蛋白酶产生菌的筛选
耐高温蛋白酶产生菌的筛选及酶学特性的初步研究
水 产 品深加 工 广 东普 通 高校 重点 实验 室 , 广 东湛 江 5 2 4 0 8 8 ; 2 . 广 东省水 产 品深加 工及 副产 物 高值化 利 用工程技 术研 究 中心 ,
湛 江恒 兴水 产科技 有 限公 司 , 广 东湛江 5 1 0 3 0 0 )
摘 要: 为 了提 供 可用 于 水 产 饲 料 添 加 剂 用 途 的蛋 白酶 , 从 玛 珥 湖环 境 中筛选 出耐 高温 蛋 白酶 产 生 菌株 。通 过 牛 奶 平
( 1 . C o l l e g e o f F o o d S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y , A q u a t i c P r o d u c t P r o c e s s i n g a n d S a f e t y K e y L a b o f
板 筛选的方法从土壤 中分 离获得 3 0株产蛋白酶菌株 , 并通过摇瓶发酵 复筛的方法 筛选产酶最高的菌株 H L 一 3 , 其发酵
液 的 蛋 白酶 活 性 高 达 3 9 9 . 2 U / m L 。通 过 生 理 生化 特 征 鉴 定 、 1 6 S r D N A 基 因序 列和 系统发 育 分析 , 初 步 鉴 定 菌 株 H L 一 3为地 衣 芽孢 杆 菌。 菌株 H L 一 3所 产 蛋 白 酶 的 最适 作 用 温度 为 7 0℃ , 最适 p H为 7 . 0 , 在9 0℃ 保 温 1 0 m i n后 酶 活 力 仍 可保 留 7 5 . 1 2 % 。在 离子 浓度 为 1 . 0×1 0 ~m o l / L时 , C u “和 M n 对 该 酶 有较 强 的抑 制 作 用 , F e 、 Z n “、 C a “ 对 该
蛋白酶产生菌的筛选及发酵条件的优化
关 键词 :蛋白酶;筛选;枯草芽孢杆菌;优化
中图分 类 号 :Q 9 3 9 . 9 7
文 献标 志 码 :A
文 章编 号 :1 0 0 1 — 9 6 7 7 ( 2 0 1 4 ) 0 7 — 0 0 6 7 — 0 4
Op t i mi z a t i o n o f S c r e e n i n g o f Pr o t e a s e P r o d u c i n g S t r a i n a n d t h e Fe r me n t a t i o n Co n d i t i o n
第4 2卷第 7期 2 0 1 4年 4月
广
州
化
工
Vo 1 . 4 2 No . 7 Ap r . 2 0 1 4
Gu a n g z h o u Ch e mi c a l I n d u s t r y
蛋 白酶 产 生 菌 的 筛 选 及 发 酵 条 件 的 优 化
7 5 %为水解 酶类 ,蛋 白酶 为工业生产 酶三 大类 之一 ,其 市值 约 占总市值 6 5 %_ 4 J 。蛋 白酶存 在于所有生活有机休 中,因此 可从
1 . 1 材
料
1 . 1 . 1 菌种 来 源 本公 司分离鉴定保存 。
1 . 1 . 2 主要 试 剂
酵母 膏( B R) :英 国 O X O I D公司 ,胰蛋 白胨 ( B R) :国药集 团化学试 剂 有 限公 司 ,脱 脂 奶粉 :国药集 团 化学 试 剂有 限公
pr o c e s s t o p r o d uc e p o l y—p e p t i d e . By r e p e a t e d s i f t i n g s o f b c t e r i a l s t r a i n s,a p r o d uc t i v e p r o t e a s e b a c t e ia r l s t r a i n Ba c i l l u s
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选
蛋白酶产生菌的分离、鉴定和筛选是一项重要的微生物学工作,通常用于寻找能够产生具有特定功能的蛋白酶的细菌或真菌菌株。
以下是一般的步骤和方法:
1. 样品采集:首先从土壤、水体、食品等环境中采集样品,可能含有潜在的蛋白酶产生菌。
2. 分离:将样品进行稀释处理后,通过涂布法、稀释涂布法、过滤法等分离方法,在富含寒原蛋白酶的寒原平板培养基上培养,以分离出单菌种。
3. 纯化:将分离得到的单菌种进行多次传代,确保单一菌株的纯化。
4. 鉴定:利用生理生化试验、形态学观察、生物学特性和分子生物学方法(如16S rRNA序列分析)等手段,对分离得到的菌株进行鉴定,确定其分类地位。
5. 筛选:利用含有蛋白质底物的培养基(如乳清蛋白、明胶等)进行筛选,观察菌株在培养基上的透明圈或发酵液的浑浊度变化,筛选出产生蛋白酶活性高的菌株。
6. 活性测定:对筛选出的蛋白酶产生菌株进行蛋白酶活性测定,确
定其蛋白酶活性水平。
7. 保存与应用:对获得的蛋白酶产生菌株进行保存,并进一步研究其生物学特性和应用潜力,如酶学特性、温度和pH稳定性等。
通过以上步骤,可以有效地从环境样品中分离、鉴定并筛选出具有高蛋白酶产量和活性的菌株,为后续的蛋白酶生产及应用研究提供了可靠的菌种资源。
5产蛋白酶菌株的筛选2019
三、器材
1.菌株 从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株 2.溶液和试剂 蛋白胨,酵母粉,脱脂奶粉,琼脂,干酪素,三氯醋酸,NaOH,
Na2CO3,Folin试剂,硼砂,酪氨酸,水等 3.仪器和用品 三角烧瓶,培养皿,吸管,试管,涂布棒,玻璃搅拌棒,培养摇
床,高压灭菌锅,直尺,玻璃小漏斗和滤纸
四、操作步骤
1.牛奶平板培养基的配制及灭菌 牛奶平板:在普通肉汤蛋白胨
固体培养基中添加终质量浓度为 1.5%的ห้องสมุดไป่ตู้奶
2.倒平板
四、操作步骤
3.制备土壤悬液 4.涂布 5.培养 6.观察记录
