一种鸡胚原始生殖细胞的3D培养方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810424499.7
(22)申请日 2018.05.03
(71)申请人 佛山科学技术学院
地址 528000 广东省佛山市南海区狮山镇
仙溪水库西路佛山科学技术学院
(72)发明人 郑桂纯　陈志胜　赵姝灿　黄丽贞　
张晓芳　
(74)专利代理机构 广州嘉权专利商标事务所有
限公司 44205
代理人 王国标
(51)Int.Cl.
C12N 5/0735(2010.01)
(54)发明名称一种鸡胚原始生殖细胞的3D培养方法(57)摘要本发明公开了一种鸡胚原始生殖细胞的3D 培养方法，其包括以下步骤：1)将采集得到的14HH鸡胚血液置入cPGCs完全培养基中培养，纯化细胞；2)将纯化后的鸡胚原始生殖细胞重新置入cPGCs完全培养基进行体外培养扩增，取传代至二代的细胞，并离心获得鸡胚原始生殖细胞沉淀；3)将海藻酸钠溶液添加到沉淀中；4)用短针头胰岛素注射器吸取细胞悬液，滴加到含有CaCl 2溶液的培养皿中形成海藻酸钠水凝胶球，静置15min再培养。

本发明通过将海藻酸钠引入到培养条件中，使得该3D细胞培养模式很好地模拟鸡胚原始生殖细胞的体内生长环境，有利于大量获得鸡胚原始生殖细胞，从而有利于鸡胚原始
生殖细胞在研究以及生产中的应用。

权利要求书1页 说明书3页 附图1页CN 108753692 A 2018.11.06
C N 108753692
A
1.一种鸡胚原始生殖细胞的3D培养方法，其特征在于包括以下操作步骤：
1)将采集得到的14HH鸡胚血液置入cPGCs完全培养基中培养，原代培养10～15d即可纯化细胞；
2)将纯化后的鸡胚原始生殖细胞重新置入cPGCs完全培养基进行体外培养扩增，取传代至二代的细胞，并通过离心获得鸡胚原始生殖细胞沉淀；
3)将海藻酸钠溶液添加到步骤2)的鸡胚原始生殖细胞沉淀中，得混合液；
4)用短针头胰岛素注射器吸取步骤3)所得混合液中的细胞悬液，滴加到含有CaCl 2溶液的培养皿中形成海藻酸钠水凝胶球，静置15min待凝胶微球成形后弃去CaCl 2溶液，后加入PBS溶液清洗，再加入1ml cPGCs完全培养基中于37℃、5％CO 2浓度的环境条件下培养。

2.根据权利要求1所述的一种鸡胚原始生殖细胞的3D培养方法，其特征在于：步骤3)中所述海藻酸钠浓度为1.1％。

3.根据权利要求1所述的一种鸡胚原始生殖细胞的3D培养方法，其特征在于：步骤4)中所述CaCl 2溶液采用2％CaCl 2溶液。

4.根据权利要求1所述的一种鸡胚原始生殖细胞的3D培养方法，其特征在于：所述cPGCs完全培养基配方按原料体积百分比包括86.9％的Ko -DMEM、1％的B -27supplement、1％的100X NEAA、1％的nucleosides、1％的肝素钠、1％的OVT、1％的TGF -β1、1％的GlutaMAX II、1％的BMP4、0.1％的β-巯基乙醇、1％的Activin A、1％的IGF -1、1％的FGF -2、1％的三抗和1％的卵清蛋白。

权　利　要　求　书1/1页CN 108753692 A
一种鸡胚原始生殖细胞的3D培养方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种鸡胚原始生殖细胞的培养方法。

