈强阳性表达，在胃癌组织旁增殖区域及旺盛增殖区域呈现弱阳性表达，在远癌及正常黏膜中呈现弱阳性或阴性表达，见图１。

２．２　两组ＴＧＦ α、ＴＧＦ β１和ｍｉＲ ３０２ａ表达水平比较胃癌组中ＴＧＦ α和ＴＧＦ β１表达水平明显高于对照组，胃癌组ｍｉＲ ３０２ａ表达水平明显低于对照组，差异均有统计学意义（Ｐ＜０ ０１），见表１。

２．３　胃癌组织ＴＧＦ α、ＴＧＦ β１和ｍｉＲ ３０２ａ表达水平与患者临床病理特征的相关性
胃癌组织中ＴＧＦ α、ＴＧＦ β１和ｍｉＲ ３０２ａ表达水平与患者年龄、性别不相关（Ｐ＞０ ０５）；胃癌组织中ＴＧＦ α、ＴＧＦ β１和ｍｉＲ ３０２ａ表达水平与组织分化程度、淋巴结转移、ＴＮＭ分期相关（Ｐ＞０ ０５），见表２。

２．４　临床分期与胃癌组织ＴＧＦ α、ＴＧＦ β１和ｍｉＲ ３０２ａ表达的相关性
胃癌组织ＴＧＦ α、ＴＧＦ β１和ｍｉＲ ３０２ａ表达水平与患者临床分期呈正相关性（ｒ＝０ ６９３、０ ７４５、０ ６９９，Ｐ＝０ ０１３、０ ０１０、０ ０３２）。

现代消化及介入诊疗　２０２０年第２５卷第５期ＭｏｄｅｒｎＤｉｇｅｓｔｉｏｎ＆Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ２０２０牞Ｖｏｌ．２５牞Ｎｏ．５６３１
图１　ＴＧＦ β１在不同组织中免疫组化染色法结果（Ｓ Ｐ，×２００）　Ａ、Ｂ：ＴＧＦ β１在正常黏膜中分布在胃壁细胞中；Ｃ、Ｄ：在萎缩性胃炎组织中ＴＧＦ β１呈现弱阳性表达：Ｅ、Ｆ：在胃癌黏膜中呈现阳性表达表１　两组ＴＧＦ α、ＴＧＦ β１和ｍｉＲ ３０２ａ的表达水平（珋
ｘ±ｓ）组别ｎＴＧＦ α（％）ＴＧＦ β１（％）ｍｉＲ ３０２ａ（％）胃癌组９２４．４６±０．３５７８．９７±０．５１４１．３８±０．２５１对照组９２１．１０±０．１３１３．８３±０．７６９４．１１±０．６１７ｔ值－８４．６９８５３．３０９－３９．３２４Ｐ值
－
０．０００
０．０００
０．０００
３　讨论
胃癌是一种消化道常见恶性肿瘤，其发病率和致死率居于全国恶性肿瘤首位。

肿瘤的进展过程中，随着肿瘤体积的增大，肿瘤细胞营养和氧供缺乏，会出现一系列基因改变和蛋
白质改变［５］。

所以，探究胃癌的发病原因，研究其内在分子
生物学机制，对于研究有效的药物靶点，推动胃癌的治疗进步十分必要。

表２　胃癌组织ＴＧＦ α、ＴＧＦ β１和ｍｉＲ ３０２ａ表达水平与患者临床病理特征的相关性（珋
ｘ±ｓ） 指标类别ｎＴＧＦ αＴＧＦ β１ｍｉＲ ３０２ａ年龄
≤５５５６４．４３±０．３６２９．０３±０．４７２１．４３±０．２２４＞５５３６４．５０±０．３４９８．８９±０．５３７
１．３５±０．２６４
ｔ值－－０．９２６１．２９９１．４４５Ｐ值
－０．３５７０．１９７０．１５２性别
男４８４．５０±０．４０４９．０１±０．５９７１．４０±０．２９４女４４４．４２±０．２９５
８．９３±０．４０９
１．３６±０．１９４
ｔ值－１．０７２０．７５１０．８１６Ｐ值
－０．２８７０．４５４０．４１７组织分化程度
低分化３９４．１７±０．２５６８．６７±０．４４６１．２０±０．１８４高中分化５３４．６８±０．２５１９．１９±０．４４８１．５１±０．２０４ｔ值－－９．５２９－５．５１９－７．７３０Ｐ值
－０．００００．００００．０００淋巴结转移
存在６０４．６６±０．２４７９．２４±０．３９３１．５２±０．１８０不存在３２４．０９±０．２０４８．４７±０．２９５
１．１３±０．１４９ｔ值－１１．０８８９．６５９１０．４０７Ｐ值
－０．００００．００００．０００ＴＮＭ分期
Ⅰ＋Ⅱ期４０４．１４±０．２１５８．５２±０．２８０１．１６±０．１４５Ⅲ＋Ⅳ期５２４．７１±０．２２４９．３２±０．３５１．５６±０．１５９ｔ值－－１２．２４４－１１．９３８－１２．４４３Ｐ值
－
０．０００
０．０００
０．０００
６３２
　现代消化及介入诊疗　２０２０年第２５卷第５期ＭｏｄｅｒｎＤｉｇｅｓｔｉｏｎ＆Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ２０２０牞Ｖｏｌ．２５牞Ｎｏ．５
本研究中主要分析了三种生物分子在胃癌肿瘤组织中的表达情况。

