动物繁殖新技术讲座

（三）采卵
检卵
1．过滤集卵杯(日本产)法
回收结束后，用带4G针头的注射器冲洗滤网 2 ～3 次，吸去杯中的泡沫，置实体显微镜 下检查。
（三）采卵
检卵
2．过滤杯(美国产)法
滤去冲卵液，将过滤杯中留下的30～50ml倒 入平皿，用冲卵液冲洗过滤杯2 ～3 次，一 并倒入平皿，置镜下检查。
（三）采卵
采卵
6．灌流方法
将吊瓶挂在距外阴部 1.0m 高处，接通三通管 (Y 型 ) 和冲卵管。术者用右手控制进流和出流开关，每 次灌注 30 ～ 50ml ，由少到多，每侧总量为 300 ～ 500ml 。左手通过直肠辅助按摩子宫角。每侧子 宫角冲 8 ～ 10 次。或者用 50ml 注射器，每次注入 30 ～ 50ml 的 PBS 冲卵液，分次冲洗子宫角，回收 后注入加盖量筒。另一侧子宫角的冲洗是由术者 右手拉直冲卵管，助手小心插入钢芯。术者的左 手在直肠内诱导钢芯插稳后，给气球放气。术者 再将冲卵管插入另一侧子宫角，用同样的方法冲 洗。全过程需在室温(20℃左右)操作。
牛的胚胎移植
三、超数排卵处理
超数排卵处理
1.FSH法
促卵泡素 (FSH) 减量注射法：供体牛在发情后 的9 ～ 13d肌注FSH，早晚各一次，间隔12h，分4d 减量注射。在第 3d 时同时宫注 PGF2α 2.0 ～ 2.4mg 或 氯前列烯醇 0.6mg。如使用国产 FSH 总剂量为 325 单 位时，处理方法如附图所示。超排剂量根据不同 厂家激素确定适宜剂量，国产激素 320 ～ 360 单位， 进口激素28～36mg。
四、采卵
采卵
1．采卵时间
以发情日为第0d，在第5～6d检查卵巢 确定黄体数，以便于安排受体头数。第 7d(或第6～8d)非手术回收卵。
采卵
2．器械和冲卵液的准备
灭菌处理过的冲卵管用 PBS 液冲洗 2 ～ 3 次， 插入钢芯，检查气球。在无菌间用导管连接吊瓶 和集卵杯灌流装置。装入 PBS 液的吊瓶在 37℃水 浴中预温待用。准备好必要的麻醉剂、注射器、 酒精棉球和冲洗消毒剂等。
动物胚胎移植技术
第二节 胚胎移植的生理基础及原则
1.胚胎移植的生理学基础 2.胚胎移植的基本原则

胚胎移植的生理基础及原则
1.胚胎移植的生理学基础


成年母畜卵巢上存在数千到上万个卵泡，在 外源激素作用下，每个发情期的卵泡发育和 排卵数可达十数个 每个发情周期生殖器官都有一个孕向发育 早期胚胎处于游离状态 胚胎发育不存在免疫问题 胚胎发育到一定阶段会与子宫发生生理和组 联系 胚胎的遗传性不受受体的影响

胚胎移植的技术程序
4.胚胎的收集
胚胎冲洗液的配制：杜氏磷酸缓冲液PBS，布 林斯特液SOF合成输卵管液 手术法收集胚胎 – 输卵管冲胚：顺向冲胚、逆向冲胚 – 子宫角冲胚 非手术法收集胚胎 – 二路法 – 三路法

胚胎移植的技术程序
5.胚胎的检查
收集到的冲洗液静置，冲洗液分离 拣胚：将胚胎移至培养液或保存液中 胚胎鉴定：根据透明带、胚胎细胞、发 育阶段及细胞在透明带中的比例确定胚 胎级别
采卵
3．供体牛的保定和麻醉
供体牛保定完毕后，在第一、二尾椎骨 间酒精消毒，用 2% 普鲁卡因 3 ～ 5ml 作硬膜 外麻醉，或肌注2%静松灵l ml。
（三）采卵
采卵
4．外阴清洗、消毒
麻醉后将牛尾竖直绑在保定架上，清除粪便，用清 水冲洗会阴部及外阴，再用高锰酸钾液冲洗消毒， 用灭菌卫生纸擦干，最后用酒精棉球消毒外阴部。



