肾透明细胞癌中X染色体生殖同源盆基因F1(Rhox F1)表达及其甲基化状态研究

肾透明细胞癌中X 染色体生殖同源盆基因F1(Rhox F1)表达及其甲基化状态研究
程　欢,赵　浩,吴建强,李　望,王军起　(徐州医科大学附属医院泌尿外科,江苏　徐州　221000)
[摘　要]　目的:探讨人肾透明细胞癌组织中X 染色体生殖同源盒基因F1(Rhox F1)启动子CpG 岛甲基化及其mRNA 表达情况,分析MTHFR C677T 不同基因型Rhox F1甲基化及mRNA 的表达情况㊂方法:收集我院手术切除的
38例肾透明细胞癌组织(肾癌组)及其配对的癌旁正常肾脏组织区(正常组)标本㊂采用实时PCR 和甲基化特异PCR (MSP )技术分别检测肾癌组和正常组的Rhox F1mRNA 的表达和甲基化状态㊂采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP )技术分别检测MTHFR 基因677(C →T )多态性,分析MTHFR C677T 不同基因型Rhox F1启动子去甲基化率及mRNA 表达情况㊂结果:正常组中Rhox F1基因mRNA 阳性表达率36.8%明显低于肾癌组的89.5%,差异有统计学意义(χ2=22.619,P <0.001)㊂正常组中Rhox F1基因启动子甲基化率为78.9%,显著高于肾癌组的18.4%(χ2=27.861,P <0.001)㊂34例Rhox F1mRNA 阳性表达的肾癌组织[MTHFR 677(C →T )]中TT 基因型患者25例,CT 基因型患者5例,CC 基因型患者4例,Rhox F1mRNA 表达水平差异具有统计学意义(F =80.201,P <0.001),且TT 基因Rhox F1mRNA 表达水平(0.91±0.01)显著高于CT 基因型(0.33±0.03)和CC 基因型(0.26±0.03),差异均有统计学意义(均P <0.001)㊂TT 基因型中有24例Rhox F1启动子去甲基化(96.0%);CT 基因型中有2例(40.0%);CC 基因型中有1例(25.0%)㊂TT ㊁CT ㊁CC 三组基因Rhox F1启动子去甲基化率差异具有统计学意义(P <0.001),其中TT 基因Rhox F1启动子去甲基化率显著高于CT 基因型和CC 基因型(P =0.009,P =0.004)㊂结论:Rhox F1mRNA 在肾癌组织中高表达,Rhox F1启动子去甲基化率在肾癌组织中较高㊂MTHFR 基因677(C →T )中TT 基因型肾癌患者Rhox F1mRNA 表达水平和启动子去甲基化阳性率高于CT 和CC 基因型㊂
[关键词]　肾肿瘤;DNA 甲基化;多态性,单核苷酸;亚甲基四氢叶酸还原酶;X 染色体生殖同源盒基因F1
通讯作者:王军起
Rhox F 1expression and its methylation in renal clear cell carcinoma CHENG Huan ,ZHAO Hao ,WU
Jian -qiang ,et al (Department of Urology ,Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University ,Xuzhou 221000,China )
Abstract :Objective To investigate the methylation and mRNA expression of CpG island in the promoter of X-chromo⁃some homeobox gene F1(Rhox F1)in human renal clear cell carcinoma,and to analyze the methylation and mRNA expression of Rhox F1in different MTHFR C677T genotypes.Method A total of 38cases of renal clear cell carcinoma (renal carcinoma group)and adjacent normal kidney tissue specimens (normal group)were collected in the Affiliated Hospital of Xuzhou Medi⁃cal College after nephrectomy.The expression and methylation status of Rhox F1gene in renal carcinoma group and normal
group were detected by real-time PCR and methylation specific PCR (MSP).The MTHFR gene 677(C →T)polymorphism was detected by restriction fragment length polymorphism polymerase chain reaction (PCR-RFLP),and the demethylation rate and mRNA expression of Rhox F1promoter of different MTHFR C677T genotypes were analyzed.Results The positive expres⁃sion rate of Rhox F1mRNA in the normal group (36.8%)were significantly lower than that in the renal cancer group (89.5%),the difference was statistically significant (χ2=22.619,P <0.001).Total methylation rate of Rhox F1MRNA pro⁃
moter in the normal group (78.9%)were higher than that in the renal cancer group (18.4%),the difference was statistically significant (χ2=27.861,P <0.001).There were 25cases of TT genotype,5cases of CT genotype and 4cases of CC genotype in 34cases of renal cell carcinoma with Rhox F1positive expression
[MTHFR 677(C →T)]
.The difference of Rhox F1mRNA expres⁃
sion levels between TT,CT and CC genes was statistically significant(F =80.201,P <0.001)and the TT gene Rhox F1mRNA expression level (0.91±0.01)was significantly higher than that in CT genotype (0.33±0.03)and CC genotype (0.26±0.03),and the differences were statistically significant (all P <0.001).There were 24(96.0%),2(40.0%)and 1
(25.0%)Rhox F1promoters demethylated in the TT genotype ,in the CT genotype and in the CC genotype respectively.The demethylation rate of Rhx F1promoter in TT,CT and CC groups was statistically significant (P <0.001).The demethylation
rate of TT gene Rhox F1promoter was significantly higher than CT genotype and CC genotype (P =0.009,P =0.004).Con⁃
clusion Rhox F1mRNA is highly expressed in renal cell carcinoma,and the rate of demethylation of Rhox F1promoter is high⁃er in renal cell carcinoma.Among MTHFR C677T genotypes,the expression level of Rhox F1mRNA and the rate of Rhox F1promoter demethylation of renal cancer patients with TT genotype were higher than those of others.
