色谱法基础

12.1.2色谱法分类



按流动相：液相色谱（LC）；气相色谱（GC）；超临界流体色谱（SFC） 按固定相形状：柱色谱；平面色谱（纸色谱、薄层色谱） 按固定相聚集态及利用原理：
名称
液液色谱法 键合相色谱法 LC 液固色谱法 离子交换色谱法 体积排除色谱法 气液色谱法 GC 键合相色谱法 气固色谱法
12.3.3分离度
塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分 离程度。即柱效为多大时，相邻两组分能够被完全分离。 难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综 合影响： 保留值之差 ──色谱过程的热力学因素； 区域宽度W──色谱过程的动力学因素。 色谱分离中的四种情况如图所示：
② △K不是很大，柱效较高， 峰较窄，基本上完全分离； ③柱效较低，，△K较大,但分 离的不好；
12.4色谱定性和定量分析
12.4.1色谱定性方法
1.利用纯物质定性的方法
一定的色谱操作条件下，同一物质 具有固定的保留时间。 试 注意可能在相同条件下有不同的物 样 质保留值相同。 利用保留值定性：通过对比试样中 具有与纯物质相同保留值的色谱峰 1 4
，来确定试样中是否含有该物质及
在色谱图中的位置。 不适用于不同仪器上获得的数据之 间的对比。 标 样
二.柱分离效能指标
柱效能是色谱柱在色谱分离过程中只由动力学因素所
决定的分离效能，通常用理论板数n、理论板高H、或有
效板数neff表示。
H=L/n
对L一定的色谱柱，板高越小，塔板数越多，柱效能 越高。
12.3.2速率理论
由于柱内很难真正达到平衡，随组分在柱内的迁移， 组分谱带宽度会逐渐增加，称为谱带扩张。
①，柱效较高，△K(分配系数) 较大,完全分离；
④ △K小，柱效低，分离效果 更差。
分离度的定义：
R=0.8：两峰的分离程度可 达89%； R=1：分离程度98%； R=1.5：达99.7%（相邻两 峰完全分离的标准，基 线分离）。 注：对分离度的讨论要求相邻两色谱峰基本对称。 引入相应近似条件分离度可有多种表达式：
2.校正因子 f
检测器对个组分的灵敏度不同，因此对峰值必须经过校正。 相对响应值S： Si =（A i / mi）/ （A S / mS） 定量校正因子与检测器相对响应值成倒数关系： f i = 1 / Si 试样中各组分质量与其色谱峰面积成正比，即： m i = fi · i A FID——正庚烷 TCD——苯 测定f值，试剂必须为色谱纯级; 若引用文献值则检测器类型和操作条件必须一致。
k ＇大，滞留时间长。
12.3色谱基础理论
12.3.1塔板理论
一.基本假设 1.从统计的观点，组分在两相的分配平衡 可在一小段色谱柱内形成，即一个理论塔 板，高为H。 2.长为L的色谱柱由一系列塔板顺序排列 组成，柱内各处板高为常数，柱内有 n=L/H个塔板。 3.组分的分配系数在确定温度下为常数。
4.分离因子 α 相同条件下，两相邻组分调整保留值之比 α =tR ＇（2）/ tR ＇（1）= VR ＇（2）/ VR ＇（1） （α≥1）
13.2.3峰宽
用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种 表示方法： 1.标准偏差（ ）：即0.607倍峰高处 色谱峰宽度的一半。 2.半峰宽（W1/2）：色谱峰高一半处 的宽度 W1/2 =2.354 3.峰底宽（Wb）：Wb=4
df固定液液膜厚度
DL组分在固定液中扩散系数
载气流速与柱效-最佳流速
H = A + B/U + C· U
可见A与U无关，U有一最佳取值使H最小。
载气流速高时： 传质阻力项是影响柱效的主要 因素，随着流速的提高，柱效 下降。 载气流速低时： 分子扩散项成为影响柱效的主 要因素，随着流速的增加，柱 效提高。 H - U曲线与最佳流速： 由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使 得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一 阶导数有一极小值。以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低 点的流速即为最佳流速。
3.定量分析方法 外标法： 外标法也称为标准曲线法。
特点及要求：
外标法不使用校正因子，适用于大批量试样的快速分析； 操作条件变化对结果准确性影响较大； 对进样量的准确性控制要求较高。
内标法：
内标物要满足以下要求：
（1）试样中不含有该物质；
（2）与被测组分性质比较接近
（3）不与试样发生化学反应
（4）出峰位置应位于被测组分附近，且对组分
峰无影响 试样配制：准确称取一定量的试样m，准确加入一 定量内标物mS
特点： 1、内标法的准确性较高，操作条件和进样量的稍许 变动对定量结果的影响不大。 2、每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大 批量试样的快速分析。
2
3
利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰
的相对变化
2.利用文献保留值定性 相对保留值r21：相对保留值r21仅与柱温和固定液性质有关 ，与其它操作条件无关。在色谱手册中都列有各种物质在不同 固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。 该法涉及参比样的选取，一般选易于得到纯物。且与测试 组分保留值相近又能完全分离的物质。
第十色谱法
俄国植物学家茨维特在1903年使用的装置： 色谱原型
色谱法是一种分离技术， 试样混合物的分离过程也就是试样中各组分 在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着 的分配过程， 其中的一相固定不动，称为固定相； 另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体 （气体或液体），称为流动相。 当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与 固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在 性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作 用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动， 混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使 得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一 定次序由固定相中流出。与适当的柱后检测方 法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。 两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础。
程度用H表示，H越大谱带扩张越严重。
塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下
柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素 及提高柱效的途径。
速率理论为色谱分离和操作条件的选择提供了理论
指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。
一.影响谱带扩张的因素 1.扩散
1）分子（纵向）扩散：由于 浓度梯度造成。 2）涡流扩散：由于路径差别 引起。取决于填充物粒度，均 匀性，只在填充柱中存在。
二.速率理论方程简介
将造成谱带扩张的动力学因素联系起来建立偏微分方程，解出 速率理论方程，以板高H和流动相线速率U关系式来表达。
1.van Deemter方程
适用于填充柱气液色谱
H = A + B/U + C· U
A─涡流扩散项：
A = 2λ dp
dp：固定相的平均颗粒直径 λ ：固定相的填充不均匀因子
3.利用保留指数定性 保留指数（Ⅰ），是一种重现性较好的定性参数。 测定方法： 将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原 子个数乘以100（如正己烷的保留指数为600）。 其它物质的保留指数（IX）是通过选定两个相邻的正 构烷烃，其分别具有Z和Z＋1个碳原子。被测物质X的调 整保留时间应在相邻两个正构烷烃的调整保留值之间如 图所示：
I X 100 Z [
lg t' , X lg t' , Z R R lg t' , Z 1 lg t' , Z R R
]
4.与其他分析仪器联用的定性方法 小型化的色质谱联用仪； 色谱-红外光谱仪联用仪； 结构鉴定。
12.4.2色谱定量方法
依据：一定操作条件下，检测器的响应值与进入检测器的 组分的量成正比。
3）流型（径向）扩散：空心 柱中流动相的流动呈抛物线分 布。（填充柱中也存在）
2.传质阻力
组分在流动相和固定相间分配必然有分子在两相间 交换、扩散的过程，称为传质。 组分在两相间分配不能瞬时完成，妨碍组分快速传 递以达成平衡，导致有限传质速率叫传质阻力。 1）流动相传质阻力：组分分子由流动相内部到两相 界面的扩散过程中。 2）固定相传质阻力：组分分子由两相界面到固定相 内部进行分配又返回两相界面的过程中。 3）停滞流动相传质阻力：部分流动相停滞在固定相 颗粒间，组分分子在两相间传递时通过这部分流动 相时造成。
1.峰值的测量
对称峰：
A = 1.064 h· 1/2 W 不对称峰：可在峰高0.15和0.85处分别测定峰宽，由下式计 算峰面积：
A = h· （W 0.15 + W 0.85 ）/ 2 峰高乘保留时间法：在一定操作条件下，同系物的半峰宽 与保留时间成正比，对于难于测量半峰宽的窄峰、重叠 峰（未完全重叠），可用此法测定峰面积： A = h· tR b· 自动积分和微机处理法：
固定相
固定液涂渍于载体 化学键合相 固体吸附剂 离子交换剂 化学惰性的多孔物质 固定液涂渍于载体 化学键合相 固体吸附剂
主要分离原理 分配作用
吸附作用 离子交换作用 分子筛作用 分配作用 吸附作用
13.1.3色谱法特点
1. 分离效率高： 复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。 2. 灵敏度高： 可以检测出μ g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量. 3. 分析速度快： 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。 4. 应用范围广： 适用各种有机或无机试样及生物活性物质的分析。
2.Golay方程
适用于毛细管柱色谱
H = B/U + Cg· + CL· U U
3.Giddings方程
适用于液相色谱
H = A + B/U + Cm· s· + Csm· U+C U U
组分分子在液相中的扩散远小于在气相中的扩散，因 此液相色谱中，传质阻力是影响H增大的主要因素。可 降低流动相粘度的方法提高柱效能。
12.2.4分配系数和容量因子
1.分配系数K：平衡时，组分在固定相S与流动相 m间的浓度比； K=cs/cm 反映了组分与两相间相互作用的大小。K大则 滞留时间长。 2.容量因子k ＇ ：平衡时，组分在固定相S 与流动相m中总的质量比；
k ＇ =(cs Vs )/ (c mVm) = K Vs / Vm = tR ＇ / tM
固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。 表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。
B/U—分子扩散项：
B = 2rDg