五、注意事项
培养基灭菌条件的控制。
六、实验结果
将菌落计数结果记录于下表中。
七、思考题
1.在选择平板上形成蛋白透明水解圈大小是否能作为 判断菌株产蛋白酶能力的直接证据?为什么? 2.简单设计一方案,从实验中初筛得到的产蛋白酶菌 落里获得某个碱性蛋白酶的高产菌株。
产蛋白酶菌株的筛选
生物制药系 2019年12月
一、实验目的
学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生 菌的方法。
二、实验原理
蛋白酶在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。 微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶,具有产酶量高, 适合大规模工业生产等优点,被认为是最重要的一类营业 性酶类。自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物 学的一项重要工作。 自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后,其 菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。水解圈与菌落直径的 比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化
陇东大学学士学位毕业论文(设计)蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化生命科学与技术学院08生物技术班作者:指导教师:蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化何泰杜旭谢丽娟,刘丽萍(陇东学院生命科学与技术学院,甘肃庆阳745000)摘要:采用陇东学院污水处理厂附近土壤、农田土壤及养殖场附近土壤作为样品,利用牛奶水解圈筛选模型从中分离筛选得到产蛋白酶能力较高的菌株whr1,初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。
并对其产酶条件进行优化,结果显示该菌最适培养时间为24h,最佳碳源为质量浓度1% 蔗糖,最佳氮源为质量浓度1.5%酵母膏,最适初始pH值为6.0,最适发酵温度为35℃。
关键词:菌种筛选,鉴定,蛋白酶,条件优化Protease produced the screening of the bacteria and the optimization of theenzyme production conditions(College of life science and technology, Longdong University, Qingyang 74500, Gansu, China)Abstract:The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Yeast extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30℃.Keyword: Screening,Identified,Protease, Conditions optimization0引言蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称,是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶[1],也是目前世界上产销量最大的商业酶,其市场占有率约占整个商品酶销售量的60%,微生物蛋白酶从微生物中提取,不受资源、环境和空间的限制,具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性[2,3]。
微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选
微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选产蛋白酶菌株的筛选级分离一、实验原理自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后,其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈,水解圈与菌落直径的比值,常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
将腐烂的大豆浸泡液中的细菌接种在含有酪素的培养基上进行培养。
由于产蛋白酶菌株能在干酪素的培养基上形成无色透明圈,因此能将产蛋白菌株分离出来,分离出来的菌株经再次培养,就可获得纯种产蛋白酶的菌株。
二、实验器材1.菌种:从大豆浸泡液中获得2.培养基:(1)PDA斜面培养基:马铃薯200g,蔗糖20g,琼脂20g,水1000ml.马铃薯去皮,切成块,煮沸半小时后用纱布过滤,再加糖及琼脂,溶化后补水至1000ml,121℃灭菌30min备用。
(2)干酪素琼脂培养基:干酪素4.0g,用20ml 0.1mol/L NaOH溶液溶解后再加20g琼脂,加蒸馏水煮沸加水至1000ml 121℃灭菌30min备用。
3.试剂:无菌水。
4.仪器:天平,电磁炉,烧杯,无菌试管,无菌培养皿,高压灭菌锅,锥形瓶,接种环,涂布棒,酒精灯,恒温培养箱。
三、实验步骤1.将腐烂的大豆放入无菌水中浸泡,制成细菌悬浮液。
2.用涂布棒蘸取菌液接种于PAD培养基中,26℃培养48h。
3.倒置于酪素琼脂培养基平板上,37℃培养24h。
4.挑取培养好的菌落接种于平板上,28℃培养48h。
5.观察各菌落周围形成的透明圈的情况。
6.选取透明圈较大的三个菌落分别接种在干酪素琼脂培养基上,28℃培养48h。