背景技术
[0002]原始生殖细胞(PGCs)是生殖细胞的原始祖先细胞，在雌性和雄性动物中PGCs可分别形成卵原细胞和精原细胞，具有发育的全能性。

禽类胚胎是研究发育和干细胞生物学的强大模型，它们具有一定的优势，例如其易于获得、个体小、体外操作方便、繁殖周期短等。

作为生殖干细胞，PGCs可用于研究生殖细胞的发育和分化，也可作为外源基因的载体，在性腺嵌合体的制备、转基因动物生产、保护珍稀物种的种质资源方面等研究中有广阔的应用前景。

[0003]海藻酸钠是一种高效的生物黏附剂和pH敏感性的凝胶材料，其应用研究日益增多，其化学结构为一种褐藻主要结构成分的多糖。

海藻酸盐是由甘露糖醛酸(M)和古罗糖醛酸(G)二种单体连接后形成，海藻酸对金属离子的亲和力及其成胶性能与G单体的含量有关。

当二个G单体相连时，它们形成一个对多价金属离子(Ca2+、Zn2+、Al3+等)的交联点，从而产生凝胶化。

海藻酸钠水凝胶因具有良好的生物相容性而被广泛应用于组织工程领域，用于装载生长因子或者细胞到损伤部位以提高组织再生的效果，研究表明氧化的海藻酸钠可产生活性较高的醛基，可以接枝各种细胞因子和多肽，这也使得这种生物材料具有在功能上的可塑性和多样性。

[0004]现阶段鸡胚原始生殖细胞体外培养体系有两种，分别是饲养层培养以及无饲养层无血清培养，这两种培养体系中都很难大量获得鸡胚PGCs。

且细胞在体内生长的环境是立体的，传统细胞培养技术在模拟细胞体内生存环境方面做得还不够，3D培养的方法是能在细胞培养过程中为细胞提供一个更加接近体内生存条件的微环境的培养技术。

如何为体外培养鸡胚PGCs提供一个适宜的微环境，促进细胞增殖，有利于鸡胚PGCs的大量获得，在实际生产应用中具有重要意义。

发明内容
[0005]本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种鸡胚原始生殖细胞的3D培养方法。

[0006]本发明所采取的技术方案是：一种鸡胚原始生殖细胞的3D培养方法，其包括以下操作步骤：
[0007]1)将采集得到的14HH鸡胚血液置入cPGCs完全培养基中培养，原代培养10～15d即可纯化细胞；
[0008]2)将纯化后的鸡胚原始生殖细胞重新置入cPGCs完全培养基进行体外培养扩增，取传代至二代的细胞，并通过离心获得鸡胚原始生殖细胞沉淀；
[0009]3)将海藻酸钠溶液添加到步骤2)的鸡胚原始生殖细胞沉淀中，得混合液；[0010]4)用短针头胰岛素注射器吸取步骤3)所得混合液中的细胞悬液，滴加到含有
CaCl2溶液的培养皿中形成海藻酸钠水凝胶球，静置15min待凝胶微球成形后弃去CaCl2溶液，后加入PBS溶液清洗，再加入1ml cPGCs完全培养基中于37℃、5％CO2浓度的环境条件下培养。

[0011]作为上述方案的进一步改进，步骤3)中所述海藻酸钠浓度为1.1％。

[0012]作为上述方案的进一步改进，步骤4)中所述CaCl2溶液采用2％CaCl2溶液。

[0013]作为上述方案的进一步改进，所述cPGCs完全培养基配方按原料体积百分比包括86.9％的Ko-DMEM、1％的B-27supplement、1％的100X NEAA、1％的nucleosides、1％的肝素钠、1％的OVT、1％的TGF-β1、1％的GlutaMAX II、1％的BMP4、0.1％的β-巯基乙醇、1％的Activin A、1％的IGF-1、1％的FGF-2、1％的三抗和1％的卵清蛋白。

[0014]本发明的有益效果是：本发明通过将海藻酸钠引入到培养条件中，使得该3D细胞培养模式很好地模拟鸡胚原始生殖细胞的体内生长环境，有利于大量获得鸡胚原始生殖细胞，从而有利于鸡胚原始生殖细胞在研究以及生产中的应用。

