微生物文献总结

一、【沉默基因】是指在自然条件下存在于菌体中，处于不表达或者极低的表达水平，但在特定条件下可以被激活而表达活性产物的DNA序列。

早在1980年提出了通过基因克隆、诱变处理、菌株或种间自然结合及原生质体融合等方式激活沉默基因，现有的激活沉默基因的方法很多，根据它们设计的思路不同，本文将现有的方法分成遗传学方法、生态学方法和化学方法3类。

遗传学方法主要利用基因工程技术，通过在非同源宿主中表达完整的基因簇或者改变细胞间转录条件或者改变蛋白质合成机制等方式实现。

因此提高次级代谢产物的合成量可以通过改变调控、核糖体功能、蛋白修饰和染色体修饰等实现。

基于许多次生代谢生物合成基因簇具有的共同特点，即包含一个或者多个具有编码转录因子进而转录所有基因。

在生物体内，遵从分子遗传操作诱导型启动子可以替代转录因子的启动子。

通过对转录因子的合成能够实现反应从自然控制到实验者控制的转变。

从而实现转录因子的高表达，最终使得基因簇中所有的基因被激活表达出活性产物。

这一方法的优点是靶基因能够立刻产生代谢产物并且能提供大量的潜在产物。

但这种方法不适用于那些没有转录因子的基因。

除了利用基因簇特定的转录因子之外，还有利用次生代谢基因表达的最普通的调节因子。

1.核糖体工程，通过靶向核蛋白S12或RNA聚合酶（RNAP）来提供抗生素的产量。

理论依据是改变转录和转录机制可以大量增加细菌基因的表达。

不少抗生素（如链霉素），靶向核糖体后，会产生抗生素抗性的突变核糖体并可经简单的突变选择挑选出来。

在生物体中，这样的核糖体工程方法可以激活一个或一些沉默基因，而不是所有的生物合成基因簇，因而也不会激活特定的生物合成基因簇。

2.干扰蛋白质降解系统，大多数核蛋白和细胞质蛋白包括一些转录激活因子都会经蛋白酶途径降解，这一过程需要泛素标记的靶蛋白。

多蛋白COP90信号复合物（CSN）对控制这一过程起着关键作用。

CSN的第五个亚基CSN5/Csn E具有酶催化活性，可以将泛素类蛋白Nedd8从卡林E3泛素连接酶上分离下来。

通过将Nedd8共价连接到卡林的赖氨酸残基能够激活控制细胞内泛素标记的蛋白降解过程的E3酶。

而控制CSN5/Csn E的基因在真核细胞中是高度保守的，一旦缺失将导致动植物胚胎的死亡，但从真菌中的突变菌株中可以分离到具有新活性的次级代谢产物。

生态学方法：结合生态学考虑的方法，也被叫作OSMAC，通过改变微生物的发酵培养条件获得新化合物的方法，相应操作参数为介质成分，通气率，培养容器的型号以及外加的酶抑制剂等。

1、借助于种间的交互作用，共同培养是一种诱导产生独特活性的次级代谢产物的有效方法，该方法主要利用次级代谢产物与其他生物体的竞争作用产生的某种灵敏机制，这种机制通常发挥着对产物和环境的协调作用。

激活沉默基因可以借助于可以发生相互作用的外源菌株，从而获得具有新活性的代谢产物。

2、稀土元素处理，稀土元素包括钪、钇、镧系元素在内共17种元素，它们能够提高抗生素的产量，并在激活细菌的沉默基因和低表达基因方面有重要作用，土处理法不需要基因工程技术或者菌株的基因组学信息，加上稀土本身分布广泛，因此该方法灵活性强，可以将此应用于对沉默基因的激活产生具有新颖生物活性的化合物的研究。

化学方法：主要基于微生物生长代谢的必需物质，通过加入一些化学诱导子或者抑制剂等，影响必需物质的生物作用进而干扰微生物正常的生长代谢，激发沉默基因调控途径发挥作用，产生新的活性物质。

