分子荧光分析法.ppt
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仪器分析课件12荧光分析法
f = 0.29
ex = 356nm em = 404nm
f = 0.36
16
2. 分子的刚性
• 同样具有*跃迁的长共轭分子中，刚性分子 增加了共平面性， 越大， 长移。
f = 0.2
-O
O
COO-
C H2
f = 1.0
-O
O
O
COO- 荧光素钠
17
原来不发生荧光的，如：8-羟基喹啉
消除干扰，提高选择性、灵敏度
脉冲激光
样品
干扰 组分
44
3. 同步荧光分析
固定，同时扫描激光光谱和发射光谱 若： = em - ex
Fsp = KcFem Fex 提高灵敏度和选择性
混合物的同步荧光光谱（ =3nm）
45
4. 胶束增敏荧光
CH3(CH2)11OSO3-Na+ 非极性疏水基团 极性亲水基团 增加溶解度 增加荧光效率 增加荧光的稳定性
• 荧光分析法的灵敏度高于紫外-可见分光光度法
荧光法
F=Kc
紫外法 A lg T lg I
I0
36
二、定量分析方法
1. 工作曲线法
用空白溶液调零 用标准溶液调满刻度
F cx
c1
c2 c3 c4 c5
20 40 60 80 100%
16 32 48 64 80%
37
2. 比例法（对比法）
光
强
荧光光谱 横坐标em， 度
纵坐标 发射光强度
400
500
(nm)
8
溶液荧光光谱通常具有如下特征
斯托克斯位移 荧光光谱的形状与激发波长无关 荧光光谱与激发光谱的镜像关系
ex = 356nm em = 404nm
f = 0.36
16
2. 分子的刚性
• 同样具有*跃迁的长共轭分子中，刚性分子 增加了共平面性， 越大， 长移。
f = 0.2
-O
O
COO-
C H2
f = 1.0
-O
O
O
COO- 荧光素钠
17
原来不发生荧光的，如：8-羟基喹啉
消除干扰，提高选择性、灵敏度
脉冲激光
样品
干扰 组分
44
3. 同步荧光分析
固定，同时扫描激光光谱和发射光谱 若： = em - ex
Fsp = KcFem Fex 提高灵敏度和选择性
混合物的同步荧光光谱（ =3nm）
45
4. 胶束增敏荧光
CH3(CH2)11OSO3-Na+ 非极性疏水基团 极性亲水基团 增加溶解度 增加荧光效率 增加荧光的稳定性
• 荧光分析法的灵敏度高于紫外-可见分光光度法
荧光法
F=Kc
紫外法 A lg T lg I
I0
36
二、定量分析方法
1. 工作曲线法
用空白溶液调零 用标准溶液调满刻度
F cx
c1
c2 c3 c4 c5
20 40 60 80 100%
16 32 48 64 80%
37
2. 比例法（对比法）
光
强
荧光光谱 横坐标em， 度
纵坐标 发射光强度
400
500
(nm)
8
溶液荧光光谱通常具有如下特征
斯托克斯位移 荧光光谱的形状与激发波长无关 荧光光谱与激发光谱的镜像关系
分子荧光分析法
1.荧光效率
能发射荧光物质条件： ①物质分子在紫外-可见光区有较强吸收的特定结构。 ②分子必须有较高的荧光效率。 ③Фf=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数
第五章 分子荧光分析法
2.分子结构与荧光的关系 （1）共轭双键结构：芳环杂环化合物，含共轭双键
脂肪烃π-π激 （2）分子的刚性平面：效应增加，可使荧光效率增
标作图E荧-λ激 （2）荧光光谱：固定入激以λ荧为横坐标，E荧纵坐
标作图E荧-λ荧
第五章 分子荧光分析法
4．激发光谱和荧光光谱的关系： （1）荧光发射光谱不随激发波长而改变。只强度改
变。因此荧光光谱只有一个谱带。 （2）激发光谱和荧光光谱呈现镜像对称关系。
第五章 分子荧光分析法
二、分子结构与荧光关系
第五章 分子荧光分析法
2．荧光的产生：分子跃迁到较高能级后，以无辐射 跃迁的形式下降到第一电子激发态的最低振动 能级，以光的形式放出所吸收的能量，由第一 电子激发态的最低振动能级回到基态各振动能 级，这种光称为荧光。
3．激发光谱和荧光光谱：是定性和定量分析的基础 （1）激发光谱：固定入荧以λ激为横坐标，E荧纵坐
第五章 分子荧光分析法
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程
1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ分子的激发态 （1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激
发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射 跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分 子去活化过程。 （2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有 轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方 向相反，称激发单线态。 （3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为 平行时是激发三线态。
构造：激发光源——单色器——样品池——单色 器——检测器等四部分
能发射荧光物质条件： ①物质分子在紫外-可见光区有较强吸收的特定结构。 ②分子必须有较高的荧光效率。 ③Фf=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数
第五章 分子荧光分析法
2.分子结构与荧光的关系 （1）共轭双键结构：芳环杂环化合物，含共轭双键
脂肪烃π-π激 （2）分子的刚性平面：效应增加，可使荧光效率增
标作图E荧-λ激 （2）荧光光谱：固定入激以λ荧为横坐标，E荧纵坐
标作图E荧-λ荧
第五章 分子荧光分析法