附图说明
[0015]图1是cPGCs在2D培养条件下的细胞形态图，其中图1(A)是原代细胞，图1(B)是200倍显微镜下cPGCs的形态，图1(C)是400倍显微镜下cPGCs的形态；
[0016]图2是cPGCs在3D培养条件下的细胞形态图，图2(A)是50倍显微镜下的水凝胶球，图2(B)是400倍显微镜下cPGCs的形态；
[0017]图3是本发明实施例2的DAPI染色结果图。

具体实施方式
[0018]下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。

有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。

同时下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品；未详细提及的工艺步骤或制备方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。

[0019]实施例1：3D培养鸡胚原始生殖细胞
[0020]一种3D培养鸡胚原始生殖细胞的方法，其包括以下步骤：
[0021]1)选取新鲜种蛋20枚，用75％的酒精擦拭表面，室温平衡2h，放置38℃，相对湿度60％的孵化箱中进行孵化，孵化至鸡胚发育期的14HH，取其胚血；
[0022]2)将胚血注射至含cPGCs无饲养层培养体系的48孔板中，37℃，5％CO2培养箱培养；
[0023]3)培养至第15天，取培养板中的细胞至500μL的离心管中，3000rpm离心5min，弃上清，以去除血细胞，完全培养液重悬细胞至48孔培养板中，37℃，5％CO2培养箱培养；[0024]4)取第2代的细胞，将海藻酸钠溶液添加到通过离心获得的鸡胚原始生殖细胞沉淀中；
[0025]5)用短针头胰岛素注射器吸取细胞悬液，滴加到含有CaCl2溶液的培养皿中形成海藻酸钠水凝胶球，静置15min凝胶微球成形后弃去CaCl2溶液，加入PBS溶液清洗后，再加
入1ml cPGCs完全培养基在37℃、5％CO2浓度的环境条件下培养，即为鸡胚原始生殖细胞的3D培养状态。

[0026]实施例2：3D培养方法与2D培养方法的鸡胚PGCs的细胞存活率比较
[0027]1)实验分为两组，分别为3D培养组和2D组即传统培养方法，从实施例1中获得的第2代鸡胚PGCs，按每孔1×105个细胞接种于24孔板中，每组设置3个复孔；
[0028]2)进行DAPI染色：
[0029]2-1)在3D组细胞中，加入0.25％胰蛋白酶水解海藻酸钠水凝胶，消化2min后，用含有10％胎牛血清的完全培养基终止消化，3000rpm离心5min，弃上清；
[0030]2-2)对2D组进行离心，3000rpm离心5min，弃上清；
[0031]2-3)加入4％多聚甲醛溶液固定30min，3000rpm离心5min，含5％FBS的PBS重悬细胞，3000rpm离心5min，弃上清；
[0032]2-4)加入1μg/mL DAPI避光复染5min，3000rpm离心5min，弃上清，加入抗荧光淬灭剂，倒置荧光显微镜下观察染色结果并拍照。

[0033]所述DAPI购于Invitrogen公司。

[0034]实验结果：
[0035]图2为倒置式生物显微镜下拍摄出的3D细胞状态图。

与图1进行对比可见，3D条件下细胞状态有所不同。

图3为DAPI染色结果图，由图可知，3D培养条件下，鸡胚PGCs的体外培养存活率较传统方法培养的高，说明海藻酸钠水凝胶球能较好的模拟PGCs的体内生长环境，提高其存活率。

[0036]本发明在以前鸡胚原始生殖细胞培养的基础上创新，首次进行了鸡胚PGCs的3D培养，更好的模拟了细胞的体内环境，有利于大量获得鸡胚原始生殖细胞，从而有利于鸡胚原始生殖细胞在研究以及生产中的应用。

[0037]上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。

图1
图2
图3。