1.应符合本品种标准，具有较高的生产性能。 2.1.5～ 8 岁，体格健壮，无遗传性疾病，繁殖机能正常。 3.产犊记录清楚，无流产史，产后有两次正常发情记录。 4.生殖器官正常，无繁殖疾病。 5.重复超数排卵间隔60d左右。最多连续处理4次后，自然 繁殖后再使用。凡 2 次超数排卵反应差的母牛不再用作供 体。 6.供体牛的超数排卵处理应在情期的第9～13d进行。凡黄 体发育不良，卵巢静止的母牛不宜用。 7.应选择性情温顺的母牛作供体，以便于操作。
通过一定的处理程序将胚胎降温冷冻后保存于液氮中胚胎移植的技术程序胚胎移植的技术程序非手术法移植胚胎移植的技术程序胚胎移植的技术程序妊娠检查及妊娠确定胚胎移植的技术程序胚胎移植的技术程序28动物胚胎移植技术动物胚胎移植技术一供体牛的选择一供体牛的选择二供体牛的饲养二供体牛的饲养三超数排卵处理三超数排卵处理六胚胎的鉴定和分级六胚胎的鉴定和分级七胚胎的移植七胚胎的移植八妊娠诊断八妊娠诊断292158岁体格健壮无遗传性疾病繁殖机能正常
胚胎移植的技术程序
2. 超数排卵处理
意义：让每个供体提供更多的胚胎 处理时间： – 牛：预计自然发情时间的前4天，或发情 周期的第16-17天 – 羊：发情周期的第12-15天，促性腺激素 处理的第二天或第三天，注射PG

胚胎移植的技术程序
3.供体母畜的配种
必须用优秀的种公畜进行多次配种，一般隔 8-12小时进行一次配种，直到发情结束 配种前应对种公畜的精液进行质量检查 可优秀种公畜不足时，可考虑首次采用本交， 以后采用人工授精，也可以全部采用人工授 精
胚胎移植概述
1.胚胎移植的历史
胚胎移植的历史

1.1初始阶段：1890-1900 W.Heape将安 哥拉兔和荷兰兔的受精卵分别移植到比 利时兔的输卵管内，分别获得仔兔2只。
胚胎移植的历史

1.2初级阶段：1900-1950 主要由英美科 学家在家兔、绵羊、山羊小家畜方面研 究，成功率35%左右。
牛的胚胎移植
二、供体牛的饲养管理
1. 良好的营养状况 : 要保证给供体牛足够的优质 干草、青贮或多汁饲料、精料以及维生素和矿 物质，并供给清洁的饮水和盐，做到合理饲养， 精心管理。 2．供体牛在采卵前后要特别注意保持良好的 饲管环境，不得任意变换饲草；饲料和管理程 序，避免因过强的应激所造成的神经紧张状态。
胚胎移植的历史

1.3发展阶段：1950-1970 日本首次在牛 胚胎移植上成功，之后日、美采用非手 术法移植成功。胚胎移植成功率达7080%
胚胎移植的历史

1.4实用化初始阶段：1970-1980 加美开 始成立牛胚胎移植公司，1973年牛冻胚 移植成功（英）
胚胎移植的历史

1.5实用化研究阶段：1982- 大规模胚胎移植、 核移植、嵌合体、胚胎分割、性别鉴定、体外 受精在英美日德广泛开展。克隆羊诞生。
胚胎移植概述
4.胚胎移植的经济效益
胚胎移植是一个技术过程复杂，各个环节环环 相扣，任何一个不能出现失误的系统工程。 影响胚胎移植成功率的因素很多，同时，其运 作成本较高。这使其应用中存在经济效益上的高风 险性。 如果不是基于急需扩群、供体高经济价值、育 种目的，一般尽量采用自然繁殖。在特殊情况下， 如供种初始阶段，少量优秀个体的扩增，胚胎移植 可创造较好的经济效益。

胚胎移植的应用范围
2.4其它方面应用
胚胎移植是克隆技术的必须过程 体外受精必须借助胚胎移植实现“试管婴儿的 继续发育 转基因及动物生物反应器的研究也必须借助胚 胎移植

胚胎移植概述
3.胚胎移植的成本



种母畜购入或培育成本及饲养费，胚胎成本 分摊 配种费 激素：FSH、LH、PG 手术费：手术药品及耗材、手术辅助人员报 酬等 技术费：技术人员约定报酬 其它：实验室配置、差旅费、招待费

胚胎移植的应用范围
2.3在动物生物多样性上的应用
在保护动物遗传资源，提高家畜生产性能，挽 救濒临灭绝的野生动物方面，胚胎移植技术越 越来发挥出重要作用。 冷冻能够很好地保存濒临灭绝动物的胚胎或生 殖细胞，但该种动物雌性个体的减少，也是这 种动物的胚胎或生殖细胞无法得到移植，科学 家开始研究在该种动物的亚种或亲缘种中试验， 并取得一些成功。如斑马胚胎移植给马，蒙古 马胚胎移植给驴，白肢野牛移植给荷斯坦牛。
激素的选择与鉴定
（三）采卵
超数排卵处理
牛超数排卵示意图
超数排卵处理
2.PMSG法
孕马血清促性腺激素(PMSG)处理法 在情期的 11 ～ 12d ，一次肌注 PMSG2500 ～ 30001U ， 48h后宫注PGF2α 2.4mg。发情后约18h肌注等量 的抗PMSG。
超数排卵处理
3.发情观胎的保存
胚胎的降温：使胚胎停止发育，延长其 体外生存时间 体外培养：将胚胎置于体温条件下，在 培养液中，使其继续发育 胚胎冷冻：通过一定的处理程序，将胚 胎降温冷冻后，保存于液氮中

