转基因植酸酶玉米的研究与安全评价

基因组学与应用生物学，2011年，第30卷，第2期，第251-256页
Genomics and Applied Biology,2011,Vol.30,No.2,251-256
评述与展望
Review and Progress
转植酸酶基因玉米的研究与安全评价
熊建文1彭端1﹡覃晓娟2王继瑞3
1广西工学院鹿山学院,柳州,545616;2广西农业科学院微生物研究所,南宁,530007;3广西来宾市质量技术监督局,来宾,546100
﹡通讯作者,joypengduan@
摘要植酸酶是应用最广泛的饲料添加剂之一，它在自然界中广泛存在，能提高饲料中磷的利用率，对减轻动物高磷粪便导致的环境水域污染有着重要意义。

玉米是动物饲料的主要原料，在玉米饲料中添加植酸酶易造成饲料成本升高和生产效率降低等问题。

近年来随着基因工程技术的发展，已克隆出多个真菌植酸酶基因，并成功在微生物、植物系统中表达。

本文主要介绍了植酸酶基因的微生物来源与相关研究成果，阐述了转基因技术的常用方法和转植酸酶基因玉米的研究进展，并详细评价了转植酸酶基因玉米的安全性。

通过对转植酸酶基因玉米的深入探讨，对改善玉米的品质，降低成本及推广植酸酶在饲料工业中的应用具有重要意义。

关键词转基因玉米,植酸酶,安全性
Research Progress and Safety Evaluation of Phytase Transgenic Maize
Xiong Jianwen1Peng Duan1*Qin Xiaojuan2Wang Jirui3
1Lushan College of Guangxi University of Technology,Liuzhou,545616;2Institute of Microbiology Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning,530007;3Municipal Supervisory Bureau for Quality and Technology of Guangxi Laibin,Laibin,546100
﹡Corresponding author,joypengduan@
DOI:10.3969/gab.030.000251
Abstract Phytase is one of most widespread feed additives,which exists widely in nature.It can enhance the phosphorus and mineral absorption in monogastric animals,and it is significant for reducing the level of phospho-rus output in nature.Maize is the major ingredient of animal feed,and it may enhance cost or reduce efficiency to maize by adding phytase.Recently,with the development of gene engineering technique,many phytase genes from fungus have been cloned and successfully expressed in the microorganisms and plants.In this review,we mainly introduced the microorganism resource of phytase gene and the relative investigation achievements,expounded the methods of transgenic technology and the research progress of the transgenic maize plants expressing phytase gene.Further,we also evaluated the safety of phytase transgenic maize.According to this article,we hope that it would improve the quality of maize,reduce the cost of production and promote the application of phytase in feed industry in the future.
Keywords Transgenic maize,Phytase,Safety
植酸酶(phytase)是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸(盐)的一类酶的总称，具有特殊的空间结构，能够依次分离植酸分子中的磷，将植酸(盐)降解为肌醇和无机磷，同时释放出与植酸(盐)结合的其它营养物质。

它能提高植物性饲料中磷的利用率，减少粪便中磷的排出量，对降低环境污染、提高畜牧养殖业效益具有重要的意义(姚斌和范云六,2000)。

玉米是世界上分布最广泛的粮食作物之一，同时也是重要的饲料和工业原料。

20世纪80年代中期开始，科学工作者运用植物基因工程技术对玉米性状进行了改良，1990年到2006年间美国共批准了5412项转基因玉米田间试验的申请，培育出抗虫、抗病、抗除草剂、抗旱、优质和改变农艺现状等多种优良玉米品种(陈洁君等,2007)，其中被批准商品化的转基因玉米主要有抗虫转基因玉米和抗除草剂转基因玉米，转基因玉米逐渐发展成为全球种植面积第二的转基因作物。

研究者对商品化的转基因玉米产品研究后发现，与非转基因玉米相比较，利用抗虫、抗除草剂的转基因玉米饲养对动物体重和产品质量影响较小(Scott and Pollak,2005)。