4．激发光谱和荧光光谱的关系： （1）荧光发射光谱不随激发波长而改变。只强度改
变。因此荧光光谱只有一个谱带。 （2）激发光谱和荧光光谱呈现镜像对称关系。
第五章 分子荧光分析法
二、分子结构与荧光关系
第五章 分子荧光分析法
2．荧光的产生：分子跃迁到较高能级后，以无辐射 跃迁的形式下降到第一电子激发态的最低振动 能级，以光的形式放出所吸收的能量，由第一 电子激发态的最低振动能级回到基态各振动能 级，这种光称为荧光。
3．激发光谱和荧光光谱：是定性和定量分析的基础 （1）激发光谱：固定入荧以λ激为横坐标，E荧纵坐
第五章 分子荧光分析法
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程
1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ分子的激发态 （1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激
发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射 跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分 子去活化过程。 （2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有 轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方 向相反，称激发单线态。 （3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为 平行时是激发三线态。
构造：激发光源——单色器——样品池——单色 器——检测器等四部分
第十一章荧光分析法.ppt
散射光干扰及消除
散射光：当一束平行光投射在液体试样上，大部分 被吸收或透过，小部分由于光子和物质分子相碰撞， 使光子的运动方向改变，而向不同方向散射形成的 光。
散射光包括瑞利散射光和拉曼光
瑞利散射光：无能量的交换，λ散射≈λ激发
拉曼光： 有能量转移， λ散射> <λ激发
干扰的消除
1）改变激发光的波长；
单色器1
样品池
单色器2
垂直方向
放大 与
记录
检测器
荧光仪特点
与分光光度计的主要差别
① 垂直测量方式, 消除透射光影响 ② 两个单色器，激发和发射，常用光栅
1 光源 A、白炽灯：钨灯、卤钨灯 B、气体放电灯：氢、氙、汞，
常用氙灯（波长： 250-700nm） C、激光光源 2 单色器
闪耀光栅
3 检测器 光电倍增管
5.弱荧光的芳香族化合物也可与荧光试剂作用生成 强荧光衍生物以提高测量灵敏度。
故药物中的胺类、抗菌素、维生素、甾体类均可 用荧光法测定。该法在体内药物定量分析中应用甚 广。
思考题
• 1.荧光和磷光在产生机制上有什么不同？
• 2.何谓荧光量子效率？哪些结构物质有较高荧光效率？
• 3.以下物质中可能有最强荧光的物质是（ ）。
6.（）荧光光谱形状与激发光的波长无关。
7. 荧光光谱的特征？
1. 所谓荧光，即指某些物质经入射光照射后，吸收了入射光的能量，从而辐射 出比入射光( )。
A. 波长长的光线
B. 波长短的光线
C. 能量大的光线
D. 频率高的光线
2. 下列说法正确的是(
)
A 荧光发射波长永远大于激发波长
B 荧光发射波长永远小于激发波长
分子荧光分析法
第五章 分子荧光分析法
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程
1.分子的激发态 （1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激
发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射 跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分 子去活化过程。 （2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有 轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方 向相反，称激发单线态。 （3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为 平行时是激发三线态。
构造：激发光源——单色器——样品池——单色 器——检测器等四部分
1.激发光源：能发出强度较大，连续稳定的光 源。
主要有：溴钨灯、氢灯、高压汞灯、氙弧灯 2.分光系统： 第一单色器（激发单色器）：位于光源与液槽
间，滤去非选择波长的激发光。 第二单色器（发射单色器）：位于液槽与检测器
之间，滤去反色光，散色光和杂质产生的荧 光。
第五章 分子荧光分析法
3.样品池：石英材质，四面透光。玻璃吸收323nm 以下紫外光。
4.检测器：荧光弱，检测器灵敏度要高。 光二极管阵列检测器。
二、仪器的类型 1.光电荧光计：滤光片荧光计。
溴钨灯，滤光片，光电管。 2.荧光分光光度计：氙灯，光栅，狭缝，
光电倍增管。
第五章 分子荧光分析法
第三节 定性定量分析
第五章 分子荧光分析法
第一节 第二节 第三节 第四节
基本原理 仪器 定性定量分析 荧光新技术和应用实例
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程 分子的激发态 荧光的产生 激发光谱和荧光光谱 激发光谱和荧光光谱的关系 二、分子结构与荧光关系 荧光效率 分子结构与荧光的关系 影响荧光强度的外界因素 荧光强度与荧光物质浓度的关系
第十三章-荧光分析法PPT课件
内部能量转换
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠 时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
.