激活沉默
基因方法
激活沉默基因手段激活基因、抑制剂获得新颖生物活性天然产物
遗传学方法
生态学方法
化学方法1核糖体工程
2干扰蛋白质降解系
统
1借助于种间的交互
作用
2.稀土元素处理
1化学诱导子诱导
2抑制物作用
DMSO介导高浓庆大处理G59孢子
敲除编码COP9(CSN)一个亚基的csn E
基因
变青链霉菌与分枝菌酸细菌共培养
钪、钇、或者镧等系元素
ARC2通过部分抑制Fab
丁酸钠(HDAC的抑制剂)
四种抗肿瘤活性化合物
苔色酸,3,3 - (2,3 - 二羟基丙基)二吲哚
(DHPDI)
新阿奇霉素A (alchivemycin A)
抗性放线紫红素
未知化合物417.103和433.097 m/z
放线紫红素
二、双烯双炔类抗生素
双烯双炔类抗生素是指含有双烯双炔共轭大环发色团核心结构的一类抗生素。

其发色团中心活化后可形成芳香型游离基,当其靶向进入肿瘤细胞后可与DNA 分子链结合,迅速夺取两个来自DNA 的氢原子,使肿瘤细胞
的DNA 断裂,因此具有非常强的抗肿瘤活性，被认为是迄今为止抗肿瘤活性最强的一类抗生素。

新制癌菌素（NCS ）含蛋白质与双烯二炔生色团，它的抗肿瘤功能源于蛋白质释放的生色团。

经由硫醇攻
击活化后，烯二炔启动苯环化反应，产生自由基，造成细胞伤害。

NCS 由九个双烯核心，一个脱氧氨基糖，和一份萘酸组成。

NCS 生色团的萘甲酸成分扮演着两个重要的角色：一是有助于NCS 生色团与其载体蛋白Apo-NCS 连接, Apo-NCS 保护、运载、传递药物到DNA 靶点；另一个是嵌入DNA ，促使NCS 生色团定位在小沟内。

NCS 在临床上用于治疗白血病和其他多种癌症，在摩尔浓度下即可抑制肿瘤细胞生长。

生色团的屏蔽保护机制：菌体产生NCS 经硫醇诱导芳环化而活化，表现出高的抗癌活性和细胞毒性。

为
了不让抗生素失活，又不使产生的抗生素作用于自身，菌体巧妙地在载体蛋白结合孔穴内分布两个天冬氨酸残基，阻止环境中酸性硫醇的靠近，避免对抗生素的失活；同时自身表达中性硫醇诱导NCS 产生芳环化反应。

NCS 的结合和释放机制：完整的NCS(Holo-NCS ）由两部分组成，载脂蛋白(Apo-NCS)和生色团(NCS-C)。

NCS 生色团的萘基团被深深埋于疏水性区域组成结合口袋。

烯二炔环几乎垂直于萘甲环平面，夹在Phe78和由Cys37 - Cys47组成的二硫键中间。

氨基糖和碳酸酯部分外朝溶剂。

这样的疏水性接触导致不稳定的生色团和载脂蛋白-NCS 之间形成一个非常紧密的结合。

holo-NCS 可以穿透细胞膜进入目标细胞，并在细胞核附近及时释放生色团发挥其生物活性。

NCS 的穿膜机制：NCS 的蛋白质-配体复合物是一个12kD 大的热稳定型载体蛋白，它可以运载配体到哺乳动物细胞细胞核内，对核酸造成破坏。

HOLO-NCS 可内化并在细胞核内聚积。

细胞膜协助抗生素释放的生理作用的定量和动力学结果显示，NCS-C 的释放主要集中在脂质双层的附近，且增加率依赖于脂质浓度。

环境的疏水性越高，释放效率越高。

NCS-C 和apo-NCS 的之间的疏水相互作用依赖于环境的介电值。

烯二炔NCS 色蛋白的释放主要通过脂质双层低的介电引起的疏水性效果实现的。

载体NCS 作为细胞渗透蛋白的评价：Apo-NCS 具有功能上的互补决定区环结构，被假定为一种细胞穿透蛋白，可以作为细胞靶向的理想支架，可以在胞内运载小分子药物。

