园艺植物生物技术课后习题答案

园艺植物⽣物技术课后习题答案
第⼀章⾄第五章
⼀、主要名词和概念：
⼀．
1. 植物细胞全能性：植物体的每⼀个具有完整细胞核的细胞都具有该物种全部遗传物质，
在⼀定条件下具有发育成为完整植物体的潜在能⼒。

2. 脱分化：将已分化的不分裂的静⽌细胞放在培养基上培养后，细胞重新进去分裂状态，
⼀个成熟细胞转变为分⽣状态的过程。

3. 再分化：经脱分化的组织或细胞在⼀定的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型，形
成完整植株的过程。

4. 器官发⽣途径：由外植体或愈伤组织诱导形成不定根或不定芽，再获得再⽣植株的⽅法
5. 体细胞胚胎发⽣途径：在组织培养中起源于⼀个⾮合⼦细胞，经过胚胎发⽣和胚胎发育
过程，形成具有双极性的胚状结构⽽发育成再⽣植株的途径。

6. 外植体：由活体植物体上切去下来的，⽤于组织培养的各种接种材料。

包括各种器官、
组织、细胞或原⽣质体等。

7.褐化现象：指在外植体诱导初分化或再分化过程中，⾃⾝组织从表⾯想培养基释放褐⾊
物质以⾄培养基逐渐变成褐⾊，外植体也随之进⼀步变褐⽽死亡的现象。

8. 看护培养：利⽤活跃⽣长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的培养⽅法。

9. 分批培养；把细胞分散在⼀定容积的培养基中培养，当培养物增值到⼀定量时，转接继代，建⽴起单细胞培养物。

10. 连续培养：利⽤特质的培养容器进⾏⼤规模细胞培养的⼀种培养⽅式。

11. 体细胞杂交：使分离出来的不同亲本的原⽣质体，在⼈⼯控制条件下，相互融合成⼀体，形成杂种细胞，并进⼀步发育成杂种植株的技术。

12. 雄核发育：在适宜的离体培养条件下，花粉（⼩孢⼦）的发育可偏离活体时的正常发育转向孢⼦体发育，经胚状体途径或器官发⽣途径形成完整植株。

13. 雌核发育：以未受精⼦房或胚珠为外植体诱导单倍体的⽅法。

14. ⾮整倍体：⽣物体的核内染⾊体数不是染⾊体基数整数倍，⽽发⽣个别染⾊体数⽬增减的⽣物体。

15. 代换系：⽣物体的染⾊体被异源种属染⾊体所代换的品系。

16. 易位系：某染⾊体的⼀个区段移接在⾮同源的另⼀个染⾊体上，具有发⽣染⾊体易位的品种。

17. 附加系：将同种或异种的染⾊体导⼊受体中，叫做染⾊体附加。

具有附加染⾊体的品种或品系叫附加系。

18. 限制⽣长保存：改变培养物⽣长的外界环境条件，限制离体保存材料的⽣长速度，使细胞⽣长⾄最⼩限度，但不死亡，从⽽达到延长继代培养的⽬的。

19. 超低温保存：指在-80℃（⼲冰温度）⾄-196℃（液氮温度）甚⾄更低温度下保存⽣物材
料。

20. 体细胞⽆性系变异：将植物外植体在组织培养过程中，由于受到⾮⽣物因⼦的诱导发⽣
变异，进⽽导致再⽣植株发⽣遗传变异的现象。

⼆、各章需掌握的主要内容
1.植物组织培养的类型有哪些
（1）按照外植体类型：胚胎培养；器官培养；组织培养；细胞培养；原⽣质体培养（2）按照培养基性质：固体培养；液体培养；
（3）按照培养⽅法：精制培养；震荡培养；看护培养；饲喂培养；微室培养
2.植株再⽣途径主要有哪些
（1）经由成愈伤组织再⽣植株；（2）经由胚状体再⽣植株
3.完整的植物组织培养实验室包括哪些部分每⼀部分具有哪些功能需要配备哪些仪器设备⾃⼰能独⽴设计⼀个组织培养实验室。