U：载气线流速
r ：曲折因子，反映固定相颗粒间空间结构，填充柱色谱 r=0.5-0.15，空心柱r =1。
Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2·-1） s
扩散系数：Dg ∝（M载气）-1/2 ； M载气↑，B值↓。


存在着浓度差，产生纵向扩散， 扩散导致色谱峰变宽，H↑(n↓)，分离变差。 分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑，
C · U──传质阻力项： 传质阻力包括气相传质阻力 Cg和液相传质阻力CL即： C =（Cg + CL）
2.用体积表示的保留值
死体积（VM）： VM = tM ×Fc ，
（ Fc为流动相的体积流速，单位：m L / min。） 即不被固定相滞留的组分从进样到最大峰所需的流动相体积。
保留体积（VR）：VR = tR×Fc ，
即组分从进样到最大峰所需的流动相体积。 调整保留体积（VR＇）： V R＇= VR －VM = tR ＇×Fc 3.相对保留值ris 在相同操作条件下，组分i与参比组分s调整保留值之比： ris = tRi ＇/ tRs ＇= VRi ＇/ V Rs ＇ 相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无 关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。
12.2色谱图和有关术语
12.2.1色谱图
峰
基线
峰底
峰高
峰面积
12.2.2保留值
1.时间表示的保留值
死时间（tM）：不与固定相作用的组分（如空气）从进样到出 峰最大值所需时间，即流动相流经色谱柱的平均时间。 保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时 间，即组分谱带通过色谱柱的平均时间。 调整保留时间（tR ＇）：tR ＇= tR－tM ，即组分在固定相上的平 均滞留时间。