6
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收 发射
第一激发单重态的最低振动能级
振动驰豫 内部能量转换
.
8
例题
1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后， 吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射 光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线
.
24
三、影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 酸度 散射光
学习目的: 提高荧光分析的灵敏度和选择性
.
25
1 溶剂对荧光的影响
萘在下列哪种溶剂中的荧光强度最强？ A 1－氯丙烷 B 1－溴丙烷 C 1－碘丙烷 D 1，2－二氯丙烷
1. 一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移， 荧光强度也增强。
OH N
C H2
芴φf 1.0
O N Mg1/2
.
21
（三）分子的刚性和共平面性
CH3
SO3Na
N
CH3 CH3
SO3NaN CH3
H CCH
H CC H
结论：在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共 平面性越强，荧光效率越大，荧光波长长移
（四）取代基效应
给电子基团 －NH2、 －OH、－OCH3、－NHR、－NR2荧 光效率提高、荧光波长长移
•
• • • •
cx
cs
.
34
二、定量分析方法
2、比例法（对照法）
Fs F0 KCs
FxF0KCx
Cx
Fx Fs
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠 时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
.
6
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收 发射
第一激发单重态的最低振动能级
振动驰豫 内部能量转换
.
8
例题
1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后， 吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射 光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线
.
24
三、影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 酸度 散射光
学习目的: 提高荧光分析的灵敏度和选择性
.
25
1 溶剂对荧光的影响
萘在下列哪种溶剂中的荧光强度最强？ A 1－氯丙烷 B 1－溴丙烷 C 1－碘丙烷 D 1，2－二氯丙烷
1. 一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移， 荧光强度也增强。
OH N
C H2
芴φf 1.0
O N Mg1/2
.
21
（三）分子的刚性和共平面性
CH3
SO3Na
N
CH3 CH3
SO3NaN CH3
H CCH
H CC H
结论：在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共 平面性越强，荧光效率越大，荧光波长长移
（四）取代基效应
给电子基团 －NH2、 －OH、－OCH3、－NHR、－NR2荧 光效率提高、荧光波长长移
•
• • • •
cx
cs
.