（1）准备室，接种室，培养室
（2）A：准备室配置培养基
B：接种室采⽤⽆菌操作把材料接种到培养基上
C：培养室在⽆菌和适宜的培养条件下进⾏培养。

4.培养基的组成成分包括哪些常⽤的植物激素和⽣长调节剂有哪些需掌握化学名称和缩写符号。

（1）⽆机营养，有机营养，植物⽣长调节物质，糖类，⽔，琼脂
（2）⽣长素AUX，细胞分裂素CTK，⾚霉素GA，脱落酸ABA
5.茎尖培养的概念，以种苗繁殖为⽬的的茎尖培养包括哪些阶段各阶段对培养基条件有哪些要求
（1）茎尖培养：把茎尖分⽣组织或包括此分⽣组织的茎尖分离进⾏⽆菌培养。

（2）⽆菌培养体系的建⽴→芽的增殖→中间繁殖体的增殖→诱导⽣根→试管苗的移植（3）⼀般⽤MS培养基，之后根据发育⽅向配制培养基
6.茎尖分⽣组织培养脱毒的原理是什么影响脱毒效果的主要因素有哪些病毒检测⽅法有哪些其他脱毒⽅法还有哪些
（1）感染病毒后，植株体内病毒的分布并不均匀，病毒的数量随植株部位及年龄⽽异，越靠近经顶端的区域，病毒感染率越低，⽣长点则⼏乎不含或含病毒很少。

（2）茎尖⼤⼩，取穗⼤⼩，取样时间，温度，持续时间，湿度和光照，前处理
（3）茎尖培养脱毒，微体嫁接脱毒，热处理脱毒
（4）花器官等培养脱毒，珠⼼胚培养脱毒，合并使⽤热处理、茎尖培养或微茎尖嫁接脱毒
7.种苗离体快繁中污染发⽣的原因主要有哪些如何控制污染的发⽣
（1）A：材料内部灭菌处理不好
B：正常灭菌条件下，内⽣菌能够存活
C：来⾃寄⽣植物的污染
D：培养基中材料超过⼀块相互污染
（2）A：严格保证⽆菌操作的规范性，对培养基接种⼯具及接种室的严格消毒处理B：抗⽣素对细菌操作污染的防治
C：真菌污染的防治
D：常⽤防治污染⽅法
8.原⽣质体分离中材料预处理⽅法有哪些原⽣质体分离常⽤的酶类有哪些原⽣质体如何分离和如何纯化原⽣质体培养⽅法有哪些
（1）低温处理；等渗溶液处理
（2）纤维素酶；半纤维素酶；果胶酶；崩溃酶
（3）A：分离：取材→酶液配制→酶解处理→使酶解后的混合物穿过镍丝⽹B：纯化：①离⼼法：利⽤⽐重原理，低速离⼼使原⽣质体沉于底部
②漂浮法：根据原⽣体与细胞碎⽚或细胞器⽐重的不同来分离原⽣质体
③界⾯法：采⽤两种不同密度的溶液，离⼼后使完整的原⽣质体处在两液
相的界⾯
（4）平板培养法；看护培养法；微室培养法；液体浅层培养法；固-液体双层培养法
9.原⽣质体融合⽅法有哪些杂种细胞如何筛选
（1）A：化学诱导融合：盐类融合法；⾼pH⾼钙离⼦法；PEG法
B：物理诱导融合：显微操作；离⼼震荡；激光照射；电融合
（2）A：显微筛选技术：荧光染料标记，异硫氰酸荧光素（发绿⾊荧光），碱性蕊⾹红荧
光素（发红⾊荧光）
B：互补选择法：利⽤两个亲本具有不同的遗传和⽣理特征，在特定培养条件下，只
有发⽣互补作⽤的杂种细胞才能⽣长的选择⽅法
C：遗传标记筛选技术：基因互补筛选，利⽤隐性⾮等位基因互补筛选体细胞杂种
10.离体⼩孢⼦发育(雄核发育)途径有哪些花粉分离⽅法有哪些影响花药和花粉培养的主要因素有哪些培养适宜时期是哪个时期预处理⽅法有哪些
（1）⼩孢⼦发育途径；营养细胞发育途径；⽣殖细胞发育途径；⽣殖细胞和营养细胞共同发育途径
（2）花粉漂浮⾃然释放法；⼈⼯挤压法；机械法
（3）供体植株基因型；⼩孢⼦发育时期；供体植株⽣理状态；预处理；培养及成分；培养条件；接种密度和⽅向
（4）⼀般来说是⼩孢⼦发育到单核期左右（第⼀次有丝分裂前）
（5）低温；热激；化学药剂；⾼渗透压；离⼼
11.植物染⾊体加倍⽅法有哪些化学⽅法诱导加倍常⽤试剂有哪些影响加倍的因素包括哪些多倍体鉴定⽅法有哪些
（1）机械损伤；各种射线；⾼速离⼼；异常温度
（2）秋⽔仙素；氨磺灵；氟乐灵
（3）外植体；加倍剂类型；加倍剂浓度和处理时间；加倍剂的加⼊时间；助剂
（4）A：形态学鉴定：各⾃独特的外观
B：细胞学鉴定：染⾊体计数法
C：⽣理⽣化鉴定：各种营养物质的含量、酶活性的测定
D：分⼦⽣物学鉴定：分⼦原位杂交；分⼦标记
12.限制⽣长保存⽅法有哪些超低温保存的基本程序是什么
（1）低温保存；⼲燥保存；⽣长抑制保存；⾼渗透压保存
（2）材料准备→预处理→冷冻处理→冷冻储存→解冻→再培养
13.体细胞⽆性系变异的来源有哪些⽆性系变异的发⽣与哪些因素有关
（1）A：外植体细胞中预先存在⽽在再⽣植株中表现出来的变异；
B：组织培养过程中诱导产⽣的变异
（2）A：染⾊体数⽬变异：整倍型变异；⾮整倍型变异
B：体细胞染⾊体结构变异
C：基因突变：核基因突变；细胞质基因突变
D：转座因⼦的活化：转座因⼦的激活也是导致植物体细胞⽆性系⾼频率变异的主要
原因之⼀。