胚胎移植的技术程序
7.胚胎移植
手术法移植 非手术法移植

胚胎移植的技术程序

胚胎移植的应用范围
2.2在特定品种扩繁上的应用
牛羊等低繁殖力家畜，从引进到形成一个纯种 群体需要7-8个世代，15-20年。而采用MEOT 法，一次就可获得一个纯种群体 80年代初，美、澳、新从欧洲引进的大型肉牛 品种均采用胚胎移植技术扩繁 2000年前后，我国的波尔山羊也是采用胚胎移 植进行扩繁的
PGF2α 处理后40～48h，大部分处理牛发情。 通常要求从注PG第2d傍晚开始观察发情，至少早 晚各观察一次。在观察到接受爬跨后 4 ～ 6h 进行 第一次输精，间隔 12h 后第二次输精。每次有效 精子数不得少于 50×106 ，输入两侧子宫角或子 宫体。注意输精时不得触摸卵巢。
牛的胚胎移植
胚胎移植概述
2.胚胎移植的应用范围
在家畜改良方面的应用 在特定品种扩繁上的应用 在动物生物多样性上的应用 其它方面应用：转基因动物、性别控制、体外 受精

胚胎移植的应用范围
2.1在家畜改良方面的应用
人工授精技术可成几十到几百倍地提高了优秀 种公畜的配种效能。但对优秀母畜来说，受其 产仔数和世代间隔的限制，尤其是牛羊等繁殖 力较低的畜种更是如此。 通过超数排卵和胚胎移植技术（multiple ovulation and embryo transfer: MOET)牛羊 的生长性状年遗传进展可比正常繁殖提高80% 和70%；产奶性状提高33%。
胚胎移植的生理基础及原则
2. 胚胎移植的基本原则
胚胎移植前后所处的环境的同一性 – 供体和受体在分类学上的相同属性 – 动物生理上的一致性：受体和供体在发情时间 上的同期性 – 动物解剖位置上的一致性：空间环境的一致性 胚胎的发育期限：必须处于周期黄体期内 胚胎的质量：胚胎必须是正常的，并在处理过程 中不受不良因素的影响
采卵
5．冲卵管的插入和冲卵部位
助手将准备好的冲卵管交给术者的右手，术者左手 食指和拇指压开阴门插入冲卵管，再将左手伸入 直肠，仔细小心地诱导冲卵管经子宫颈进入一侧 子宫角至大弯处，抽出少许钢芯，再将冲卵管向 前推，使其尖端靠近子宫角深部。由助手持30ml 注射器一次推入10ml空气，然后按术者要求，以 1ml 计数充气。根据子宫大小及冲卵管在子宫的 位置确定充气量，一般青年牛充气14～16ml，经 产牛为18～25ml。冲卵管固定后抽出钢芯，开始 灌流。

至目录
动物胚胎移植技术
第三节 胚胎移植的技术程序



1.供体和受体的选择 2. 超数排卵处理 3.供体母畜的配种 4.胚胎的收集 5.胚胎的检查 6.胚胎的保存与培养 7.胚胎的移植 8.供体和受体的术后观察
胚胎移植的技术程序
1.供体和受体的选择




供体应具有相当高的育种价值 供体生殖机能应处于较高的状态：产后60天以 上，无生殖系统疾病，体质强健 受体应容易购买，繁殖性能好，对地方适应性 强，体型中上等，非优良品种 受体健康状况良好，已进入发情季节 供受体发情时间应接近或一致
（三）采卵
采卵
（三）采卵
采卵
7．术后处理
两侧子宫角冲卵完成后，从气球放出一部分 空气，将冲卵管抽至子宫体灌注土霉素溶 液 (3g 土霉素粉溶于 100ml 灭菌双蒸水或生 理 盐 水 ) 或 10ml 青 霉 素 (80 万 u) 和 链 霉 素 (100万u)，拔出冲卵管。
（三）采卵
五、检卵
8.供体和受体的术后观察及处理
供体和受体的抗炎处理 健康状况检查 返情状况检查 妊娠检查及妊娠确定

动物胚胎移植技术
第四节 牛的胚胎移植
一、供体牛的选择 二、供体牛的饲养 三、超数排卵处理 四、采卵 五、检卵 六、胚胎的鉴定和分级
七、胚胎的移植
八、妊娠诊断
牛的胚胎移植
一、供体牛的选择
动物繁殖新技术系列讲座
动物胚胎移植技术
郑州牧业工程高等专科学校 主讲人：张长兴
动物繁殖新技术系列讲座
目录
第一节 第二节 第三节 第四节

胚胎工程概述 胚胎移植的原理 胚胎移植的技术程序 牛的胚胎移植
动物胚胎移植技术
第一节 胚胎移植概述
1.胚胎移植的历史 2.胚胎移植技术的应用 3.胚胎移植的成本 4.胚胎移植的经济效益