Apo-NCS 的很好稳定性激励人们努力为NCS 寻找配体，从而将它发展成为化疗药物。

这样的活性可以耦合NCS 到抗体的互补决定区。

重组的Apo-NCS 没有找到内化的证据。

说明Apo-NCS 的内化需要与发色团结合才能实现。

局限性：NCS 临床上用于治疗白血病和其他多种癌症，在摩尔浓度下即可抑制肿瘤细胞生长。

然而，其不稳定性和高毒性限制了临床使用。

解决思路：通过工程学方法合成ncs 同系物或许是可行的。

例如NCS 与聚苯乙烯-共-马来酸共轭生成的苯乙烯-马来酸NCS 的亲脂性和稳定比天然产物好，非常有效地提高了NCS 的临床疗效。

另外就是与靶向载体结合，提高其靶向性，减少对正常细胞的损害。

三、非达霉素的研究过程和临床评价
非达霉素（fidaxomicin ）是一个以阻碍蛋白合成为作用靶点的新型大环内酯类抗生素，主要用于艰难梭状芽孢杆菌感染（Clostridium difficile infection ，CDI)，其临床药效证明优于之前的万古霉素和甲硝唑治疗，非达霉素具有更快的全程治疗速度和更低的复发率。

非达霉素是一个放线菌来源的新型18元环的大环内酯类抗生素，由一个不饱和18元环核心和两个具有重要功能的侧链组成，在室温下以微粒晶体形式稳定存在，难溶于水。

目前，非达霉素分子量大，结构复杂，来源仍然为微生物发酵法，2009年Optimer 制药公司申请了其生产方法专利，即从菌株类指孢囊菌(Dactylosporangium aurantiacum )NRRL 18085发酵液中采用分离纯化工艺获得。

作用机制:非达霉素属于干扰细菌蛋白合成的新型靶点类新药，是细菌DNA 依赖性RNA 聚合酶的抑制剂，通过抑制细菌RNA 聚合酶转录阻断RNA 合成的起始，结合σ70亚基区域3.2和RNA 聚合酶β’-亚基开关，控制酶催化位点中的DNA 启动子.低浓度时，非达霉素可以通过干扰RNA 转录起始，阻碍蛋白合成；高浓度时，也可以在延长过程中作用于DNA 的合成。

非达霉素抑制梭状芽孢杆菌RNA 聚合酶比其他细菌种类效果要好，但在高浓度时，这种特异性基本丧失。

抗菌活性及临床评价：非达霉素是一种窄谱抗生素，对大多数梭状芽孢杆菌有较好的抗菌活性，对某些革兰阳性
2 种机制 关键角色 维持蛋白质稳定性
硫醇诱导的NCS 芳环化反应 生色团的屏蔽保护机制 蛋白质弹性力学参与化学催化机制 负电荷排斥保护生色团, 真菌硫醇进入
蛋白穴口
二硫键Cys37-Cys47扮演重要角色
细菌演化出单一的屏蔽功能
菌有中度抗菌效果，如葡萄球菌、肠球菌等，对革兰阴性菌、真菌、原虫无抑制作用。

非达霉素与其他干扰细菌蛋白合成类抗生素如利福霉素和利链菌素作用位点有所差异，因此无交叉耐药现象，研究发现非达霉素与利福平、氨苄青霉素、克林霉素和甲硝唑有协同作用，但与环丙沙星和万古霉素没有同样的效果
药代动力学研究：目前，非达霉素给药方式为口服，其分子量大、难溶于水等理化性质限制了静脉注射途径给药，但人体系统对非达霉素只有微量的吸收，血药浓度通常只有纳克级水平，并且不受空腹和饱腹状态影响。