转座因⼦是指能在基因组中移动和修饰基因表达
的DNA序列
E：DNA甲基化状态的改变
第六章园艺植物的染⾊体⼯程
1.园艺植物单倍体制备有哪些途径
答：（1）雄配⼦途径。

采⽤花药培养或花粉培养，使⼩孢⼦改变原来的配⼦体发育途径，转向孢⼦体发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株，从中鉴定出单倍体植株并使之加倍成纯合⼆倍体。

（2）雌配⼦途径。

使园艺植物的胚囊中具有单倍性染⾊体构成的细胞，如未受精的⼦房或胚珠，在适当的条件下发育成单倍体植株。

2.离体条件下，雄（雌）核发育各有哪些发育途径
答：雄核：（1）⼩孢⼦发育途径（2）营养细胞发育途径（3）⽣殖细胞发育途径（4）⽣殖细胞和营养细胞共同发育途径。

雌核：（1）助细胞或胚囊的⽆配⼦⽣殖产⽣单倍体（2）卵细胞、助细胞和反⾜细胞发育产⽣单倍体（3）⾮正常发育的⼤孢⼦四分体产⽣单倍体。

3.试述花药（花粉）培养的全过程及主要影响因素。

答：基本程序应包括外植体选择、预处理、表⾯灭菌、接种、培养、再⽣植株、单倍体植株鉴定、染⾊体加倍及获得纯合⼆倍体等步骤。

影响因素：
（1）供体植株基因型。

（2）⼩孢⼦发育时期。

⼀般来说单核期最适合。

（3）供体植株的⽣理状态。

内源激素⽔平。

（4）预处理。

（5）培养基成分。

（6）培养条件。

温度、光照。

（7）接种密度和⽅向。

4.采⽤秋⽔仙素诱导园艺植物多倍体有哪些⽅法
答：（1）浸种法；（2）浸芽法；（3）滴苗法；（4）涂抹法；（5）套罩法；（6）⽑细管法。

5.创制园艺植物易位系、代换系和附加系分别有哪些⽅法
答：（1）易位系。

包括常规⽅法诱导的辐射诱导和杂交诱导，和组织培养诱导中的胚拯救、细胞培养和原⽣质体培养。

6.试述园艺植物单倍体、多倍体和⾮整倍体的主要鉴定⽅法和辅助鉴定⽅法。

答：（1）形态学鉴定。

⽣长势，分枝数，叶⽚形状、⼤⼩、颜⾊，花蕾数量、形状，果实形状等都可以作为鉴定的依据。

（2）细胞学鉴定。

染⾊体计数法、流式细胞分析法、核型分析法、⽓孔⼤⼩及保卫细胞叶绿体数⽬鉴定法、染⾊中⼼直径和异染⾊质数⽬法、花粉发育过程和花粉活⼒观察法、减数分裂⾏为观察法等。

（3）⽣理⽣化鉴定。

通过对各种营养物质的含量、各种酶活性等⽅⾯的测定来对园艺植物染⾊体⼯程产物进⾏辅助鉴定。

（4）分⼦⽣物学鉴定。

分⼦原位杂交，分⼦标记等。

7.⽬前园艺植物染⾊体⼯程还存在着哪些问题你认为应该如何解决
答：（1）单倍体。

发展相对缓慢，⾄今仍有很多空⽩。

发展⽅向：解决有些物种诱导率、可重复性差，很难实际应⽤的问题；探明通过胚状体途径诱导雄核发育和雌核发育的适宜条件；找到克服花药培养中的⽩化现象，⼆倍体组织的⽣长对单倍体诱导的影响等问题的有效措施。

（2）多倍体。

多倍体基因组发⽣了⼴泛的遗传变化，其基因平衡遭到破坏，存在⼀些缺陷，还有嵌合体问题。

发展⽅向：找出园艺植物各⾃的适宜倍性，研究和解决多倍体的缺陷、嵌合体问题。