7.观察受否为单菌落,若为单菌落且有透明圈,则为纯种产蛋白酶菌株。
若有杂菌,则需要重复步骤6,直到培养出纯菌为止。
参考文献[1]代玉梅.蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及酶学性质研究[D].青岛:青岛大学,2008.[2]黄志强,林白雪,谢联辉.产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选与鉴定[J].福建农林大学学报:自然科学版,2006,35(4):416-420.。
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选。
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选。
蛋白酶产生菌的分离鉴定和筛选可以按照以下步骤进行:1.样品收集:从环境样品(如土壤、水样、发酵物等)中收集样品,注意收集样品需要符合生物安全和伦理规范。
2.分离菌株: a. 样品处理:将样品进行适当的稀释处理,以获得适量的单菌落。
b. 培养基选择:根据目标酶的特性,选择合适的培养基进行菌株分离。
常用的培养基有LB(大肠杆菌培养基)、TSA(琼脂糖营养平板培养基)等。
也可以添加特定的底物来富集酶活菌株。
c. 接种和分离:将处理后的样品接种在选定的培养基上,并进行营养和环境条件的适当调整。
通过稀释分离法,将单菌落分离至不同的培养皿中,得到纯培养的菌株。
3.酶活性测定: a. 初步筛选:将分离的菌株进行初步筛选,通过对菌落的酶活性直接观察或使用浸润琼脂糖等方法判断酶的活性。
b. 液体培养:将筛选出的菌株进行液体培养,收集培养物用于后续的酶活性测定。
c. 酶活性测定:通过适当的酶活性测定方法(如改良的Casein酶活测定法、Azocasein酶活测定法等)来评估菌株的酶活性。
4.酶产量测定: a. 最优菌株筛选:根据酶活性测定结果,选择酶活性较高的菌株。
b. 酶产量测定:对选定的菌株进行批量发酵或连续发酵实验,通过酶活性和菌体生长曲线的测定,估计菌株的酶产量。
5.菌株鉴定: a. 形态学特征:观察菌落的形态学特征,如形状、颜色、质地等。
b. 生理生化特性:进行生理生化测试,包括生长方式、耐受性、产酸性、酶反应等。
c. 分子生物学鉴定:通过PCR方法扩增和测序16S rRNA基因,进行菌株的分子鉴定,并与已知菌株进行比对。
这些步骤将有助于从样品中分离、鉴定和筛选出蛋白酶产生菌株。
根据筛选结果,选择高酶活性和高酶产量的菌株,可以进行后续的酶性质研究、表达载体构建等工作。
在实践中,根据具体实验条件和要求,可能需要进行适当的优化和调整。
碱性蛋白酶产生菌的筛选
文章编号:1001-3717(2006)01-0070-03碱性蛋白酶产生菌的筛选3李树文,陆秀华,尚海利(莱阳农学院生命科学院,山东青岛266109)摘要:本试验从5份土壤中共筛选出产碱性蛋白酶菌株9株,即SHL-4、SHL-6、SHL-7、SHL-10、SHL-8、SHL-11、SHL-12、SHL-18、SHL-20,其中SHL-4、SHL-6、SHL-7、SHL-10产酶效果较好;采用正交试验设计,初步地确定了菌株SHL-4产酶培养基组分,即蛋白胨0.5%、牛肉膏1.5%。
关键词:碱性蛋白酶;筛选;菌株中图分类号:Q939.97文献标识码:AScerrning R ning of Alkaline Protease Producing StrainsL I Shu2wen,L U Xiu2hua,SHAN G Hai2li(Life Science College,L AC,Qingdao266109,China)Abstract:Nine st rains producing alkaline p rotease were screened out f rom five soil samples,namely SHL-4、6、7、10、8、11、12、18、20,SHL-4、6、7、10of which wit h high protease activity.Through an or2 t hogonal test,t he p roducing protease cult ure medium of t he SHL-4st rain was confirmed preliminarily, namely0.5%of pepto ne,1.5%of beef ext ract.K ey w ords:alkaline protease;screening;st rain 碱性蛋白酶是指在碱性的条件下具有活性,能够水解蛋白质肽键的酶类。
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选1. 引言蛋白酶是一类能够降解蛋白质的酶,在许多工业领域具有广泛的应用价值。
因此,发现和筛选具有高蛋白酶产量的菌株成为了很多研究人员的关注点。
本文旨在介绍蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选的方法和步骤。
2. 蛋白酶分离菌株的采集蛋白酶产生菌株可以从各种环境中采集得到,常见的源包括土壤、水样、植物表面等。
采集时需要注意避免污染和样品间的干扰。
常用的采集方法包括无菌棉签擦拭、土壤样品采集等。
3. 蛋白酶分离菌株的分离和筛选3.1 培养基选择和制备蛋白酶分离菌株的分离需要选择合适的培养基,常见的培养基包括含蛋白质和多肽的培养基,如酵母提取物培养基、肉汤培养基等。
培养基制备时需要注意无菌操作,避免细菌污染。
3.2 菌株的分离将采集得到的样品均匀涂布在选定的培养基上,使用无菌棉签或铲子进行均匀涂布。
将涂布后的培养基培养于适宜的温度和时间下,一般常见的培养温度为30摄氏度。
3.3 蛋白酶活性筛选使用适当的蛋白酶活性指示剂,如casein等,在培养基上进行盘状培养。