非达霉素在体内的代谢为4位侧链上的O-异羟基酯水解，生成主要的代谢物OP-1118，再发生NADPH依赖的羟基化。

非达霉素和OP-1118 主要经粪便排泄，不到1%的量能在尿液中检测到。

不良反应：胃肠道疾病、代谢和营养疾病、皮肤和皮下组织疾病。

此外，还有血碱性磷酸酶增加、血中碳酸根减低、肝酶增高、血小板数量减少等。

非达霉素只用于治疗已证实或高度怀疑的由艰难梭菌引起的感染。

新型蛋白合成抑制类抗菌药：大环内酯类，GSK2251052，抑制亮氨酸-tRNA合成酶活性，G-菌，口服；
大环内酯类，GSK1322322，抑制肽去甲酰基酶甲基化，广谱，口服；
氟喹诺酮内酯类，solithromycin（CEM-101），抑制肽酰基转移酶，影响移位过程，广谱，口服、静脉注射；
肼基嘧啶类，CEM-102，抑制肽酰基转移酶，影响移位过程，金葡菌（包括MRSA）、β-溶血链球菌，口服；
酮内酯类，cethromycin，抑制肽酰基转移酶，影响移位过程，广谱，口服；
四环类，omadacycline，，抑制肽酰基转移酶，影响移位过程，广谱，口服、静脉注射；
恶唑烷酮类，radezolid 、tedizolid，抑制mRNA与核糖体连接，阻止70S起始复合物的形成，广谱，口服、静脉注射；
四、聚酮类组合生物合成：
存在的问题：一是理论认识不足限制了合理化设计，比如结构域之间的蛋白-蛋白相互作用研究不足，致使不同模块之间的杂合效果难以预见，往往组合之后却发现不能表达产物，浪费了大量的时间物力；二是许多产生菌生长缓慢，杂合后的产物往往产量很低，没有市场开发价值。

为此科学家们在途径设计方面，开发了光致交联技术(photocrosslinking)来检查结构域之间的相互作用，又开发了生物信息学手段(包括ClustScan和CompGen)帮助预测杂合后能否产生产物以及产物的结构等；在产量提高方面，主要是开发异源表达和优化表达条件，以及增加前体和更换前体等。

聚酮类是一类天然产物大家族，包括大环内酯类、四环类、蒽环类、烯二炔类等，比如抗感染的红霉素，抗肿瘤的埃博霉素，免疫抑制的他克莫司，以及降血脂的他汀类等。

聚酮类由于结构多样而且合成途径相似，因而特别适合于组合生物合成。

聚酮类由聚酮合成酶(PKS)合成，PKS分为3类，其中Ⅰ型、Ⅱ型研究较多。

组合后能否表达产物涉及很多因素，其中结构域之间是否兼容或者说匹配性是一个主要方面。

一般亲缘关系较近的结构域之间组合成功的可能性比较大，而研究发现近源的KS与AT末端具有一定的保守性，这可能是影响匹配与否的一个因素。

光致交联可以为匹配性提供指导。

光致交联一般只在同源性较近的结构域之间进行，据此人们可以初步排除一些不可能的选项，从而大大减小操作的盲目性。

光致交联首先要在ACP的ser上引入对苯甲酰L-苯丙氨酸(pBpa)，然后在365nm紫外线下ACP- pBpa与KS作用，最后通过SDS凝胶电泳检验分子量，以确定二者是否交联，进而推断其是否匹配。

同源的ACP与KS可以交联在一起，反之则不能。

生物信息学软件：常用的软件有ClustScan和CompGen，在其中输入序列信息并设置相应的参数，计算机即可对其进行组合并筛除不匹配的选项，匹配的组合则“生成”一系列子代聚酮，并给出相应的分子量、还原度等信息，进一步还可以查看预期产物的化学结构等。