（3）⾮整数倍体。

尚处在初级阶段，成果有限。

发展⽅向：努⼒拓展园艺植物的研究范围，加强⽣物技术在园艺植物⾮整倍体制备中的应⽤。

8.你怎么看待园艺植物染⾊体⼯程的前景
第七章植物基因⼯程的基础知识与技术
1.简述DNA双螺旋结构模式的要点及其与DNA⽣物学功能的关系。

答：（1）⽣物的遗传信息储存于DNA的核苷酸序列中；
（2）DNA双螺旋结构的稳定性主要由互补碱基对之间的氢键和碱基堆积⼒来维持；
（3）DNA双链经过盘绕压缩使松弛型DNA更为紧密，体积变得更⼩，在细胞的⽣命活动中更能保持DNA结构稳定。

2.⽐较RNA和DNA在结构上的异同点。

答：（1）基本单位不同，DNA为脱氧核苷酸、RNA为核糖核苷酸
（2）DNA的五碳糖为脱氧核糖，RNA的五碳糖为核糖
（3）DNA的碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶，RNA的为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶
（4）与DNA相⽐，RNA种类繁多，分⼦质量相对较⼩，通常以单链形式存在，RNA没有形成双螺旋，但也可以有局部的⼆级结构或三级结构。

3.试述RNA的种类及其⽣物学作⽤。

答：（1）mRNA。

直接指导蛋⽩质合成。

（2）tRNA。

携带相应的氨基酸将其转运到核糖体上以供蛋⽩质合成。

（3）rRNA。

蛋⽩质合成⼯⼚核糖体的组成成分。

4.基因⼯程常⽤的⼯具酶有哪些
答：（1）限制性内切酶。

⼀类能够识别双链DNA分⼦总某⼀特定核苷酸序列，并能对核酸内部的磷酸⼆酯键进⾏切割的⼀种内切核酸酶。

（2）DNA连接酶。

催化连接分离的DNA⽚段。

（3）DNA聚合酶。

5.质粒载体、柯斯质粒载体、λ噬菌体载体和酵母⼈⼯染⾊体有何异同点
答：（1）质粒是能⾃主复制的双链环状DNA分⼦。

（2）以λ噬菌体DNA为载体构成的重组DNA分⼦必须包装成完整病毒颗粒后才具有感染宿主的能⼒。

经包装后重组DNA分⼦转化率提⾼100-1000倍。

这类载体可以有效克隆15kb ⼤⼩的外源基因。

（3）科斯质粒是⼈⼯构建的，含有λDNA 的粘性(cos)末端序列、质粒复制起始区及质粒⼀个抗药性标记的、兼具质粒与λ噬菌体DNA载体双重性质的特殊载体。

（4）YAC 载体主要是⽤来构建⼤⽚段DNA ⽂库，特别⽤来构建⾼等真核⽣物的基因组⽂库，并不⽤作常规的基因克隆。

6.简述PCR技术的基本原理。

答：根据已知的待扩增的DNA⽚段序列，⼈⼯合成与该DNA两条链末端互补的两段寡核苷酸引物，在体外将DNA模板在酶促作⽤下进⾏扩增。

PCR全过程可分为DNA模板变性、退⽕、延伸三个步骤，经若⼲循环所组成。

⾸先⾼温作⽤使模板DNA变性解链，然后降低温度使引物与模板DNA链退⽕，在TaqDNA 聚合酶作⽤及dNTP底物存在下，引物链将沿着5’～3’⽅向延伸与模板互补的新链，新链则可作为下⼀次反应的模板，因此扩增产物的量以指数级⽅式增加。