通过观察培养基上蛋白质的降解情况,筛选出具有高蛋白酶活性的菌株。
此外,也可通过测定培养液中蛋白酶的活性来进行筛选。
4. 蛋白酶产生菌株的鉴定4.1 形态观察观察菌落的形态特征,如菌落的形状、颜色、透明度等,以及菌株的菌落生长速度等。
4.2 生理生化特性检测进行菌株的生理生化特性检测,包括产酸、产气、葡萄糖利用、氧需求等。
常用的方法包括气压油技术、碳水化合物利用酶技术等。
4.3 分子生物学鉴定采用分子生物学方法对菌株进行鉴定,如16S rRNA序列分析、PCR等。
将菌株的DNA提取出来,进行引物扩增,然后通过测序和序列比对,确定菌株的分类信息。
5. 结论通过蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选,可以获得具有高蛋白酶产量的菌株。
这些菌株在生物技术、食品工业等领域具有广泛的应用前景。
未来的研究可以进一步优化培养条件,提高菌株的蛋白酶产量,并应用于相关的工业生产中。
蛋白酶产生菌的筛选及酶学性质研究
Ke o d : p o e lt n y ; b cl s c u e e z me p o e t s yw rs r to yi e z me c a i u ; r d n y r p ri l e
3 0 mL f s 0 a k, 6 l 0 mL; i o u u sz , 2 ; r s e t ey An o c u e h r e e t o p a s t a rd c d p o en e n c l m ie % e p c i l. d we c n ld d t e e w r w e k t o u e r t ia v h p s
No 1 .O 0c . t
文章 编号 : 17 - 6 6( 0 6 1— 0 7 0 6 94 2 0 ) 0 0 6 — 4 1
蛋 白酶产 生菌 的筛选及 酶学性质研 究
于宏伟 ,栗志丹 ,郝珊珊 , 贾英 民
( 河北农业大学 食 品科技学院 ,河北 保定 0 10 ) 70 1 摘要 :从养牛 厂附近的土壤 中分 离得 到一 株产 蛋白酶性 质优 良的菌株 ,初步鉴定为芽孢杆 菌 ,对其最适产酶条件进 行了研究 。试 验表 明 ,最 适碳源 为玉米粉 ,最适 氮源为 玉米 浆 ,30 m 0 L摇 瓶最适装 液量 为 6 L,最 适接种 量为 0m 2 %,起始 p H值 为 45和 65时有 2个产酶高峰 ,并对其进行酶学性质的研究。该 酶最适温度为6 . . 5℃ ,最适 p H值为 75 .,该 酶在 5 0℃以下保温 3 n酶活仍 较高 ,在 7 0mi 0℃以上酶活全部丧失 。在 p H值 70 90时 比较稳定 ,而在 p . . ~ H
维普资讯
蛋白酶产生菌细菌的分离与鉴定
蛋白酶产生菌细菌的分离与优化一、研究背景及进展蛋白酶已广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。
皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶,既节省时间,又改善劳动卫生条件。
蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。
临床上可作药用,如用胃蛋白酶治疗消化不良,用酸性蛋白酶治疗支气管炎,用惮性蛋白酶治疗脉管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗。
加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品,含碱性蛋白酶,能去除衣物上的血渍和蛋白污物,但使用时注意不要接触皮肤,以免损伤皮肤表面的蛋白质,引起皮疹、湿疹等过敏现象。
二、实验方案1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株B1 分离自污水河的土壤;B9 为B1 物理诱变后所得的菌株。
1.1.2 药品弹性蛋白、刚果红弹性蛋白 Sigma 公司产品。
1.2 培养基1.2.1 细菌富集培养基(% W/V)蛋白胨1.0,酵母膏0.5,NaCl 1.0,pH7.0,121℃灭菌20min。
1.2.2 初筛培养基(% W/V)弹性蛋白0.80,葡萄糖0.10,酵母膏0.10,K2HPO4 0.10,KH2PO4 0.05,MgSO4·7H2O 0.01,pH7.0,115℃灭菌30min。
1.2.3 发酵培养基(% W/V)干酪素3.00,葡萄糖4.00,玉米提取液0.1,K2HPO4,0.20,MgSO4·7H2O 0.01,pH7.0,11℃灭菌30min。
1.3 胞外弹性蛋白酶产生菌的筛选方法1.3.1 细菌富集培养称取土样1 g ,加入细菌富集培养基中,送摇床培养,150r/min,37℃培养48h。
同时做两个平行实验。
1.3.2 分离将富集土壤悬液按每级稀释10 倍的次序得到10- 3、10 - 4、10 - 5 的系列稀释液,再依次分别从各稀释度试管中各吸取0.2ml 稀释液,加到相应的培养皿内,用涂棒涂匀。
每个稀释梯度做两个平行试验,3 7 ℃培养箱倒置培养48h。
蛋白酶产生菌的筛选鉴定,原理
蛋白酶产生菌的筛选鉴定,原理
蛋白酶产生菌的筛选鉴定的原理是利用菌株产生的蛋白酶活性对菌落进行筛选和鉴定。
常用的方法有以下几种:
1. 筛选培养基法:将菌株接种在富含蛋白质的培养基上,待菌落形成后,置于一定条件下(如低温、酸碱pH变化、盐等),观察菌落周围是否出现蛋白质水解区域。
表现明显蛋白质水解区域的菌落可以认为是蛋白酶产生菌。
2. 培养基加酪蛋白法:将菌株接种在含有酪蛋白的培养基上,蛋白酶能够水解酪蛋白,会呈现明显的透明圈形成。
菌落形成后,利用这个特征可以筛选出蛋白酶产生菌。
3. 硫酸铜法:将菌株接种在富含酪蛋白的培养基上,在菌落周围加入硫酸铜溶液。
菌落产生的蛋白酶能使硫酸铜发生颜色变化(由蓝色变为紫色)或溶液变清晰,可以通过这种方法对菌株进行筛选和鉴定。