提高产量的新进展：1.异源表达以提高产量：将所有有关聚酮合成的基因都导入到新的易培养的宿主中，并优化使其高表达产物。

此外，大量的沉默基因，以及宏基因组技术获得的大量基因也通过异源表达得到利用，从而得到更多新的产物。

异源表达的宿主一般选用E. coli或者几种常见链霉菌。

E. coli的优点是容易培养，倍增速度快，基因操作技术成熟；缺点是翻译后修饰不足，前体合成不足，产物的后修饰酶系缺乏。

因此需要向其导入某些翻译后修饰酶、前体合成酶以及产物后修饰酶系等。

而链霉菌本身就是许多聚酮的天然产生菌，因此具有较好的翻译后修饰、前体合成酶系等，但链霉菌的生长周期长，基因操作比较困难，而且自身的聚酮合成可能会竞争或干扰异源表达，使它们更倾向于合成自身产物而不是表达异源产物。

此外，科学家们还在积极探索生物的最小基因组，以便设计出具有最小代谢负担的微生物，并将其作为组合生物合成的“底盘”。

由于这些微生物基因组小，倍增速度特别快，而且“一心
一意”合成外源产物，因而可以以最小的能耗获得最大的产量。

2.前体的应用—提高产量或改变产物结构；前体的多少影响产量，前体的种类决定产物的结构，因此前体的优化也非常重要。

聚酮合成的前体一般为酰基辅酶A，异源宿主虽然能产生某些酰基辅酶A，但某些特殊的酰基辅酶A却不能合成，或者合成水平不足，因此异源表达通常都需要添加前体或者引入前体的合成途径。

添加前体的好处是可以避开基因操作的麻烦，而且添加量和添加种类可以灵活处理，便于控制；引入合成途径则是一劳永逸，而且长期成本也会比较低。

前体的意义还在于它可以改变产物的种类，得到新型的聚酮，也就是前体指导的合成(precursor-directed biosynthesis)。

这是由于PKS具有一定的“底物宽容性”，即底物专一性不严格，因此可以改换前体得到新的产物。

但这种“宽容性”是相对的，不同的PKS也有所不同，对此目前还很难预测。

；例如，他克莫司的合成前体烯丙基丙二酰辅酶(allylmalonyl-CoA)替换为异丁烯基丙二酰辅酶(isobutyrylmalonyl-CoA)，得到了36-甲基-FK506。

五、万古霉素耐药基因以及提高其抗菌活性的相关研究
万古霉素是三环糖苷化非核糖体肽的一种分支产物，由放线菌属的东方拟无枝酸菌（以前被命名为东方诺卡菌）通过发酵产生。

用于治疗由革兰阳性菌引起的严重感染疾病的抗生素。

万古霉素与替考拉宁(teicoplanin)都属于糖肽类抗生素，能够与肽聚糖合成前体lipoII中的D-Ala-D-Ala末端结合，从而抑制转肽反应来阻断高分子肽聚糖的合成，造成细菌因细胞壁缺陷而破裂死。

万古霉素的耐药性的产生有多种机制来解释，目前有两种机制是被普遍接受的。

第一种也是最常见的一种机制是肽聚糖合成前体末端上的D-Ala-D-Ala转变为D-Ala-D-Lac或者D-Ala-D-Ser，并伴随着由相关多肽酶介导的D-Ala-D-Ala的清除。

D-Ala-D-Lac和D-Ala-D-Ser结合万古霉素的亲和力与D-Ala-D-Ala相比，分别下降了1000倍和6倍，导致万古霉素不能与相应部位结合进而裂解细胞。

编码万古霉素抗性的相关酶基因位于具有多顺反子性的van操纵子上，具体有编码D-Ala-D-Lac和D-Ala-D-Ser连接酶的van A，van B，van C，van D，van E，van G，van L基因；编码丙酮酸脱氢酶的van H等基因；编码苏氨酸解旋酶的van T和van T G等基因；编码D,D-二肽酶的van X和van X B 等基因；编码D,D-羧肽酶的van Y, van Y B和van Y D基因。