通常单⼀拷贝的基因经25~30循环可扩增100万～200万拷贝。

7.核酸分离主要有哪些⽅法
答：DNA的分离：CTAB法，SDS法；
RNA的分离：1）总RNA的提取
苯酚法，异硫氰酸胍法及氯化锂沉淀法
2）mRNA的分离
亲和层析的原理
8.什么是分⼦杂交分⼦杂交的主要技术有Array哪些
答：当带有互补的特定核苷酸序列的单链
DNA或RNA混合在⼀起时，其特定的同源
区段将会退⽕形成双链结构。

可以通过观
察杂种核酸分⼦的形成情况来判断不同
来源DNA的亲缘关系。

Southern杂交：检测经限制性内切核酸
酶切割后的DNA⽚段中是否存在与探针
同源的序列。

Northern杂交：指将RNA变性及电泳分
离后，并转移到固相⽀持物上，⽤杂交反
应来鉴定其中特定mRNA分⼦的含量及其
⼤⼩。

Western印迹：蛋⽩质经过SDS-PAGE后，转移到膜上再与抗体探针结合进⾏检测的⽅法。

菌落原位杂交：将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂解以
释放DNA，将DNA烘⼲固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射⾃显影检测菌落杂交信号，
并与平板上的菌落对位。

第⼋章
1.什么是基因组⽂库简述构建⼤⽚段基因组⽂库的主要步骤。

答：园艺植物基因组⽂库：指的是来⾃园艺植物基因组全部DNA⽚段组成的基因⽂库。

基因组DNA⽂库反映基因组的全部遗传信息。

构建⼤⽚段基因组⽂库的主要步骤：1,载体的制备（包括载体DNA的分离，载体DNA的酶切，载体的脱磷酸化，载体DNA的纯化等步骤）；2.⼤⽚段基因组DNA 的制备；3，⼤⽚段DNA与克隆载体的连接；4，载体的遗传转化；5，克隆的挑取、验证；6，⽂库的扩增、分装及保存。

2.简述合成cDNA第⼆链的主要⽅法。

答：⾃⾝引导合成法、置换合成法、同聚物引导法。

3.简述图位克隆技术的原理及其优缺点。

答：原理：⾸先找到⼀个与⽬标基因相连的DNA分⼦标记，然后通过染⾊体步移技术克隆分离出⽬标基因。

优缺点：到⽬前为⽌,已有多个植物抗病基因通过该技术被分离，但是他们都具有较⼩的基因组、⾼密度的分⼦标记连锁图和较稳定成熟的转化系统。

⽽对于基因组较⼤、重复序列较多的⼀些园艺植物，采⽤图位克隆法分离基因要步移⼤量的DNA⽚段，投资⼤，效率低。

⽽且由于基因组中往往存在⼤量的重复序列，以及被⽤来步移的DNA⼤⽚段插⼊⽂库含有许多嵌套克隆或克隆后的重排现象等原因，染⾊体步移⼗分困难。

4.简述转座⼦标签法的基本步骤及其优缺点。

答:利⽤异源转座⼦分离植物基因的⼀般操作步骤是：1，采取农杆菌介导等适当的转化⽅法把转座⼦导⼊⽬标之五，设法将转座⼦插⼊到⽬标基因内部或邻近位点，引起表型突变。

2，通过表型筛选获得纯合突变株。

3，构建纯合突变株的基因组⽂库。

4，以转座⼦⽚段作为探针，从该基因组⽂库中筛选含转座⼦⽚段的克隆。

5，以该克隆作为探针，筛选另⼀正常植株的核基因组⽂库，获得完整的正常⽬的基因。

优缺点：利⽤转座⼦标签法可在不了解基因产物的⽣化性质和表达模式的情况下分离植物基因，因此该技术已被⼴泛应⽤于植物功能基因的克隆研究，⽬前利⽤该法已经从多种植物中克隆了上百个基因。