4. 特定基质代谢法:蛋白酶产生菌可以利用特定基质作为唯一碳源进行代谢,产生的酶能水解特定基质并产生反应产物。
利用这些反应产物的特性,可以利用化学或生物学方法进行分析和鉴定。
以上这些方法都是利用菌株产生的蛋白酶活性进行筛选和鉴定,以确定是否为蛋白酶产生菌。
这些方法灵敏度高、简单易行,
可以用于在大量菌株中筛选出蛋白酶产生菌,并对其进行鉴定和进一步的研究。
实验十一 产蛋白酶菌株的筛选
实验十一产蛋白酶菌株的筛选碱性蛋白酶是一类最适宜作用PH为碱性的蛋白酶,在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。
微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶,具有产酶量高,适合大规模工业生产等优点,被认为是最重要的一类营业性酶类。
从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作,也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。
一基本原理⏹自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后,其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。
⏹水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈,细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大,因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。
⏹碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。
⏹原理:Folin试剂与酚类化合物(Tyr,Trp,Phe)在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物,用蛋白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应,通过分光光度计测定可知酶活大小。
二实验目的⏹学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法⏹学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术⏹掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法三实验器材1 菌株从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株2 溶液和试剂蛋白胨,酵母粉,脱脂奶粉,琼脂,干酪素,三氯醋酸,NaOH,Na2CO3,Folin试剂,硼砂,酪氨酸,水等3 仪器和用品三角烧瓶,培养皿,吸管,试管,涂布棒,玻璃搅拌棒,水浴锅,分光光度计,培养摇床,高压灭菌锅,尺,玻璃小漏斗和滤纸四操作步骤1 培养基和试剂的配制(1)牛奶平板:在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶(2)发酵培养基:玉米粉4%,黄豆饼粉3%,Na2HPO4 0.4%,KH2PO4 0.03%,3 mol/l NaOH 调节pH到9.0,0.1MPa 灭菌20min,250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选
蛋白酶是一类能够水解蛋白质的酶,在许多领域具有广泛的应用价值。
下面是蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选的一般步骤:
1. 样品采集:
-从自然环境(如土壤、水源等)或已知含有蛋白质的样品(如食品、发酵物等)中采集样品。
2. 分离菌株:
-将样品经过适当的稀释和处理后,通过平板法、液体培养法等方式进行分离培养。
-可以采用选择性培养基,如蛋白质含量较高的培养基,以筛选出潜在的蛋白酶产生菌。
3. 蛋白酶活性筛选:
-根据蛋白酶的活性特点,可使用含有特定蛋白质底物的琼脂糖平板或液体培养基,筛选出蛋白酶活性高的菌株。
-观察菌落周围的透明圈(即蛋白酶产生的溶解区),判断菌株对蛋白质的降解能力。
4. 纯化与鉴定:
-从具有蛋白酶活性的菌株中选择一个或多个进行进一步的培养和纯化。
-使用生化方法,如SDS-PAGE电泳、酶活性测定等,鉴定蛋白酶的分子量、酶活性和特性。
5. 分子鉴定:
-对蛋白酶活性高的菌株进行16S rRNA或其他适用的基因序列分析,以确定其属于的菌属和物种。
6. 筛选优良菌株:
-结合蛋白酶活性、稳定性、产酶量等指标,筛选出蛋白酶产量高、酶性好的优良菌株。
值得注意的是,在进行分离鉴定及筛选过程中,需要严格遵守微生物实验室操作规范,采取必要的无菌操作和消毒措施,确保实验安全。
此外,还可以利用分子生物学技术对蛋白酶基因进行研究,以进一步了解蛋白酶的产生机制和调控方式。
产蛋白酶菌株的筛选与酶活力的测定【文献综述】
文献综述生物科学产蛋白酶菌株的筛选与酶活力的测定摘要[摘要]本文主要按照实验设计步骤从海水中筛选出可以产蛋白酶的放线菌,并对获得的放线菌进行初步研究,如形态观察以及酶活力的测定。
从舟山沿海中分离得到几株产蛋白酶的放线菌,并通过酪蛋白平板培养基,水解酪蛋白试验可对菌株的产酶情况进行定性研究,酶活较高的菌株都能产生较大的水解圈。
对其中2株产酶活性较高的菌株进行了以酪蛋白为底物的紫外分光光度法进行酶活性的测定。
[关键词]:蛋白酶;分离纯化;透明圈;酶活力1蛋白酶的简介水解蛋白质肽键的一类酶的总称。
按其水解多肽的方式,可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。
