基因工程的基本操作程序

与模板互补的DNA双链）
重复循环
指数 方式扩增，即___ （6）结果：以_____ 2n （n为扩增循 环的次数） 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
3、人工合成法：
1）反转录法：
目的基因的mRNA 反转录 单链DNA (cDNA） 合成
双链DNA (即目的基因)
2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
四、目的基因的检测与鉴定
——检查是否成功
（一）、检测 1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入 了目的基因
（1）方法: （2）过程: DNA分子杂交
①.首先取出转基因生物的基因组DNA
②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素 等作标记,以此做探针
③.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显 示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中
按照外源DNA片段的来源：
含有一种生物的全部基因 ---基因组（总） 含有一种生物的部分基因 ---部---cDNA（部分）②构建基因的目的
在不知目的基因序列的情况下，便生物的全部DNA 用适当的限制酶切 一定大小的DNA片段 将DNA3）条件： 模板DNA( 需含有目的基因 )
四种脱氧核苷酸(dNTP)
热稳定DNA聚合酶(Taq酶） Mg2+(激活剂) 缓冲溶液 一对引物：一对寡核苷酸序列：与目的基因 的起始段互补 一段已知目的基因的核苷酸序列，以便 （4）前提： 根据这一序列合成引物
（5）过程
预变性（增加DNA变性的概率） 变性（解旋为单链）高温 退火（引物与单链互补结合）低温 延伸（在Taq酶的作用下合成 适温
③过程：
④优点
（2）基因枪法 （3）花粉管通道法
2、将目的基因导入动物细胞 ①方法：显微注射法 ②程序：
目的基因表达载体提纯 显微注射 受精卵 取卵（受精卵） 新性状动物
3、将目的基因导入微生物细胞 ①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少 ②方法：
用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表 达载体与感受态细胞混合 感受态 细胞吸收DNA分子
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法: 抗原抗体杂交
（二）、鉴定（个体生物学水平） 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
归纳步骤
归纳: 基因工程的基本操作程序
1. 获取目的基因 从基因 利用PCR 化学方法人工合成
2. 构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3. 将目的基因导入受体细胞
DNA分子杂交示意图
采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分 子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补 的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合 在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序 列的部位，仍然是两条游离的单链。
2、检测目的基因是否转录出了mRNA ①方法:
RNA分子杂交
②过程: 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若 出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA
一、目的基因的获取
（二）、获合成1、从基因中获取目的基因（1）基因
概念： 将含有某种生物不同基因的许多DNA 片断，导入到受体菌的群体中，各个受
非编码区
编码区下游 终止子
原核细胞的 基因结构
非编码区
2、真核C基因结构
非编码区 编码区 非编码区
编码区上游
启动子
与RNA聚合酶 结合位点
编码区下游
终止子
外显子 编码区
内含子 外显子 内含子
真核C基因结构 非编码区 非编码序列： 包括非编码区和内含子
3、原核细胞与真核细胞的基因结构比较
原核细胞 编码区是 _____的 连续 真核细胞 编码区是间隔的、 不连续 _____的
农杆菌转化法、显微注射法、感受态法
4. 目的基因的检测与鉴定
检测：是否插入、转录、翻译 鉴定：个体水平上的鉴定
蛋白质 mRNA 结构基因 的氨基 推测 的核苷 推测 的核苷酸 化学 合成 酸序列 酸序列 序列 目的 基因
二、基因表达载体的构建
——基因工程的核心
1、目的：
使目的基因在受体细胞中稳定存在， 并且可以遗传给下一代，同时使目的 基因能够表达和发挥作用。
所需物质：
它们各自 的作用是 什么?
2、基因表达载体的组成：
（二）方法
将目的基因导入 ——显微注射法 动物细胞 将目的基因导入 ——感受态细胞 微生物细胞
1、将目的基因导入植物细胞的方法：
（1）农杆菌转化法
①农杆菌特点：
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多 数单子叶植物没有感染能力
②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转 移到受体细胞，并整合到受体细胞RNA
反（逆）转录酶 单链互补DNA DNA聚合酶
双链cDNA片段、目的基因的获取 2 利用PCR扩增目的基因 聚合酶链式反应 ，是一 （1）概念：PCR全称为_______________ 体外 复制特定 DNA片段 的核酸合成技术 项在生物____ ___________
不同点
相同点
都由能够编码蛋白质的编码区 ______和具有 调控作用的非编码 ______区组成的
1.2 基因工程的基本操作程序ຫໍສະໝຸດ 基因工程基本操作的四个步骤
1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
编码蛋白质的结构基因 (一)、目的基因主要是______________________
基因的结构
一、原核C基因结构
非编码区 编码区上游 启动子 与RNA聚合酶结合位点
启动子：位于基因首端一段与RNA聚合酶结合并能起始 mRNA转录的序列。 终止子：位于基因尾端一段DNA序列，能终止mRNA转录。 RNA聚合酶:能识别启动子上结合位点的蛋白质。
编码区
非编码区 编码区下游 终止子
非编码区 编码区上游 启动子 编码区
复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因
它们各自 的作用是 什么?
启动子：驱动基因转录出 mRNA，最终获得蛋白质
终止子：能终止mRNA的转录 标记基因的作用是为了鉴别 受体细胞中是否含有目的基 因，从而将有目的基因的细 胞筛选出来
三、将目的基因导入受体细胞
受体细胞 内，并且在 目的基因进入 _________ （一）转化： 表达 的过程 受体细胞内维持稳定 _____和_____ 将目的基因导入 植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法