但是该技术的前提条件是要筛选出转座⼦插⼊的突变体。

在实际操作中，由于转座频率往往很低，因此需要筛选的突变体群体较⼤。

⽽且，对于那些需在特定环境或特定发育阶段才有突变表型的基因，往往由于看不到明显的突变表型⽽被忽略。

另外，由于基因的功能补偿等机制的作⽤，即使有些基因产⽣了插⼊突变，也可能看不到突变表型，因⽽不能运⽤该⽅法。

5.差异表达基因分离法主要包括哪⼏种⽅法各有何优缺点
答：mRNA差异显⽰(DDRT-PCR)、抑制性消减杂交（SSH）、代表性差异分析（RDA）、基因表达系列分析（SAGE）、cDNA-AFLP技术。

mRNA差异显⽰(DDRT-PCR)：优点：简便、快速、RNA有量少、效率⾼。

主要⽤于⽐较两种以上特定⽣理状态或不同发育阶段的mRNA样品间基因表达的差异。

缺点：1，假阳性特别⾼，增加了后续⼯作难度。

2，由于PCR⾃⾝反应条件的敏感性，mRNA差异显⽰技术重复性较差。

3，扩增⽚段较⼩，不能代表真正差异表达的
基因，且上游的差异表达信息量的不到检测。

4，对⾼拷贝数mRNA有较强的倾向性，不能⽤于反映低拷贝数的mRNA。

抑制性消减杂交（SSH）:优点：1，假阳性率⼤⼤降低；2，⽬的序列富集程度较⾼，且丰度相对⼀致，确保了低丰度表达的cDNA有被检测的可能性极⼤地提⾼了检测效率；3,SSH灵敏度很⾼，重复性强。

缺点：1，需要较多的其实材料的mRNA；2，更多地依赖于PCR技术，不能同时对数个材料进⾏⽐较；3，材料之间存在的过多的差异及⼩⽚段缺失也不能有效地被检测。

代表性差异分析（RDA）：优点：1，免去了物理⽅法分离单、双链的繁琐操作，通过接头“修饰”设计，借助PCR技术即能使⽬的⽚段得到有效扩增，减少假阳性。

2，差减杂交在扩增后的cDNA群体之间进⾏，不再受供试的mRNA量的限制，拓宽了差减杂交的应⽤范围。

3,⼀次实验课分离得到多个在T组和D组间差异表达基因的cDNA克隆，并能发现与表性相关的异常基因，检测基因的上调和下调表达。

缺点：1，⽬的基因间丰度的差异在数轮差减杂交后的群体中保留了下来，在后续的筛选中，⾼丰度的差异基因容易得到，低丰度的差异基因不易检出，⽽低丰度的表达产物往往代表相对重要的基因。

2，分离出来的差异基因也可能与其表型⽆关，增加了后续鉴定的⼯作量。

3，对样品T组和D组的纯度要求很⾼，如果两组材料间差别较⼤，则⽤此⽅法将达不到鉴定差别表达基因的⽬的。

基因表达系列分析（SAGE）：优点：成本低效率⾼，能很灵敏的检测出那些低丰度表达的基因。

缺点：1，只有那些基因库中存储标签所代表的基因才能被鉴定，对未搜索到匹配序列的标签鉴定存在困难，⽽且其效率依赖于现有的序列数据。

2，如果碱基序列发⽣错误，或者扩增效率发⽣变化，也会导致结果失真。

3，该法虽然不需分别测定各cDNA的序列，但⼯作量仍然很⼤，且操作较为繁琐，需要使⽤测序仪，普通实验室⽆法做到。

cDNA-AFLP技术：优点：它可以对⽣物体全部的mRNA样品进⾏筛选，具有重复性⾼、假阳性率低的特点，其可靠性强，重复性可达95%。

⽽且，在转录产物⾼度表达时，扩增条带的强度能准确反映基因间表达量的差别。

缺点：操作过程繁琐，假阳性率有时也较⾼。

6.简述基于同源序列的候选基因法分离⽬的基因的主要⽅法。

答：1，根据已知基因的保守区设计引物，以待分离此基因的植物基因组DNA或cDNA 为模板直接进⾏PCR扩增，对扩增产物
测序并与已知基因进⾏序列⽐较，从⽽确定该基因是否为待分离基因。

