猪MSTN基因敲除载体的构建

猪MSTN基因敲除载体的构建
李景芬;袁野;于浩;刘娣
【摘要】MSTN基因在成年动物所有骨骼肌中都可检测到表达,其突变或缺失会导致肌肉量的增加.根据已知的MSTN序列设计引物,通过PCR的方法获得了同源臂序列,同源长臂5 382 bp,包括全部的外显子1、2,同源短臂844 bp,包括部分外显子3,在含有正负筛选标记基因的载体上插入上述2个同源臂,构建完成了替代型猪MSTN基因敲除的打靶载体--ploxpⅡ-MSTN,为后续获得MSTN基因缺失型细胞株奠定了试验基础.
【期刊名称】《江苏农业科学》
【年(卷),期】2008(000)001
【总页数】3页(P45-47)
【关键词】猪;MSTN基因;基因敲除;打靶载体
【作者】李景芬;袁野;于浩;刘娣
【作者单位】湖州师范学院,浙江湖州,313000;公安部警犬技术学校,辽宁沈
阳,110034;东北农业大学,黑龙江哈尔滨,150030;黑龙江省农业科学院,黑龙江哈尔滨,150086
【正文语种】中文
【中图分类】S828.2
肌肉生长抑制素(myostatin，简写为MSTN) 作为一种骨骼肌生长、分化的负调控
因子[1-2]，是在研究转化生长因子-β(TGF-β)超家族时，以小鼠基因组DNA为模板进行PCR扩增而得到的一种新的生长因子，命名为生长因子8(GDF-8)[3]。

MSTN与动物骨骼肌总量的调节有关，其功能的缺失会造成骨骼肌异常肥大[4]。

在肉牛中，MSTN基因保守功能区突变与牛的产肉量密切相关，该突变纯合体及杂合体肉牛均表现出肌肉发达、初生重增加和生长速度快的优势[5]。

用基因打靶敲除GDF-8基因制备的基因缺失小鼠，其骨骼肌重量是普通小鼠的2倍以上[6]，而脂肪并未随之增加[7]。

引进的“双肌臀”瘦肉型猪如杜洛克、大白、长白等的后躯亦十分发达，表现出类似双肌牛的现象。

推测MSTN基因亦可能是控制猪骨骼肌发育的功能基因之一。

MSTN基因在成年动物所有骨骼肌中都可检测到表达[8]，但表达量的多少与年龄有直接关系。

猪胚胎发育过程中，胚胎21 d MSTN mRNA在骨骼肌表达量很大[9]。

本研究设计并构建了猪MSTN基因部分intron2和exon3区域进行敲除的替代型打靶载体，为通过基因敲除技术来研究该基因在猪上的功能以及获得敲除该基因的转基因猪研究奠定了基础。

1 材料
1.1 试验动物
长白猪由哈尔滨市华达饲料公司种猪厂提供。

1.2 质粒、菌株
pMD18-T为宝生物工程有限公司产品，ploxpⅡ由北京医学科学院生物工程研究所杨晓博士惠赠，pBluescriptⅡSK(+)为Stratagene公司产品，E. coli Competent Cells JM109由自己实验室保存。

1.3 工具酶、试剂盒及其他试剂
限制性内切酶XbaⅠ、SalⅠ、Bam H Ⅰ、NotⅠ和XhoⅠ均购于宝生物工程有限公司；TaKaRa DNA Ligation Kit(Code No. D6022)，TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No. DV805A)，TaKaRa DNA Fragment
Purification Kit(Code No. DV807A)，Marker(如λ-Hind Ⅲ DNA Marker、pUC119 DNA Marker、DNA Marker DL 15 000、DNA Marker DL 2 000)、蛋白胨、琼脂糖等试剂分别购自Sigma、TaKaRa等公司；其他化学试剂均为分析纯。

2 方法
2.1 同源臂的获得
长白猪基因组按酚-氯仿法抽提。

引物按GenBank上的序列设计。

同源长臂扩增
得到5 382 bp，包括全部的exon1和exon2，引物序列为LS：5′-GCTGACATTATCCTCTTGG-3′，LA：5′-CAATCACTTTCCTACCCTAA-3′。

同源
短臂扩增得到844 bp(长度较短，目的是便于打靶后的PCR鉴定)，包括部分的exon3，引物序列为SS：5′-TGGATGGGACTGGATTATTGC-3′，SA：5′-AACACCAGCCATTCAGCCTATT-3′。

2.2 打靶载体的构建方案
2.2.1 ploxpⅡ载体的结构ploxpⅡ载体由正向选择基因neo的表达元件、负向选
择基因HSV-tk的表达元件以及质粒骨架组成。

