实验7_酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别

二、基本原理——酵母菌形态 基本原理——酵母菌形态
酵母菌为单细胞真核微生物， 菌体比细菌大。 酵母菌为单细胞真核微生物 ， 菌体比细菌大 。 无 性繁殖主要是出芽生殖 出芽生殖， 性繁殖主要是 出芽生殖 ， 仅裂殖酵母属是以分裂 方式繁殖； 有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。 方式繁殖 ； 有性繁殖是通过接合产生子囊孢子 。 本实验通过用美蓝染色浸片 美蓝染色浸片来观察生活的酵母形 本实验通过用 美蓝染色浸片 来观察生活的酵母形 态和出芽生殖方式。 态和出芽生殖方式。
还原剂 美蓝（氧化型） 美蓝（氧化型） 蓝色 氧化剂 美蓝（还原型） 美蓝（还原型） 无色
二、基本原理——美蓝染色液 基本原理——美蓝染色液
酵母活细胞 新陈代谢 还原能力
美蓝（氧化型） 美蓝（氧化型） 蓝色
美蓝（还原型） 美蓝（还原型） 无色
二、基本原理——子囊孢子观察 基本原理——子囊孢子观察
四、操作步骤——美兰染色 操作步骤——美兰染色
在载玻片中央加一滴0.05%吕氏碱性美蓝染色液， 在载玻片中央加一滴0.05%吕氏碱性美蓝染色液，用接种环 0.05%吕氏碱性美蓝染色液 染液不宜过多或过少） 挑取少量酵母菌苔，混合均匀； 挑取少量酵母菌苔，混合均匀；（注：染液不宜过多或过少） 用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触， 用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖 玻片放下使其盖在菌液上； 盖玻片不宜平着放下） 玻片放下使其盖在菌液上；（注：盖玻片不宜平着放下）
四、操作步骤——悬滴标本制作 操作步骤——
①取清洁的凹玻片和盖玻片各一片 ； ②用火柴杆取少许凡士林涂一圈于凹玻片凹窝周围 ； ③在盖玻片中央用接种环蘸取一小滴无菌水，然后用 在盖玻片中央用接种环蘸取一小滴无菌水， 无菌操作取少许菌苔在水滴上轻沾一下， 无菌操作取少许菌苔在水滴上轻沾一下，注意水滴大 小要适宜，放菌苔时不要使水滴破散； 小要适宜，放菌苔时不要使水滴破散； ④将凹玻片翻转向下，使凹窝中央对准盖玻片中央液 将凹玻片翻转向下， 然后轻压。使凹玻片与盖玻片粘合紧密， 滴，然后轻压。使凹玻片与盖玻片粘合紧密，以免蒸 然后很快将凹玻片翻转， 发，然后很快将凹玻片翻转，使盖片向上 ⑤将制作好的悬滴片置于显微镜下观察。 将制作好的悬滴片置于显微镜下观察。
二、基本原理——美蓝染色液 基本原理——美蓝染色液
美蓝为无毒性染料，其氧化型为蓝色， 美蓝为无毒性染料，其氧化型为蓝色，而还原型为无 用它对酵母菌染色时， 色。用它对酵母菌染色时，由于活细胞的新陈代谢作 使细胞内具有较强的还原能力， 用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色 的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色； 的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色； 对于死细胞或代谢缓慢的老细胞， 对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原 能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。 能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。 因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态， 因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以 区分死、活细胞。 区分死、活细胞。
二、基本原理——悬滴法 基本原理——悬滴法
将细菌悬液滴于盖玻片中央，翻转， 将细菌悬液滴于盖玻片中央，翻转，置于 凹玻片的凹窝中央， 凹玻片的凹窝中央，由于细菌不受盖玻片 的压力影响， 的压力影响，所以此法常用于观察并区别 细菌运动的方式， 细菌运动的方式，也可观察细菌的繁殖方 式及孢子萌发等。 式及孢子萌发等。
美蓝还原型无色还原剂氧化剂美蓝氧化型美蓝氧化型蓝色蓝色美蓝氧化型美蓝氧化型蓝色蓝色美蓝还原型无色酵母活细胞新陈代谢还原能力子囊孢子是子囊菌类真菌有性生殖产生的有性孢子
实验八
1、酵母菌的形态和死活细胞的鉴别 及子囊孢子观察 2、细菌悬滴观察法
一、目的要求