内肽酶将蛋白质分子内部切断,形成分子量较小的肽。
外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解,而游离出氨基酸,前者为氨基肽酶后者为羧基肽酶[1]。
按其活性中心和最适pH值,又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。
按其反应的最适pH值,分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。
工业生产上应用的蛋白酶,主要是内肽酶。
根据蛋白酶对所作用的反应底物的选择性,一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键。
种类很多,重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。
如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。
2蛋白酶的广泛应用蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。
微生物蛋白酶,主要由霉菌、细菌,其次由酵母、放线菌生产。
例如,乳酸菌(lacticacidbacteria,LAB)是一大类能在可利用的碳水化合物发酵过程中产生大量乳酸的细菌,目前已知有200多种LAB[2]。
相当多的LAB是益生菌,其作为益生菌有如下依据:其属于肠道正常菌群,对人和动物的健康是有益的[3]。
在农业、兽医、医学以及食品工业[4、5]中是很重要的。
如果对产蛋白酶的乳酸菌种进行了筛选,并将所产的蛋白酶进行了分离纯化,就可以为酸奶的生产研制和微生态制剂的研发提供更优良的菌种。
蛋白酶的筛选
蛋白酶的筛选1、取土壤,晾干,过40目筛,用无菌水梯度稀释至0.000001g土/1mL水或0.0000001g土/1mL水,待用2、配酪素培养基(加琼脂),高压灭菌,倒平板;配LB培养基或发酵培养基,灭菌,分作液体培养基,另外取一些倒斜面。
3、取1的融入土壤的水1mL涂平板,置于恒温箱,于50度或以上培养1~3天,挑选有水解圈(透明圈)的菌落用来划斜面(LB),于50度或以上进行纯化培养。
4、取纯化菌株,于液体LB中扩大培养。
5、离心,取沉淀,盐析,透析,得酶液。
6、以酪蛋白为底物,测酶液酶活,若酶活较大,则该菌株为你要的菌株了。
初筛1:用选择性培养基,把PH调低,则耐酸的才能活,另外,把N源去掉,加入酪素(酪蛋白),其他营养成分照基础培养基就行了,这样,产蛋白酶的菌种能将酪素分解成酪氨酸,就有可利用的N源,不产蛋白酶的菌种不能利用酪素,则没有N源,最后耐酸又产蛋白酶的菌种成为优势菌,挑出,换培养基。
初筛2:初筛1所得菌种用透明圈法(蛋白酶水解酪素产生透明圈,直径越大,酶活越高,具体步骤自己找)挑出蛋白酶活力高的菌种,接入摇瓶培养复筛:初筛2所得菌以福林试剂法测酶活(以Folin染色,测吸光度,具体步骤自己找),酶活最高者为最终菌种。
一、酪素培养基成分:酪蛋白10g牛肉膏3g磷酸氢二钠2g氯化钠5g琼脂15g蒸馏水1000mL0.4%溴麝香草酚蓝溶液12.5mLpH7.4制法:将除指示剂外的各成分混合,加热溶解(但酪蛋白不溶解),校正pH。
加入指示剂,分装烧瓶,121℃高压灭菌15min。
临用时加热溶化琼脂,冷至50℃,倾注平板。
注:将菌株划线接种于平板上,如沿菌落周围有透明圈形成,即为能水解酪蛋白。
二、干酪素培养基(用于蛋白酶菌株筛选) 分别配制A液和B液。
A液:称取Na2HPO4·7H2O 1.07g。
干酪素4g,加适量蒸馏水,并加热溶解。
B液:称取KH2PO4 0.36g,加水溶解。
蛋白酶产生菌的筛选
蛋白酶产生菌的筛选组别:第*组班级:生工** 班组员:***指导老师:***一、实验目的学习从自然界中分离蛋白酶产生菌二、实验内容蛋白酶产生菌的分离三、实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶,细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。
本实验将土壤样品悬液加热处理,杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌,将其接种到奶粉培养平板并进行培养,根据奶粉平板的水解圈做初筛。
将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养,测定蛋白酶的活力,最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。
也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养,分离筛选其他蛋白酶产生菌。
四、实验材料和用具1.材料:土壤样品2.试剂:牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、45mL 无菌水(带玻璃珠)、芽孢染色液、3.仪器及用具:紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。
五、操作步骤(一)配制所需培养基按照以下配方配制所需的培养基牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏 0.5g ,蛋白胨 1g ,NaCl 0.5g ,琼脂 1.5 ~2.0g ,水 100ml ,pH 7.2配制 200mL奶粉培养基:牛肉膏0.5g ,蛋白胨 1g ,NaCl 0.5g ,琼脂 2.0g ,水 100ml ,pH 7.0 ~7.2脱脂奶粉 3g ,配制 200mL(二)分离1.采集土壤样品,用无菌水植被 1:10 土壤悬液。