转基因玉米取
基因组学与应用生物学Genomics and Applied Biology
得的相关研究成果，为构建转植酸酶基因玉米提供了新的思路。

玉米含磷丰富，但玉米中65%以上的磷是以植酸磷的形式存在。

猪和禽类等单胃动物因缺乏分解植酸的酶而难以利用植酸，造成有效磷利用率低和环境污染等问题，因此通过转基因技术提高玉米中植酸酶的含量，改善玉米饲料的品质，对节约成本、提高饲料利用率及保护环境等有重要的意义。

本文主要就以植酸酶基因为研究对象，对其在玉米体系中的构建、转化方法、表达及转植酸酶基因玉米的研究现状进行综述，并探讨了转植酸酶基因玉米的安全性，以期为深入研究开发节能减排、绿色环保的转基因作物提供依据，同时也有利于转植酸酶基因玉米的推广。

1植酸酶基因及其表达
植酸酶广泛存在于自然界中，植物、部分动物组织和微生物中都存在着植酸酶。

其中，3-植酸酶存在于植物、霉菌和细菌中，性质稳定，在饲料工业中已被广泛应用；而6-植酸酶只存在于植物中，热稳定性较差，60~65℃以上容易丧失活性。

微生物来源主要是细菌、真菌以及酵母菌，并且微生物来源的植酸酶被认为最经济合理。

Igbasan等(2000)推测可能由于微生物来源的植酸酶对内源蛋白水解酶的抵抗能力比较强，因此活性高于植物、动物来源植酸酶。

Onyango等(2005)研究也表明微生物来源的植酸酶在小肠中的活性优于植物来源的。

据报道，土曲霉、黑曲霉、米曲霉K1、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌都能产生植酸酶(Dvorákováet al.,1997)，Aspergillus fi-cuum NRRL3135产生的植酸酶具有较高的活性并且耐热性高(Ullah,1988)。

1.1植酸酶基因在微生物中的表达
鉴于天然来源植酸酶的产量低、酶学性质不稳定、耐热性差，致使天然植酸酶在饲料工业中难以得到广泛地推广，因此通常通过生物技术、发酵技术和基因工程生产商业化植酸酶。

Chelius和Wodzinski (1994)对Aspergillus niger NRRL3135进行了辐射诱导，诱变后菌株产植酸酶能力是野生型菌株的3.3倍。

Mandviwala和Khire(2000)在发酵培养基中添加麦麸、豇豆和椰肉等农作物残留物，以固体发酵方式培养耐热型Aspergillus niger NCIM563，该菌株发酵产生的植酸酶具有良好的耐热性。

基因工程的发展更为植酸酶的研究与利用提供了一条新的有效途径。

1990年，美国Panlabs公司和芬兰Alko公司合作研究，获得了第一株黑曲霉来源产生植酸酶的基因工程菌。

1991年，世界上第一个商业化的植酸酶投入市场，其来源是无花果曲霉菌。

目前植酸酶基因已成功在原核生物(大肠杆菌等)和真核生物(毕赤酵母和酿酒酵母等)中表达。

Miksch等(2002)构建了一种高效分泌表达的大肠杆菌系统，使大肠杆菌来源的植酸酶成功导入该系统并实现胞外表达。

Li等(2009)分离As-peigillus ficuum中的植酸酶基因，并将该基因转入酿酒酵母，使植酸酶蛋白在酿酒酵母系统中成功表达。

1.2植酸酶基因在植物中的表达
近几年来，植物植酸酶基因工程发展迅速，与微生物基因工程相比，植物基因工程生产条件简单、生产成本低，活性高，并能通过杂交稳定遗传给下一代。

研究表明，谷物种子能在室温下储存多年，并且表达出的重组蛋白不会丧失活性，因此植物有利于在基因工程中生产重组蛋白(Naqvi et al.,2011)。

Liu 等(2006)把植酸酶基因转入大米并对转基因植酸酶大米进行研究，发现成熟种子和叶中的植酸酶含量都比非转基因野生型大米高。

Gao等(2007)将植酸酶基因(GenBank accession No.DQ192035)直接导入大豆中，得到最高酶活为150U/mg的蛋白，是对照组非转基因大豆的2.7倍，大大提高了植酸酶的活性。