1.观察酵母菌的形态及出芽生殖方式。 1. 观察酵母菌的形态及出芽生殖方式。 观察酵母菌的形态及出芽生殖方式 2.学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。 2. 学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。 学习区分酵母菌死活细胞的实验方法 3.学习并掌握酵母菌子囊孢子的观察方法。 3. 学习并掌握酵母菌子囊孢子的观察方法。 学习并掌握酵母菌子囊孢子的观察方法 4.学习并掌握细菌悬滴片的制作方法， 4. 学习并掌握细菌悬滴片的制作方法，用悬滴法 学习并掌握细菌悬滴片的制作方法 在高倍镜或油镜下观察细菌的运动。 在高倍镜或油镜下观察细菌的运动。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
三、实验器材
1.菌种：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 菌种：酿酒酵母( 巨大芽孢杆菌（ subtilis） 巨大芽孢杆菌 （ Bacillus subtilis ） 。 2.溶液或试剂：0.05%和0.1%吕氏碱性美蓝染液， 溶液或试剂： 05% 吕氏碱性美蓝染液， 孔雀绿， 番红水溶液，95%乙醇。 5%孔雀绿，0.5%番红水溶液，95%乙醇。 仪器或其他用具：显微镜，香柏油，载玻片， 4. 仪器或其他用具 ： 显微镜 ， 香柏油 ， 载玻片 ， 、 凹玻片， 盖玻片， 酒精灯， 接种环， 擦镜纸等 凹玻片 ， 盖玻片 ， 酒精灯 ， 接种环 ， 擦镜纸 等 。
四、操作步骤——悬滴标本制 操作步骤——
作
①取清洁的凹玻片和盖玻片各一片 ； ②用火柴杆取少许凡士林涂于盖玻片的四周； 用火柴杆取少许凡士林涂于盖玻片的四周； ③在盖玻片中央用接种环蘸取一小滴无菌水，然后 在盖玻片中央用接种环蘸取一小滴无菌水， 用无菌操作取少许菌苔在水滴上轻沾一下， 用无菌操作取少许菌苔在水滴上轻沾一下，注意水 滴大小要适宜，放菌苔时不要使水滴破散； 滴大小要适宜，放菌苔时不要使水滴破散； ④将凹玻片翻转向下，使凹窝中央对准盖玻片中央 将凹玻片翻转向下， 液滴，然后轻压。使凹玻片与盖玻片粘合紧密， 液滴，然后轻压。使凹玻片与盖玻片粘合紧密，以 免蒸发，然后很快将凹玻片翻转， 免蒸发，然后很快将凹玻片翻转，使盖片向上 ⑤将制作好的悬滴片置于显微镜下观察。 将制作好的悬滴片置于显微镜下观察。
子囊孢子是子囊菌类真菌有性生殖产生的有性 孢子。在酵母菌中， 孢子。在酵母菌中，能否形成子囊孢子及其形 态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。 态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。酵母菌 形成子囊孢子需要一定的条件， 形成子囊孢子需要一定的条件，所以对不同种 属的酵母要选择适合形成子囊孢子的培养基。 属的酵母要选择适合形成子囊孢子的培养基。 葡萄糖－ 麦氏 (McClary) 培养基 ( 葡萄糖－醋酸钠培 有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。 养基 ) 有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。
将制片放置约30min， 将制片放置约30min，先低倍镜后高倍镜观察酵母形态和出芽 30min 情况，并根据颜色区别死活细胞。 情况，并根据颜色区别死活细胞。
四、操作步骤——子囊孢子观察 操作步骤——子囊孢子观察
1.制片：取经产孢培养的酵母斜面培养物， 1.制片：取经产孢培养的酵母斜面培养物， 制片 在洁净载玻片上按常规涂片、干燥、固定。 在洁净载玻片上按常规涂片、干燥、固定。 2.染色 滴加孔雀绿染液染色3min 染色： 3min。 2.染色：滴加孔雀绿染液染色3min。 3.脱色 脱色： 95%的乙醇脱色30s，水洗。 的乙醇脱色30s 3.脱色：用95%的乙醇脱色30s，水洗。 4.复染：用番红复染30s，水洗，用吸水纸 4.复染：用番红复染30s，水洗， 复染 30s 吸干。 吸干。 7.镜检 干后用油镜观察。子囊孢子呈绿色、 镜检： 7.镜检：干后用油镜观察。子囊孢子呈绿色、 菌体和子囊呈粉红色。 菌体和子囊呈粉红色。
五、实验报告
结果 绘图说明酿酒酵母的营养细胞、子囊 绘图说明酿酒酵母的营养细胞、 和子囊孢子的形态特征。 和子囊孢子的形态特征。
六、思考题
1、根据你的观察结果，吕氏美兰染液的浓度 根据你的观察结果， 及作用时间与酿酒酵母死活比例变化是否有 关系？试分析说明。 关系？试分析说明。 2、在你的实验中是否观察到酿酒酵母的子囊 孢子？分析原因。 孢子？分析原因。 悬滴观察应该注意哪些问题？ 3、悬滴观察应该注意哪些问题？是否可用于 所有种类的微生物观察？ 所有种类的微生物观察？