34
二、定量分析方法
2、比例法（对照法）
Fs F0 KCs
FxF0KCx
Cx
Fx Fs
分析化学课件-荧光分析法基本原理
仪器的校正
灵敏度 以能被检出的最低信号来表示
波长
在选定条件下用稳定荧光物质校正 用汞灯标准谱线校正
激发光谱和荧光光谱
双光束仪器时，误差可抵消
二、其他荧光分析技术简介
1.激光荧光分析 2.时间分辨荧光 3.同步荧光分析 4.胶束增敏荧光
谢谢
溶剂
水 乙醇 环己烷 CCl4 CHCl3
激 发 光（nm） 248 313 365 405 436 271 350 416 469 511 267 344 409 459 500 267 344 408 458 499 —— 320 375 418 450 —— 346 410 461 502
第二节 荧光定量分析方法
荧光分析法基本原理
一、分子荧光
（一）分子荧光的产生 1．分子的电子能级与激发过程
hc =
E
S0
S1*
T1*
电子能级的多重性 M＝2s＋1
振动驰豫
内转换 体系间跨越
磷光
吸收
荧光
外转换
（二）激发光谱与发射光谱
excitation spectrum
横坐标ex，纵坐标 发射光强度
fluorescence spectrum
一、荧光强度与物质浓度的关系
F=K’(I0-I) I=I010-ECL
F= K’I0(1-10-ECL) = K’I0(1-e-2.3ECL) 若c很小，Ecl ≤0.05 则
F=2.3K’I0Ecl=Kc
F=2.3K’I0ECL=KC
ECl≤0.05 F C ECl >0.05 F 与C不成正比
荧光分析法的灵敏度高于紫外-可见分光光度法
荧光法
F
分析化学课件 PPT讲义 荧光分析法
药物分析教研室
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.3 影响荧光强度的外部因素
▪ 温度 ▪ 溶剂 ▪ pH值 ▪ 荧光熄灭剂 ▪ 散射光
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.3 影响荧光强度的外部因素
硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与拉曼光谱(b)
荧光光谱
激发 320nm
激发350nm
荧光448nm
§2.1 荧光强度与物质浓度的关系
荧光分析法与UV-vis定量测定时仪器校正的区别
UV-vis
0
100%
T=0，A=∞
T=100%，A=0
关闭光闸，光不透 空白溶液，光全透
过，全吸收
过，不吸收
荧光分析法
F=0 空白溶液，不发射
荧光
F=100% 对照品溶液Cmax
F=50%(Cmid)
药物分析教研室
的荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间。用f表示。
• 荧光效率(fluorescence efficiemcy)：又称荧光量子产率
(fluorescence quantum yield)是指激发态分子发射荧光的光子数 与基态分子吸收激发光的光子数之比。f
• 荧光寿命和荧光效率是荧光物质的重要参数！
分析化学 Analytical Chemistry
药物分析教研室
药物分析教研室
概述
• 发光(phosphorescence)：物质受到一定波长的光照射后， 外层电子跃迁后返回基态时，以光辐射的形式释放能量，这 种现象称为发光。(荧光、磷光)
• 荧光(fluorescence)：物质分子接受光子能量被激发后，从 激发态的最低振动能级返回基万言书时发射出的光。
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.3 影响荧光强度的外部因素
▪ 温度 ▪ 溶剂 ▪ pH值 ▪ 荧光熄灭剂 ▪ 散射光
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.3 影响荧光强度的外部因素
硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与拉曼光谱(b)
荧光光谱
激发 320nm
激发350nm
荧光448nm
§2.1 荧光强度与物质浓度的关系
荧光分析法与UV-vis定量测定时仪器校正的区别
UV-vis
0
100%
T=0，A=∞
T=100%，A=0
关闭光闸，光不透 空白溶液，光全透
过，全吸收
过，不吸收
荧光分析法
F=0 空白溶液，不发射
荧光
F=100% 对照品溶液Cmax
F=50%(Cmid)
药物分析教研室
的荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间。用f表示。
• 荧光效率(fluorescence efficiemcy)：又称荧光量子产率
(fluorescence quantum yield)是指激发态分子发射荧光的光子数 与基态分子吸收激发光的光子数之比。f
• 荧光寿命和荧光效率是荧光物质的重要参数！
分析化学 Analytical Chemistry
药物分析教研室
药物分析教研室
概述
• 发光(phosphorescence)：物质受到一定波长的光照射后， 外层电子跃迁后返回基态时，以光辐射的形式释放能量，这 种现象称为发光。(荧光、磷光)
• 荧光(fluorescence)：物质分子接受光子能量被激发后，从 激发态的最低振动能级返回基万言书时发射出的光。
《分子发光分析法》PPT课件
F
0.11 0.29
λexmax(nm) 205 286
λemmax (nm) 278 321
蒽
丁省