2转植酸酶玉米的相关研究
2.1植物基因转化受体系统构建
植物受体系统构建是植物转基因成功的关键。

玉米基因转化受体体系应具备再生能力高效稳定、遗传稳定性好、外植体来源稳定、对选择性抗生素敏感等条件(沈亚欧,2005)。

Gollovkin等(1993)将gus 基因转到玉米原生质中，分化出再生植株。

但由于原生质体分化再生植株在很大程度上依赖于基因型，一定程度上限制了玉米转基因工程的发展，因此以原生质体为受体系统已很少应用。

目前用于玉米基因转化的受体系统主要有外植体、胚性愈伤组织、胚性悬浮培养细胞、幼嫩子方和花粉等。

董云洲等(1999)用基因枪法将β-葡萄醛酸苷酶基因射入谷子和玉米的花粉，经人工授粉获得种子，Southern杂交检测结果表明有外源基因的整合与表达，转基因谷子和玉米的转化率为0.18%和0.05%~0.21%。

2.2转化方法
植物遗传转化技术是指利用重组DNA技术、组织细胞培养技术、基因转移技术或种质转化等技术，
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将外源基因导入植物细胞，获得转基因植物的技术。

它是利用基因工程改良植物性状的重要步骤，在生产实践中起关键作用。

Fromm等(1986)首次用电击法将抗除草剂pat基因转入玉米原生质体中，此后对玉米转基因技术的研究发展迅速。

目前应用的转化技术有基因枪法、农杆菌介导法、花粉管通道法、PEG 介导法、子房注射法、超声波法、阳离子转化法和电击法等，转基因植酸酶玉米研究中应用的转化方法主要有基因枪法和花粉管通道法。

中国农业科学院的研究者将黑曲霉来源的phyA2基因通过基因枪法转化至玉米，研究结果表明，转基因植株植酸酶表达量是野生型菌株的30倍，并能分泌到玉米植株根组织周围，高效利用植酸磷(张琪等,2010)。

于新芬(2003)用基因枪法将黑曲霉N25植酸酶phyA基因导入玉米愈伤组织，成功分化出转基因植株。

邹立扣(2004)的研究结果显示枯草芽孢杆菌植酸酶基因能在大肠杆菌中表达，同时构建了玉米表达载体并用基因枪法成功转化玉米愈伤组织。

刘欣芳(2003)则采用花粉管通道法对选定的玉米品种进行转化，研究结果显示花粉管通道法转化玉米的成功率与种子所处的位置有关，玉米授粉后20h左右是最佳的转化时间。

王永峰(2004)研究了利用花粉管通道法将无载体、无标记的植酸酶基因线性化元件转化玉米系统，检测后初步证明外源基因已整合到玉米基因组中。

2.3外源基因的表达
植物基因工程发展的过程中，有研究表明植物中约30%的转基因实验都发现了基因沉默现象(Grant,1999)。

基因沉默影响了外源基因在转基因植株中的表达水平与活性，因此需要通过选择有效的启动子和增强子及改造外源基因的密码子组成等手段提高外源基因在植物中的表达水平，获得稳定表达的植株。

Christensen等(1992)将玉米ubiquitin基因的第一个内含子置于启动子下游，增强了外源基因在单子叶植物中的表达。

徐子勤等(2004)用玉米Ubi-1启动子驱动外源基因，得到了外源基因拷贝数较低的玉米植株，避免基因沉默现象发生，有利于外源基因表达。

2.4转植酸酶基因玉米的研究现状
2010年，中国农业科学院独立研发出拥有自主知识产权的粮食作物——
—转植酸酶基因玉米，并获得农业部正式颁发的农业转基因生物生产应用安全证书。