Key Words:Kidney neoplasms;DNA methylation;Polymorphism,single nucleotide;Methylenetetrahydrofolate reduc⁃tase;Reproductive homeobox on X-chromosome F1gene
叶酸是人体内主要的甲基基团供体,亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)是叶酸代谢途径的关键酶之一,其催化作用决定了DNA甲基化与DNA 合成之间的平衡㊂MTHFR基因呈多态性,其中以位于催化区的677(C→T)转换最为常见[1],此种基因转换通过破坏总基因DNA甲基化㊁DNA合成与修复障碍而发挥致癌作用[2]㊂近年来有研究发现同源异型域转录因子在正常个体发育过程中发挥非常重要的作用,但一些同源异型域转录蛋白参与肿瘤的始动和转移过程[3],如X染色体生殖同源盒基因家族(re⁃productive homeobox on X-chromosome,Rhox)㊂研究发现DNA 甲基化使Rhox家族种系特异性基因处于沉默状态保证了正常的大鼠胚胎形成[4]㊂而人类的X染色体生殖同源盒基因F1(Rhox F1)在肿瘤细胞株中表达异常增高,而在正常组织如睾丸中该基因则处于不表达状态[5]㊂因此,本研究分析在肾癌中MTHFR基因多态性对Rhox F1的甲基化状态及其mR⁃NA表达的影响,以期进一步阐明肾癌发生㊁发展的分子机制㊂
1　资料与方法
1.1　材料:收集2010年3月~2010年9月徐州医科大学附属医院泌尿外科手术切除且均经病理证实为透明细胞癌的新鲜肾癌组织38例,并取相应的癌旁正常肾脏组织标本作为正常对照组,切除后立即置液氮冻存,所有患者术前均未接受过放化疗,均有详细的临床资料和手术记录,此项研究已通过徐州医科大学附属医院伦理委员会同意并取得受试对象的知情同意㊂1.2　方法
1.2.1　Rhox F1基因的表达情况:按总RNA提取试剂盒(Trizol)的操作说明分别提取不同来源组织的RNA㊂在提取的总RNA中取10μg按反转录试剂盒说明以50μl体系反转录成cDNA,实时PCR采用定量PCR中的相对定量法,以GAPDH作为内参照,同时以外周正常组织为基准,癌区组织RNA的SFRP1基因(x)表达量均表达成外周正常组织的N 倍(即Nx)㊂用于PCR扩增的SFRP1特异性引物序列为正向:5′-GTGCGGGTTTGGTTTAAGAA-3′,反向:5′-CCA⁃GAAAAACCCATCTCCAA-3′;内参照GAPDH引物序列为正向:5′-CCCTTCATTGACCTCAACTACATGG-3′,反向:5′-CCT⁃GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3′㊂每次定量反应后产物都经30g/L琼脂糖电泳证明为所需扩增的片段㊂通常情况下,正常组织Nx位于0.3~3.0之间,Nx≥3.0为阳性表达,而<0.3为阴性表达㊂反应条件94℃5min,92℃15s,60℃1min,40个循环,每次反应均设3复孔,CT值取其均值㊂Nx= 2-△△Ct㊂△△Ct=△Ct样品-△Ct基准=(Ct样品x﹣Ct样品GAPDH)-(Ct基准x-Ct基准GAPDH)㊂内参基因序列为TTTTAGGTGTGAAGAGGTGAGTTAGA㊂
1.2.2　Rhox F1基因启动子甲基化分析:符合后续实验要求样本DNA中取5~12μl,按EZ DNA Methylation Gold Kit甲基化修饰试剂盒(美国ZYMO公司)说明书进行甲基化修饰,修饰完成并纯化的DNA经10μl的M-Elution Buffer洗脱后立即进行分析㊂甲基化特异性PCR(MSP)引物序列正向:5′-GTGAAGTGGTTTTAGTGTTTATATT-3′,反向:5′-CT⁃CAAAAACTACCCTCCACC-3′㊂反应条件:94℃预变性5min, 94℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸45s,共35个循环, 72℃再延伸5min㊂PCR产物采用20g/L琼脂糖电泳,生物电泳图像系统分析结果㊂