2.取 1:10 土壤悬液 5 mL,注入已灭过菌的试管中,将此试管放入 75~80℃水浴中热处理 10min 以杀死非芽孢细菌。
3.取加热处理过的土壤悬液 100~200μL,涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养平板,后将平板倒置,于30~ 32℃下培养24~48h.4.对长出的单菌落进行编号,选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落,挑取少许菌苔涂片,做芽孢染色,判断是否为芽孢杆菌。
产蛋白酶菌株的筛选
• 每组(产碱性蛋白酶菌分离用) • 1、配置培养基: • 1)牛肉膏蛋白胨培养基: ( 配制200ml放三角 瓶,分装试管5支) • 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g • NaCl 5g 琼脂20g • 水 1000ml PH7.0-7.2 • 配置牛奶(分离用)?? • 2)发酵培养基(每组配置350ml 分装6甁): • 玉米粉4 %、 黄豆饼粉3 %、 • Na2HPO4 0.4 %, KH2PO4 0.03 %, • 3mol/L NaOH 调节PH9.0,100ml • 250ml三角瓶的装甁量50ml
• 第四次 • 1、初筛:将斜面培养物接种到发酵培养基; • 每个菌接2个发酵培养基中。 • 培养:37℃、200r/min(每分钟转)摇床培养 48小时 • 第五次 • 酶活力的测定: • 发酵液过滤液1ml+2 %酪蛋白----40 ℃水浴保 温10分钟-----加0.4mol/L三氯醋酸3ml------静置 15分钟-----过滤液1ml-----0.4mol/LNa2CO35ml----Folin试剂1ml----- 40 ℃水浴保温 20分钟--------分光光度计680nm处 测OD值
四、操作步骤
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第一次 实验准备 每组准备: 1、 90ml无菌水一瓶,无菌水10支,各装9ml自来水; 2、移液管9支,用纸包好;(头上塞棉花)、涂布器 3、空白培养皿:6套 4、配制培养基: 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基+牛奶 三角瓶的装甁量 200ml
斜面试管培养基 3支
• 5、发酵培养基:玉米粉4 %、黄豆饼粉3 %、Na2HPO4 0.4 %, KH2PO4 0.03 %, 3mol/L NaOH 调节PH到9.0, 250ml三角瓶的装甁量50ml 6甁 • 5、灭菌: 0.1MPa 20分钟
蛋白酶
蛋白酶产生菌的筛选及酶活力的测定一、实验目的学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术二.实验原理能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后,其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。
水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈,细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大,因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。
碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。
原理:Folin试剂与酚类化合物(Tyr,Trp,Phe)在碱性条件下发生反应形成蓝色合物,用蛋白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应,通过分光光度计测定可知酶活大小。
三、实验材料样品:邢台学院电教楼附近的土壤。
试剂:蛋白胨,酵母粉,脱脂奶粉,琼脂,干酪素,三氯醋酸,NaOH,Na2CO3,Folin试剂,硼砂,酪氨酸,水等仪器和用品:三角烧瓶,培养皿,吸管,试管,涂布棒,玻璃搅拌棒,水浴锅,分光光度计,培养摇床,高压灭菌锅,尺,玻璃小漏斗和滤纸,玻璃搅拌棒,培养摇床,高压灭菌锅,尺,玻璃小漏斗和滤纸四、实验步骤(一)配制所需培养基(配置完一起灭菌)按照以下配方配制所需的培养基1、牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏0.5g,蛋白胨1g,NaCl 0.5g,琼脂 1.5~2.0g,水100ml,pH7.0~ 7.2,配制200mL2、奶粉培养基:牛肉膏0.5g,蛋白胨1g,NaCl 0.5g,琼脂 2.0g,水100ml,pH7.0~ 7.2,脱脂奶粉3g,配制200mL (在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶)单独灭菌112℃,30min,以防破坏蛋白质。
3、发酵培养基:玉米粉4%,黄豆饼粉3%,Na2HPO4 0.4%,KH2PO4 0.03%,3 mol/l NaOH 调节pH到9.0,0.1MPa 灭菌20min,250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。
蛋白酶产生菌的筛选
蛋白酶产生菌的筛选蛋白酶是一种能够水解蛋白质的酶类,广泛应用于医药、食品、饲料等多个领域。
因此,对蛋白酶产生菌的筛选具有重要意义。
下面将对蛋白酶产生菌的筛选进行详细介绍。
一、菌种的选取菌种的选取是筛选蛋白酶产生菌的第一步。
一般来说,优秀的蛋白酶产生菌应具备以下特点:1.适应性强:具有广泛适应环境的能力,能够在多种环境中生存繁殖;2.高酶产量:产酶量高且稳定,生产成本低;3.酶活性好:酶活性高,能够快速、高效地降解蛋白质;4.易于培养:易于培养和维护,适应不同的培养条件。