这是我国首次为转基因粮食作物颁发安全证书，标志着转植酸酶基因玉米从此正式跨入产业化阶段。

Chen等(2008)以玉米植株Hi-域和源于Asperg-illus niger的phyA2为研究对象，构建质粒pSPHP33 03T-phy转入玉米种子中。

Western blot分析结果显示，因糖基化作用的影响，以玉米为载体表达植酸酶的蛋白分子量比在酵母中表达的蛋白分子量小。

转基因玉米种子中植酸酶的活力约为2200U/kg，是对照组非转基因玉米的50倍，并且转基因玉米产生植酸酶的能力能稳定遗传至第4代。

四川农业大学研究人员将phyA基因导入玉米种子培养，7株中有4株能成功表达植酸酶基因，其中植酸酶酶活最大值增加了60.85%，无机磷含量增加了47.84%(Shen et al., 2008)。

蒲凌奎(2009)以转植酸酶基因玉米种子为试验材料，将转基因玉米产生的植酸酶纯化后研究酶学性质，研究结果表明：最适pH为5.8，与在酵母表达系统中一致；在pH2.0~8.0之间均较为稳定；最适温度为45℃；80℃时热稳定性优于酵母表达的植酸酶。

对酶反应动力学进行研究，表明转基因玉米表达的植酸酶对底物的亲和力较高，但最大反应速度相对较低。

杨文竹等(2008)也研究了转植酸酶基因玉米种子的在消化道中的稳定性。

研究人员通过在体外建立胃和肠两种模拟消化系统模型对植酸酶蛋白稳定性进行研究，结果表明植酸酶蛋白在模拟胃液中极难被消化，可稳定存在，在模拟肠液中可被消化，即该转基因玉米中植酸酶能正常发挥其功能。

3转植酸酶基因玉米的检测方法和安全性
3.1转基因作物的检测技术
1983年第一株转基因作物问世以来，转基因作物不仅商业化种植面积迅速增加，而且品种也日益丰富，中国、欧盟、日本和韩国等国家和组织纷纷制定相应的法律和法规要求对转基因作物和加工食品进行标识，这就需要建立一套简捷准确的检验技术以满足日常检测要求。

国际上常用的检测方法有两大类，外源蛋白检测和核酸检测。

外源蛋白的检测方法有酶联免疫吸附法(ELISA)、试纸条检测和West-ern杂交等，其原理主要是从待测样品中按照一定的程序抽提含有目的蛋白的基质，利用抗体与目的蛋白(抗原)特异结合的特性，通过偶联抗体与抗原抗体复合物的作用产生可检测的信号。

核酸检测方法主要有核酸分子杂交技术(sourthern blot)、PCR检测技术和基因芯片技术三种，其中PCR法是最主要、最准确的方法，它又包括定性PCR方法、复合PCR方
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基因组学与应用生物学Genomics and Applied Biology
法、巢式PCR方法、竞争性定量PCR方法和荧光定量PCR方法等。

董琼珠等(2006)用脉冲电泳技术检测抗除草剂玉米，系统分析脉冲电泳技术介导玉米转基因整合和表达规律。

刘烜等(2009)研究了转基因玉米的DNA检测芯片，该方法具有较好的特异性和重复性，检测灵敏度可达0.1%。

利用基因芯片检测方法结合多重PCR，武海斌等(2009)在同一张芯片上同时有效地检测及鉴定多种转基因玉米，提高了检测的准确率和效率。

3.2转植酸酶玉米的安全性评价
2008年奥地利科学家研究表明转基因玉米会影响小白鼠生育能力，意大利科学家证实了转基因玉米对于小白鼠免疫系统有威胁(Finamore et al.,2008)，2010年中粮进口转基因玉米被深圳检验检疫局作退货处理，再次引发了社会对转基因食品的关注。

转基因食品在进入流通市场前需要进行一系列动物试验，需要按照EPA和FDA的相关规定对转基因作物或食品进行检测，一些食品与营养学专家认为通过生物基因技术生产的食品与其它食品一样安全或者安全系数更高(Chassy,2008)。