1.2.3　MTHFR基因型检测:将MTHFR PCR扩增产物理想的样品进行限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术分析㊂限制性核酸内切酶HinfⅠ特异识别GAGTC酶切位点,当677位点C→T颠换后,会产生1个Hinf Ⅰ酶切位点取PCR扩增产物,PCR反应体系为25μl,10×Buff⁃er2.5μl,引物终浓度0.2μmol/L,Taq DNA聚合酶1U,模板2μl㊂扩增条件为:95℃预变性5min,然后进行35个循环(每个循环包括94℃1min,60.5℃1min,72℃1min),最后72℃延伸8min㊂选用PCR扩增产物测序确定是MTHFR677位基因阳性的肾癌标本作为阳性对照,以高压双蒸水代替DNA模板作为空白对照㊂PCR产物由上海基康生物技术公司纯化并测序㊂每个酶切体系的体积为20μl,上述反应体系置于37℃水浴5~8h酶切消化,取酶切产物5μl,20g/L琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像图像分析仪观察结果㊂
1.3　统计学处理:采用SAS6.12统计软件包进行统计处理㊂计数资料用率(%)表示,两样本率比较用χ2检验或Fisher确切概率法㊂通过方差检验比较肾癌组织TT㊁CT和CC基因型mRNA的表达,再通过Dunnett-t法进行两两比较㊂检验水准α=0.05,以P<0.05为差异有统计学意义㊂
2　结果
2.1　Rhox F1mRNA的表达:正常组织中,14例Rhox F1基因mRNA阳性表达(36.8%);肾癌组中34例Rhox F1基因mR⁃NA阳性表达(89.5%)㊂两组间Rhox F1的mRNA阳性表达差异有统计学意义(χ2=22.619;P<0.001)㊂Rhox F1mRNA 的表达情况见图1㊂
2.2　Rhox F1启动子甲基化状态分析:在正常组,30例Rhox F1启动子甲基化呈阳性;在肾癌组仅有7例甲基化阳性,正常组织中Rhox F1启动子CpG岛甲基化率(78.9%)显著高于肾癌组织(18.4%),差异有统计学意义(χ2=27.861,P<0.001)㊂见图2㊂
注:Rhox F1为X 染色体生殖同源盒基因F1;T 为肾癌组织;N 为正常组织
图1　肾癌组织和正常对照组织Rhox F1
基因的表达情况
注:Rhox F1为X 染色体生殖同源盒基因F1;M 为甲基化;U 为去甲基化
图2　肾癌组织和正常对照组织Rhox F1基因启动子CpG 岛甲基化检测情况
2.3　肾癌中Rhox F1启动子甲基化率与其mRNA 表达的关系:34例表达Rhox F1mRNA 的癌组织中有30例发生去甲基化,发生率高达88.2%(30/34),在4例Rhox F1mRNA 表达缺失的癌组织中1例发生去甲基化,发生率为25.0%(1/4)㊂Rhox F1mRNA 阳性患者的Rhox F1启动子较Rhox F1mRNA 阴性患者去甲基化率高,差异有统计学意义(P =0.015)㊂表明Rhox F1mRNA 阳性表达患者,其启动子更容易去甲基化㊂2.4　MTHFR 677(C →T)基因多态性:34例Rhox F1mRNA 阳性表达的肾癌组织[MTHFR 677(C →T)]中TT 基因型患者25例,CT 基因型5例,CC 基因型4例㊂TT㊁CT㊁CC 基因Rhox F1mRNA 表达水平差异具有统计学意义(F =80.201,P <0.001),其中TT 基因Rhox F1mRNA 表达水平(0.91±0.01)
显著高于CT 基因型(0.33±0.03)和CC 基因型(0.26±0.03),差异均有统计学意义(均P <0.001);CT 与CC 基因型组间Rhox F1mRNA 表达水平差异无统计学意义(P >0.05),见图