其中，ｍｉＲ ３０２ａ在肿瘤组织中性质稳定且功能广泛，在辅助胃癌早期诊断、后续治疗和判断预后中具有重要的临床价值。

研究表明［６～７］，ｍｉＲ ３０２ａ在多种肿瘤组织中均起到调节作用：在乳腺癌肿瘤组织中，ｍｉＲ ３０２ａ可以通过提高癌细胞对化疗药物的敏感性来增加患者对化疗的反应性；在卵巢癌的发生过程中，ｍｉＲ ３０２ａ可通过抑制某种蛋白质的表达来抑制癌细胞生长；同时，ｍｉＲ ３０２ａ表达水平的升高能激活ＭＡＰＫ信号通路，从而抑制肿瘤细胞的浸润、转移。

目前，ｍｉＲ ３０２ａ在胃癌细胞当中的表达情况和生理功能也越来越受到重视。

本研究结果显示，在胃癌组织中，ｍｉＲ ３０２ａ的表达显著低于癌旁组织。

且ｍｉＲ ３０２ａ的表达量与胃癌的分化程度、是否存在转移和ＴＮＭ分期密切相关。

据此可以推测，ｍｉＲ ３０２ａ在胃癌组织中的作用可能与其在其他癌变组织中已经观察到的生理作用类似，即，ｍｉＲ ３０２ａ具有抑制癌细胞生长转移的作用［８］。

ｍｉＲ ３０２ａ可能是通过促进胃癌细胞凋亡，调控胃癌细胞细胞周期来达到其对癌细胞的生长抑制作用的。

ＴＧＦ β１本质是多肽二聚体，在人体中具有ＴＧＦ １、ＴＧＦ β２、ＴＧＦ β３，三种形式基因编码不同，具有高度的组织特异性。

临床研究表明，皮肤癌、胰腺癌、肺癌与ＴＧＦ β１关系密切，胃癌患者伴淋巴结转移ＴＧＦ β１、ｍＲＮＡ表达水平明显高于无淋巴结转移患者［９］。

ＴＧＦ β１信号传导通路的机制是：ＴＧＦ β１配体与膜受体结合后，形成两种受体异聚体，ＴＧＦ β１在体外能抑制胃癌细胞株ＨＳＣ ３９和ＨＳＣ ４３的增殖，并诱导凋亡，胃癌肿瘤中ＴＧＦ β１高度表达，随着胃癌分化程度降低表达程度而升高，说明胃癌恶性转化的过程和增殖过程ＴＧＦ β１起到关键作用［１０］。

研究表明，在功能正常的小鼠胃组织中，ＴＧＦ α主要生理功能包括抑制胃酸分泌、保护胃黏膜细胞和促进其生长［１１］。

但是，当ＴＧＦ α在胃组织当中过度表达时，又会带来胃黏膜上皮细胞过度增生，而胃黏膜上皮细胞的过度增生将会导致小鼠胃的体积大于健康小鼠，然而其中的正常脂肪组织、结缔组织却存在不同程度的萎缩。

本研究中，胃癌组织中ＴＧＦ α、ＴＧＦ β１和ｍｉＲ ３０２ａ表达水平与年龄、性别无统计意义（Ｐ＞０ ０５）；胃癌组织中ＴＧＦ α、ＴＧＦ β１和ｍｉＲ ３０２ａ表达水平与组织分化程度、淋巴结转移、ＴＮＭ分期具有统计学意义（Ｐ＞０ ０５）。

ＴＧＦ α是机体自分泌系统的重要组成部分，能通过细胞合成并外排分泌，最终又通过与相同细胞表面受体结合调节细胞周期。

在胃肿瘤细胞中，过度表达的ＴＧＦ α将会通过调节下游的一系列信号通路来影响肿瘤组织的分化、转移和侵润，促进新血管的形成，而抑制肿瘤细胞的凋亡。

与ＴＧＦ α的生理功能类似，ＴＧＦ β１通过调控细胞增殖情况来发挥生理功能［１２－１５］。

在正常情况下，ＴＧＦ β１可以阻断细胞周期当中Ｇ１期和Ｓ期之间的转化，从而抑制细胞的过度增生［１６］。

在本研究中，可以发现，ＴＧＦ β１的表达在胃癌组织中明显降低，且其表达量与胃癌的分化程度、是否存在转移和ＴＮＭ分期密切相关。

这可能是因为，肿瘤细胞的生长会反馈性的增加ＴＧＦ β１的分泌，而此时过度分泌的ＴＧＦ β１会促进细胞外基质与肿瘤细胞之间的相互作用，促进新血管的生成，有利于肿瘤组织摄取血氧，而细胞外基质与肿瘤细胞之间的相互作用又将促进肿瘤细胞的转移［１７－２０］。

综上所述，ＴＧＦ α、ＴＧＦ β１和ｍｉＲ ３０２ａ在胃癌组织中表达量显著改变，且与肿瘤细胞的ＴＮＭ分期、分化程度和淋巴结转移相关，提示ＴＧＦ α、ＴＧＦ β１和ｍｉＲ ３０２ａ可能在胃癌的发生、分化和转移过程中起一定作用。

参考文献
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（收稿日期：２０２０ ０３ ２２）
（本文编辑：郑浩轩
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）（上接第６２８页）
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（收稿日期：２０２０ ０３ １１）
（本文编辑：郭彦东）。