因此，转基因植酸酶玉米的推广对动物、人体健康和环境等产生怎样的影响，实验室研究能否推广至产业化生产，关键问题是建立一套科学的安全评价机制。

我国对农业转基因生物实行分级分阶段安全评价制度，评价按照实验研究、中间试验、环境释放、生产性试验和申请领取安全证书五个阶段进行。

转植酸酶基因玉米经安委会安全评价和农业部批准，2004~2005年在山东省进行了中间试验，2006年进行了环境释放，2007~2008年进行生产性试验。

2009年8月，经农业部综合评价并批准，转植酸酶基因玉米获得山东省生产应用安全证书。

评价转基因作物安全性的过程中，一方面要对新型食品的潜在毒性、过敏反应测试，另一方面则要考虑基因在转入其它生物的过程中可能发生的转变(Kleter and Kuiper,2002)。

植酸酶广泛存在于玉米、小麦、水稻和大豆等粮油作物中，人类或动物有长期安全食用或饲用植酸酶的历史。

微生物和转基因微生物发酵生产的植酸酶作为饲料添加剂也已有多年安全应用的记录。

在此基础上，研究人员对转植酸酶基因玉米的急性毒性、大鼠90d喂养、植酸酶蛋白质毒性和致敏性的生物信息学分析、体外模拟胃肠液消化稳定性、与过敏人群的血清交叉反应试验和关键营养成分等检测，结果表明，转基因植酸酶玉米对哺乳动物无不良影响。

国家转基因生物安全委员会评价认为，现有的食用安全试验已充分证实转基因植酸酶玉米与非转基因对照玉米同样安全。

4展望
植酸酶作为饲料添加剂在我国的推广使用有着极为重要的意义。

我国每年从畜禽粪便中排出的磷就达2.5×106t之多，是江河水域富营养化污染的罪魁祸首之一，其主要原因是饲料中的磷没有得到有效利用。

植酸酶的使用将使畜禽粪便中磷的排出量减少40%~75%，则我国磷年排放量减少约1.8×106t，将大大减轻对环境的污染。

因此在微生物基因工程生产植酸酶产品的基础上，通过生物技术和传统育种方法相结合，培育产生植酸酶活性高、外源基因能稳定遗传的转基因植酸酶玉米具有重要的研究意义。

同时，植物是一种多样化、低成本和可再生的生物资源，不仅为人和动物提供了生存所需的各种食物，还提供了大量非食用性的化工产品。

生物技术特别是基因工程研究领域内的快速发展拓宽了植物的应用范围。

目前，发达国家利用植物生物反应器已成功生产出许多高新生物技术产品，如特殊的饱和或不饱和脂肪酸、改性淀粉、环糊精或糖醇、次生代谢产物、工农业用酶以及药用蛋白多肽。

我国农科院范云六院士经过多年研究，培育出的转植酸酶基因玉米是全球第一例通过绿色农业生产模式替代工业生产的低碳农业典范，在21世纪绿色经济时代显得意义重大。

同时，新一代转基因生物和农业产品向着环境友好、营养平衡和节能生产方向发展，转植酸酶基因玉米对此具有引领作用，将积极促进低碳经济发展。

它的产业化将是我国植物基因工程产业化进程中的重要里程碑，是我国继转Bt基因抗虫棉后又一有巨大发展潜力的农业高科技新兴产业，对促进饲料及养殖业的可持续发展、提高我国玉米种业的国际竞争力影响深远，并使我国在农业生物技术产业化的国际竞争中占有一席之地，转植酸酶基因玉米的推广应用有着巨大的潜力和光明的前景。

作者贡献
熊建文在资料收集、论文写作和修改方面做了大量工作；彭端在本文的数据处理和论文写作上作了重要贡献；覃晓娟在论文修改上作了重要贡献；王继瑞负责资料收集和英文摘要写作的工作。

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致谢
本文是在王维熙教授的悉心指导下完成的，同时得到余彦妮、谢柳和李双喜等的大力支持和热情帮助，在此对他们表示衷心的感谢！
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