3㊂TT 基因型中有24例Rhox F1启动子去甲基化(96.0%),CT 基因型有2例(40.0%),CC 基因型有1例(25.0%)㊂TT㊁CT㊁CC 三组基因Rhox F1启动子去甲基化率差异具有统计学意义(P <0.001),其中TT 基因Rhox F1启动子去甲基化率显著高于CT 基因型和CC 基因型(P =0.009,P =0.004)㊂CT 与CC 基因型组间Rhox F1启动子去甲基化率差异无统计学意义(P =0.595)㊂3　讨论
肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,其发生㊁发展涉及众多原癌基因和抑癌基因的协同作用㊂
近年来的研究结果注:MTHFR 为亚甲基四氢叶酸还原酶;CC㊁CT㊁TT 为基因型
图3　MTHFR 677(C →T)基因Hinf Ⅰ限制性
内切酶片段长度多态性分布情况
显示,DNA 甲基化广泛存在于各种恶性肿瘤,包括泌尿系统肿瘤[6]㊂在对大鼠的研究中,Rhox 家族中超过30种功能性基因
已被证实,其中大多数集中于Rhox 5[7],最新研究表明异常的Rhox 5表达可干扰神经生长因子-1受体基因Unc5c 的转录[8],而Unc5c 在结肠癌的发病过程中扮演着抑癌基因的角色[9]㊂由于Rhox 家族基因存在同源性,可见其他功能性基因可能存在着与Rhox 5相同或者相似的生物学致癌作用,其表达水平的调节机制显得尤为重要㊂尽管如此,目前对主要存在于人类中的Rhox 家族成员Rhox F1㊁Rhox F2和Rhox F2B 的研究甚少,它们在人类癌症中的表达水平及其甲基化是否参与调节机制尚不明了㊂本研究结果显示,在肾透明细胞癌组织中Rhox F1mRNA 表达水平明显高于正常组织,癌组织中Rhox F1启动子去甲基化率明显高于正常组织,二者关系分析提示Rhox F1mRNA 表达水平异常增高可能是肾透明细胞癌发生与进展的机制之一,而Rhox F1mRNA 高水平表达可能是通过其启动子区域去甲基化来实现的㊂
在甲基化过程中,叶酸是主要的甲基基团供体,叶酸缺乏或代谢障碍与许多肿瘤的发病风险增高相关[10]㊂而MTHFR C677T 能够不可逆地催化5,10-亚甲基四氢叶酸转变为5-甲基四氢叶酸,它通过合成S-腺苷基甲硫氨酸(SAM)而参与多种甲基化过程,可使变异体酶对热不稳定且活性显著降低,影响酶的活性,TT 纯合基因型的酶活性仅为CC 野生型的30%[11],而酶活性的降低改变了SAM 水平,从而导致DNA 去甲基化或低甲基化,增加了染色体的不稳定性㊂目前已有研究发现叶酸摄入和MTHFR 基因多态性与部分肿瘤相关基因甲基化紊乱有关㊂本研究结果显示肾癌组织中携带677TT 的患者Rhox F1启动子去甲基化率和mRNA 表达明显高于CT 和CC 基因型,可能机制为MTHFR 677TT 基因型个体中MTHFR 的酶活性较其他两种基因型低,减少了同型半胱氨酸向甲硫氨酸的转变,使SAM 水平异常下降,导致了Rhox F1启动子区域去甲基化,异常激活Rhox F1过量表达,干扰抑癌基因的转录,打破了某些原癌基因与抑癌基因的平衡关系,最终导致肿瘤的发生㊂
肾癌的发生及发展是一个多阶段的复杂病变过程,位点
特异的DNA甲基化调控基因的表达极其重要[12]㊂由于去甲基化异常激活及表达,影响了某些抑癌基因的转录合成,直接导致肾癌的发生;而叶酸代谢酶MTHFR677TT多态性可影响Rhox F1启动子的甲基化和核酸的稳定性,从而间接参与肿瘤的形成[13]㊂但由于样本数量有限,本研究未能进一步探究其余两种Rhox基因与MTHFR多态性的关系,但从这次实验中可看出一定趋势,即MTHFR多态性通过影响部分Rhox 基因启动子区域甲基化状态而调控其表达㊂因此,大样本的实验有待开展,进一步验证本研究结果,深入了解肾癌发生㊁发展的分子机制,可为个体化的临床辅助诊断㊁病程监控和治疗提供新的理论参考依据㊂
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[收稿日期:2019-04-23　编校:陈　伟/郑英善]。