根据以上要求,我们可以选取一些常见的微生物菌株,如大肠杆菌、真菌、放线菌等。
此外,一些原产于自然界中的微生物资源也是优秀的菌株来源,在筛选蛋白酶产生菌时应予考虑。
二、菌群的分离菌群的分离是筛选蛋白酶产生菌的关键步骤。
在这一步骤中,我们需要将每一种菌株分离出来,以便进行后续的酶活性检测和分析。
常用的分离方法包括平板法、液体培养法、筛选法等。
其中平板法是最为常见的方法,其步骤如下:1.准备培养基:根据选取的菌株特性,准备适宜的培养基,以促进菌株的生长和繁殖;2.分离:将样品按照一定稀释倍数涂布在平板上,然后放入培养箱进行培养;3.单菌分离:观察培养基的著色情况,辨别每一个菌落,最后用无菌酒精燃烧消毒的针头将每个菌落刺到含有相同培养基的试管中进行液体培养;4.鉴定:确定单菌培养基量大于10^6时,进行细胞分类和鉴定。
三、酶活性检测酶活性检测是筛选蛋白酶产生菌的重要环节,可以通过掌握酶活性信息来评估菌株的产酶能力以及蛋白酶的种类和活性等。
我们可以通过以下方法进行酶活性检测:1.酶联免疫吸附测定法(ELISA):其原理是将特异性抗体与酶偶联,加入样品中,利用抗体与酶偶联物发生特异性相互作用,用底物染色,观察染色情况以确定酶活性;2.凝胶电泳:将分离纯化的酶嵌入聚丙烯酰胺凝胶中进行分离和检测;3.酶活性测定:以酶降解底物的反应速度作为酶活性的指标,通过比色、荧光和放射等不同方式进行检测。
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蛋白酶产生菌的筛选
组别:第*组
班级:生工**班
组员:***
指导老师:***
一、实验目的
学习从自然界中分离蛋白酶产生菌
二、实验内容
蛋白酶产生菌的分离
三、实验原理
许多细菌和霉菌产生蛋白酶,细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。
本实验将土壤样品悬液加热处理,杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌,将其接种到奶粉培养平板并进行培养,根据奶粉平板的水解圈做初筛。
将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养,测定蛋白酶的活力,最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。
也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养,分离筛选其他蛋白酶产生菌。
四、实验材料和用具
1.材料:土壤样品
2.试剂:牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、45mL
无菌水(带玻璃珠)、芽孢染色液、
3.仪器及用具:紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇
床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液
管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂
瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。
五、操作步骤
(一)配制所需培养基
按照以下配方配制所需的培养基
牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏 0.5g,蛋白胨 1g,NaCl 0.5g,
琼脂 1.5~2.0g,水 100ml,pH 7.2
配制200mL
奶粉培养基:牛肉膏 0.5g,蛋白胨 1g,NaCl 0.5g,
琼脂 2.0g,水 100ml,pH 7.0~7.2
脱脂奶粉 3g,配制200mL
(二)分离
1.采集土壤样品,用无菌水植被1:10土壤悬液。
2.取1:10土壤悬液5 mL,注入已灭过菌的试管中,将此试
管放入75~80℃水浴中热处理10min以杀死非芽孢细菌。
3.取加热处理过的土壤悬液100~200μL,涂布接种到牛肉
膏蛋白胨培养平板,后将平板倒置,于30~32℃下培养24~48h.
4.对长出的单菌落进行编号,选择表面干燥、粗糙、不透明
的菌落,挑取少许菌苔涂片,做芽孢染色,判断是否为芽孢杆菌。
(三)筛选
1、从判定为芽孢杆菌的菌落处,分别挑取少许菌苔,先接种奶粉斜面培养基,再转接奶粉培养基平板上,30~32℃下培养24~48h。
2、选择水解圈直径与菌落直径比值大的菌,接入牛肉膏蛋白胨培养基30-32℃振荡培养48小时,将发酵液过滤或离心,取清夜检测蛋白酶活力进行复筛。
六、实验结果:
相关图片:
(2)菌株的分离
根据菌落大小、形状、表面光泽、隆起程度、透明程度、边缘性
状和菌落颜色的差别,最终从培养基上筛选出23个菌落。
(3)将分离到的菌株分别接种到含脱脂奶粉的培养基上,置于32℃培养60h,于室温下观察是否产生细胞外蛋白酶,分解培养
基中的脱脂牛奶,进而产生肉眼可见的水解透明圈。
结果表明,
在接种的23株菌落中,共有18株产生胞外蛋白酶分解脱脂牛奶,形成肉眼可见的透明圈。
从中筛选出9株水解圈与菌落直径比值
较大的菌株。
如下表:
菌株编
号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 比值++ ++ + ++ ++ + + + + 说明:“+”表示:水解圈与菌落直径比值约为3:1,“++”表示:
水解圈与菌落直径大于3:1.。
六、结果分析
在奶粉培养基平板上,蛋白质被孢芽杆菌产生的蛋白酶水解,形成透明圈(见实验相关图片)。
不同种类的微生物产生的蛋白酶的种类和活力各不相同,起对奶粉中蛋白质的水解能力各不相同,所形成的水解圈与菌落大小比值故而不同,因而根据其比值可初步断定其对奶粉中蛋白质的水解能力。
组员签字:。