0.46
0.60
365
390
400
480
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7-2
戊省 0.52 580 640
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3.荧光与分子结构的关系
• 2）刚性平面结构 荧光物质的刚性和平面性增加，
有利于荧光发射。
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3. 荧光和磷光光谱的产生
（1）荧光：
S1或T1 发光 S0
当电子从第一激发单重态S1的最低振动 能级回到基态S0各振动能级所产生的光 辐射叫荧光
荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生 速度快，10-9~10-6s，又叫快速荧光或瞬 时荧光，外部光源停止照射，荧光马上 猝灭
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7-2 提要 返10 回
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7-2 分子荧光分析法及其原理
• 一、分子荧光和磷光的产生
1.电子自旋状态的多重性
2. 无辐射跃迁
3. 荧光和磷光光谱的产生
二、分子荧光分析法的基本原理
1.激发光谱和荧光谱
2.荧光强度及其与浓度的关系
3.荧光与分子结构的关系
4.影响荧光强度的因素
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一、荧光和磷光光谱的产生(图)
• 具有不饱和基团的基态分子光照后，价 电子跃迁产生荧光和磷光
基态分子
光照激发
价电子跃迁到激发态
去激发光 * * n
基态
精选课件ppt
7-2
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1. 电子自旋状态的多重性
• 单重态：用 “S0” 表示 • 当物质受光照射时，基态电子能级跃迁至
第七章-分子荧光法
第七章分子荧光分析法第一节概述物质的分子吸收一定的能量后，其电子从基态跃迁到激发态，如果在返回基态的过程中伴随有光辐射，这种现象称为分子发光（molecular luminescence），以此建立起来的分析方法，称为分子发光分析法。
物质因吸收光能激发而发光，称为光致发光（根据发光机理和过程的不同又可分为荧光和燐光）；因吸收电能激发而发光，称为电致发光；因吸收化学反应或生物体释放的能量激发而发光，称为化学发光或生物发光。
根据分子受激发光的类型、机理和性质的不同，分子发光分析法通常分为荧光分析法，燐光分析法和化学发光分析法。
荧光分析法历史悠久。
早在16世纪西班牙内科医生和植物学家N.Monardes，就发现含有一种称为“Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现出极为可爱的天蓝色，但未能解释这种荧光现象。
直到1852年Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到它们能发射比入射光波长稍长的光，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射的不同波长的光，从而导入了荧光是光发射的概念，并根据荧石发荧光的性质提出“荧光”这一术语，他还论述了Stokes 位移定律和荧光猝灭现象。
到19世纪末，人们已经知道了包括荧光素、曙红、多环芳烃等600多种荧光化合物。
近十几年来，由于激光、微处理机和电子学新成就等科学科术的引入，大大推动了荧光分析理论的进步，促进了诸如同步荧光测定、导数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分辨荧光测定、荧光偏振测定、荧光免疫测定、低温荧光测定、固体表面荧光测定、荧光反应速率法、三维荧光光谱技术和荧光光纤化学传感器等荧光分析方面的发展，加速了各种新型荧光分析仪器的问世，进一步提高了分析方法的灵敏度、准确度和选择性，解决了生产和科研中的不少难题。
目前，分子发光分析法在生物化学，分子生物学，免疫学，环境科学以及农牧产品分析，卫生检验、工农业生产和科学研究等领域得到了广泛的应用。
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- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第五章 分子荧光分析法
3.样品池：石英材质，四面透光。玻璃吸收323nm 以下紫外光。
4.检测器：荧光弱，检测器灵敏度要高。 光二极管阵列检测器。
二、仪器的类型 1.光电荧光计：滤光片荧光计。
溴钨灯，滤光片，光电管。 2.荧光分光光度计：氙灯，光栅，狭缝，
光电倍增管。
第五章 分子荧光分析法
第三节 定性定量分析
一、定性分析 由两个特征光谱（荧光光谱，激发光谱）定性，可
靠性强。但一定有标准品作对照。
二、定量分析方法 1、标准曲线法： 2、直接比较法，空白荧光为F0时， Cs/Cx=(Fs-F0)/(Fx-F0)
第五章 分子荧光分析法
第四节 光新技术和应用实例
一、新技术 1.激光荧光分析：用波长更长，强度更大的激光作光源，提
大。 （3）取代基效应：
①给电子基：荧光效率提高。 ②吸电子基：荧光减弱熄灭。 ③对π电子共轭体系作用小，对F无影响。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