2.2.2 同源短臂连入ploxpⅡ载体的方案同源短臂与pMD18-T载体相连后用
XbaⅠ/SalⅠ双酶切，同时ploxpⅡ也用XbaⅠ/SalⅠ双酶切，再将两个酶切产物
相连就实现了同源短臂与ploxpⅡ载体的相连，即ploxpⅡ-SA。

2.2.3 同源长臂连入ploxpⅡ载体的方案同源长臂和pMD18-T载体相连后用
Bam H Ⅰ/SalⅠ双酶切，同时pBluescriptⅡSK(+)也用B am H Ⅰ/SalⅠ双酶切，再将两个酶切产物相连，连接所得的产物再用NotⅠ/XhoⅠ双酶切，同时
ploxpⅡ-SA也用NotⅠ/XhoⅠ双酶切，再将两个酶切产物相连就实现了同源长
臂与ploxpⅡ-SA的相连，从而猪MSTN基因敲除载体——ploxpⅡ-MSTN就构建好了。

3 结果
3.1 克隆的分析及验证
同源长臂和pMD18-T连接后的酶切和PCR鉴定见图1、图2。

同源短臂和
pMD18-T连接后的酶切和PCR鉴定见图3、图4。

同源长臂和
pBluescriptⅡSK(+)连接后的酶切和PCR鉴定见图5、图6。

同源短臂和
ploxpⅡ连接后的酶切和PCR鉴定见图5、图7。

同源长臂和ploxpⅡ连接后的酶切和PCR鉴定见图6、图8。

3.2 打靶载体的组成
猪MSTN基因敲除载体的结构由两个同源臂、正向选择基因neo的表达元件、负向选择基因HSV-tk的表达元件以及质粒骨架组成。

同源重组的简略过程见图9，载体的线性化由NotⅠ来完成。

4 讨论
MSTN基因是TGF-β超家族的一员，完整的基因组包括一个长的开放阅读框，具有3个外显子，2个内含子。

外显子1(编码区)含373 bp，外显子2含374 bp，外显子3(编码区和终止密码子)含381 bp，内含子1含1 808 bp，内含子2含1 977 bp[10]。

比利时蓝牛MSTN基因发生了突变，在外显子3上缺失了11个核
苷酸，导致MSTN基因缺失102个氨基酸[3]，因而翻译出的是一个不完整蛋白质，不能发挥抑制肌肉生成的生物学功能，从而表现出双肌症状。

体外定点突变MSTN基因小鼠的研究显示，MSTN基因突变纯合体小鼠不仅可成活和生育，而
且个体较同窝杂合体及野生型小鼠大30%左右[1]。

由此推测该基因很可能与猪的
肌肉生长有关。

以该基因作为基因敲除的靶序列，将是运用基因敲除技术研究该基因对猪肌肉生长作用的先决条件，也为以后获得敲除该基因的转基因猪奠定了基础。

本试验在整个打靶载体构建的设计上都围绕这一思路进行，如同源臂的选取，既要在长度上符合打靶载体的要求，又要破坏该基因的功能区。

该载体的构建以及以后猪MSTN基因功能的研究和基因敲除技术的应用渴望为猪的育种开辟一条快速可
行之路。

【相关文献】
[1]McPherron A C,Lawler A M,Lee S J. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-β superfamily member[J]. Nature,1997,387:83-89.
[2]McPherron A C,Lee S J.GDF-3 and GDF-9:Two new member of the transforming growth factor-β superfamily containing anovel Pattern of cysteines[J].J Biol Chem,1993,268:3444-3449.
[3]McPherron A C,Lee S J.Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(32):12457-12461.
[4]Lee S J, McPherron A C.Myostatin and the control of skeletal muscle mass[J]. Curr Opin Genet Dev,1999,9(5):604-607.
[5]Casas E,Keele J W,Fahrenkrug S C，et al. Quantitative analysis of birth,weaning,and yearling weights and calving difficulty in Piedmontese crossbreds segregating an inactive myostatin allele[J]. J Anim Sci,1999,77(7):1686-1692.
[6]Hamrick M W,McPherron A C,Lovejoy C O.Bone mineral content and density in the humerus of adult myostatin-deficient mice[J]. Calcified Tissue International,2002,71(1):63-68.
[7]Yamanouchi K,Soeta C.Expression of myostatin gene in regenerating skeletal muscle of the rat and its localization[J]. Biochem Biophys Res Commun,2000,270(2):510-516.
[8]McPherron A C,Lee S J.Growth factor cytokines[J]. Health Dis,1996,18:357-393.
[9]Li C Y,Suardet L,Little J B.Myostatin inhibits cell Proliferation and protein synthesis in
C2C12 muscle cells[J]. Biol Chem,1995,270:4971-4974.
[10]Stratil A, Kopecny M. Genomic organization,sequence and polymorphism of the porcine myostatin gene[J]. Animal Genetics,1999,30(6):468-470.。