2，⽤⽤已知序列的基因制备探针，筛选待分离基因的植物核DNA或cDNA⽂库。

再对阳性克隆进⾏测序，并与已知基因序列进⾏同源性⽐较，最后经转化鉴定是否为待分离的基因。

7.简述RACE技术的基本原理及其优缺点。

答：原理：RACE 是采⽤PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是⼀种简便⽽有效的⽅法, ⼜被称为锚定PCR和单边PCR。

3’RACE的原理
⼀)加⼊oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进⾏反转录得到(-)cDNA；
⼆)以oligo(dT)l7和⼀个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有⼀在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。

这样就在未知cDNA末端接上了⼀段特殊的接头序列。

再⽤⼀个基因特异性引物(3 amp)与少量第⼀链(-)cDNA退⽕并延伸，产⽣互补的第⼆链(+)cDNA。

三)利⽤3amp和接头引物进⾏PCR循环即可扩增得到cDNA双链。

扩增的特异性取决于3amp的碱基只与⽬的cDNA分⼦互补．⽽⽤接头引物来取代dT17⼀adaptor则可阻⽌长(dT)碱基引起的错配。

5’RACE的原理
5’RACE与3’ RACE略有不同。

⾸先，引物多设计了⼀个⽤于逆转录的基因特异引物GSP-RT；其次，在酶促反应中增加了逆转录和加尾步骤，即先⽤GSP-RT逆转录mRNA 获得第⼀链(-)cDNA后，⽤脱氧核糖核酸末端转移酶和dATP在cDNA5’ 端加poly(A)尾，再⽤锚定引物合成第⼆链(+)cDNA,接下来与3’ RACE过程相同。

⽤接头引物和位于延伸引物上游的基因特异性引物(5amp)进⾏PCR扩增。

全长基因的获得：
1,对3’RACE和5’RACE的产物序列的重叠区域分析，经过拼接获得全长cDNA
2,通过分析RACE产物的3’和5’端序列，重新设计合成相应引物，PCR扩增出全长cDNA
优缺点；优点；操作速度快，节省时间，可在短期内获得全长的cDNA。

只需极少量的起始反应物质，具有快速、简便、经济、实⽤性强等优点，还⼏乎不存在产⽣⾮特异产物的可能。

缺点：利⽤RACE技术来获得全长基因并不容易，甚⾄经常会发⽣错误的扩增和克隆结果，尤其是对于丰度较低、长度较长的基因。

8.简述基因芯⽚技术的原理及其优缺点。

答：原理：将许多特定的寡核苷酸⽚段或基因⽚段作为探针，有规律地排列固定于⽀持物上，然后使其与待测的标记样品基因按剑姬配对原理进⾏杂交，再通过共聚焦荧光检测系统等对芯⽚进⾏扫描，并配以计算机系统对每⼀探针上的荧光信号做出⽐较和检测，从⽽迅速得出所要的信息。

优缺点：优点：具有⾼度的敏感性和特异性，有⾼信息量、快速、样品⽤量少、⽤途⼴泛等优点。

缺点：基因芯⽚需要⼤量已知的、准确的DNA和cDNA⽚段的序列信息，⽽且，需要⾼密度芯⽚制作的精密机械系统和操作⼯艺及微弱的杂交信号检出装置，芯⽚的制作和使⽤成本均较⾼，所以尚难在⼀般的实验室中普及使⽤。

第九章园艺植物遗传转化载体的构建
1.什么叫卸甲载体常⽤的卸甲载体有⼏种类型
卸甲载体是⽆毒的Ti质粒载体，⼜称onc-载体。

是指为了使野⽣型的Ti质粒成为基因转化
的载体，必须切除T-DNA中onc基因，即“解除”其“武装”，构建成“卸甲载体”。

常⽤的卸甲载体类型：pGV3850载体、pGV2250载体和pTiB6S3-SE载体3种。

共整合转化载体系统的特点及构建策略是什么
特点：共整合载体由两个质粒组成，其中⼀个是质粒中间载体，另⼀个是卸甲Ti质粒组成；
2.农杆菌中两个质粒形成⼀个⼤的共整合载体，质粒进⼊到根癌农杆菌后，以同源重组的⽅式与Ti质粒整合在⼀起，形成共合体，相对分⼦质量较⼤；
3.共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关，相对较低；
4.必须⽤Sounthern杂交或PCR对⼤的共整合体质粒进⾏检测；。