第五章 分子荧光分析法
3.影响荧光强度的外界因素 （1）温度：温度升高，碰撞增多，荧光效率降低。 （2）溶剂：不同溶剂中荧光光谱和荧光强度会有显
著变化。溶剂极性增加，荧光强度增大。 杂质可使荧光增强或减少。 （3）pH值：荧光物质为弱酸或弱碱，不同pH值，平 衡改变，使分子型体和离子型体的浓度及 比例不同，荧光强度有差异。 （4）散射光：因碰撞使运动方向改变而向不同角度 散射的光为散射光。 瑞利散射光只方向改变而波长不变的散射光。 莱曼散射光是方向和量都改变的散射光。
第五章 分子荧光分析法
第一节 第二节 第三节 第四节
基本原理 仪器 定性定量分析 荧光新技术和应用实例
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程 ➢ 分子的激发态 ➢ 荧光的产生 ➢ 激发光谱和荧光光谱 ➢ 激发光谱和荧光光谱的关系 二、分子结构与荧光关系 ➢ 荧光效率 ➢ 分子结构与荧光的关系 ➢ 影响荧光强度的外界因素 ➢ 荧光强度与荧光物质浓度的关系
第五章 分子荧光分析法
（5）荧光熄灭的影响 荧光熄灭：荧光物质，溶剂，溶质分子间相互作用
使荧光强度降低或与浓度不呈线性关系的现象 为荧光熄灭。 1）荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质。 2）荧光熄灭产生原因： ①荧光物质与熄灭剂碰撞，能量损失。 ②两者作用生成不发光的配合物。 ③向荧光物质中加入溴或碘后易发生无辐射去活 化过程。 ④荧光物质超过1g/L时，发生自吸收或聚合。 ⑤有溶解氧存在已发生氧化或促进无辐射去活化 过程。
第五章 分子荧光分析法
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程
1.分子的激发态 （1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激
发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射 跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分 子去活化过程。 （2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有 轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方 向相反，称激发单线态。 （3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为 平行时是激发三线态。
构造：激发光源——单色器——样品池——单色 器——检测器等四部分
1.激发光源：能发出强度较大，连续稳定的光 源。
主要有：溴钨灯、氢灯、高压汞灯、氙弧灯 2.分光系统： 第一单色器（激发单色器）：位于光源与液槽
间，滤去非选择波长的激发光。 第二单色器（发射单色器）：位于液槽与检测器
之间，滤去反色光，散色光和杂质产生的荧 光。
第五章 分子荧光分析法
2．荧光的产生：分子跃迁到较高能级后，以无辐射 跃迁的形式下降到第一电子激发态的最低振动 能级，以光的形式放出所吸收的能量，由第一 电子激发态的最低振动能级回到基态各振动能 级，这种光称为荧光。
3．激发光谱和荧光光谱：是定性和定量分析的基础 （1）激发光谱：固定入荧以λ激为横坐标，E荧纵坐
标作图E荧-λ激 （2）荧光光谱：固定入激以λ荧为横坐标，E荧纵坐
标作图E荧-λ荧
第五章 分子荧光分析法
4．激发光谱和荧光光谱的关系： （1）荧光发射光谱不随激发波长而改变。只强度改
变。因此荧光光谱只有一个谱带。 （2）激发光谱和荧光光谱呈现镜像对称关系。
第五章 分子荧光分析法
二、分子结构与荧光关系
第五章 分子荧光分析法
4．荧光强度与荧光物质浓度的关系 （1）荧光方向：荧光可在各方向观察到，因激发
光可部分透过溶液，为减小干扰，在与透射 垂直方向观测。 （2）选两个不同波长光：λ激、λ荧 （3）定量关系： F=K’C (abc≤0.05) 定量分析基础
第五章 分子荧光分析法
第二节 仪器
一、仪器的主要部件
1.荧光效率
能发射荧光物质条件： ①物质分子在紫外-可见光区有较强吸收的特定结构。 ②分子必须有较高的荧光效率。 ③Фf=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数
第五章 分子荧光分析法
2.分子结构与荧光的关系 （1）共轭双键结构：芳环杂环化合物，含共轭双键
脂肪烃π-π激 （2）分子的刚性平面：效应增加，可使荧光效率增
第五章 分子荧光分析法
第五章 分子荧光分析法
(Molecular Fluorescence spectrophotometry)
概述 1.荧光：当分子吸收一定能量后，跃迁至激发态。由
第一电子激发态的最低振动能级回到基态各振 动能级，以光的形式放出能量，产生荧光。 2.荧光分析法：通过测定所发射荧光的特性和强度， 对物质定性、定量分析的方法。 3.荧光分析法的优点：灵敏度高，最低检测浓度可达 10-7～10-9g/ml，选择性好，需样量少，方法简 便。
高荧光法的灵敏度和专一性。可协调激光 器作光源，荧光单色器省略。 2.同步荧光分析：激发光谱和荧光光谱中选择一适宜的波长 差值。 3.时间分辨荧光分析： 二、应用 1、无机物的荧光分析：8羟基喹啉及其衍生物，黄酮类试
剂，二氨基化合物 2、有机物的荧光分析：油脂苯并芘测定，尿中N-甲基尼克
酰胺。 3、核酸分子荧光探针