这一机制被视为是产糖肽类抗生素的放线菌的自我保护方式。

第二种较为重要的机制认为耐药性是由内源的二组分调节系统(TCS)突变而引起的，而vanA，vanB，vanD基因簇均含有TCS。

研究指出S. aureus能够通过此机制获得耐药性。

TCS控制正常细胞壁代谢(WalRK基因控制)以及调控细胞壁损伤时的细胞应答（VraRS和GraRS基因控制）。

突变后，WalRK基因表达上调导致万古霉素抗性增加。

vanA基因簇是Tn1546转座子的一部分，其中包含了van R-vanS二组分调控系统序列。

v耐万古霉素的金黄色葡萄球菌(VRSA)的万古霉素抗性可由共感染VRE中的包含vanA基因的Tn1546转座子转移而来。

anA基因可突破种系限制而转入金黄色葡萄球菌中，选取了5种VRE(V anrRifs)作为基因供体菌，选取5种对利福平敏感的金黄色葡萄球突变菌株(VansRifr)作为基因受体菌，而后进行25种相应配对的连接。

结果表明共有2组菌株转化成功.
vanV基因是vanB基因簇的一部分，与vanYBWHBBXB成线性排列(图1)且不参与形成万古霉素抗性。

van G样基因簇有5个orfs，分别是调控区即van R和van S，效应区即van G，van XY和van T。

先前已有研究发现van G表型的菌株能够产生低水平的万古霉素抗性但对替考拉宁敏感。

van N是第一个被发现存在于D-Ala-D-Ser型万古霉素抗性E. faecium菌株中的基因。

van M基因与van A，van B，van D和van F分别具有81.8%，72.5%，67.7%和78.2%的相似度.具有7个orfs，其中一个orf与van A等基因的相同，其余6个分别为van R M，van S M，van Y M，van H M，van M和van X M。

由vanM基因簇产生的万古霉素抵抗是由于肽聚糖前体末端的组成变为了D-Ala-D-Lac。

vanR-vanS二组分调节系统的激活是诱导万古霉素抗性产生必须的，vanS感应激酶的激活依赖于和D-Ala-D-Ala 形成复合物,vanS产物从磷酸酶转换为激酶磷酸化vanR产生耐药。

Kalinka等利用一种合成的光亲和探针VPP证实了感应激酶是与抗生素在感应区直接结合而激活。

提高万古霉素抗菌活性的相关研究进展:利用万古霉素偶联金纳米颗粒(VBGNP)对抗耐万古霉素的金黄色葡萄球菌(VRSA)取得了一定的成果;叶酸标记羧甲基壳聚糖与EDBE共价连接形成的CMC-EDBE-FA纳米颗粒不具有抗菌活性和毒性。

将万古霉素装载到CMC-EDBE-FA上制备成具有万古霉素偶联的纳米颗粒(NV)，NV能够明显增加VRSA 的Na-K-ATP酶的活性.，而万古霉素不能，Na-K-ATP酶的活性增加使钾离子的释放增加和胞内在260nm有吸收的物质裂解进而细胞裂解增加。

六、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的SCCmec基因分型及耐药性研究：
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是一种具有多基因型及危险性的致病菌。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)不仅对青霉素和耐酶青霉素(如甲氧西林、苯唑西林和氟氯西林)耐药，还对氨基糖苷类、大环内酯类等药物产生多重耐药，己成医院感染的严重问题。

金黄色葡萄球菌对甲氧西林耐药是由甲氧西林耐药决定簇即mecA 基因（该基因编码青霉素结合蛋白2a即PBP2a，造成对所有β-内酰胺类药物耐药）介导的，这种基因是由一种特有的可移动的基因元件所携带，称为葡萄球菌染色体盒Staphylococcal chromosomal cassette (SCCmec)，整合在MRSA 菌株的染色体上。

SCCmec（21-76kb）是一种新型的可移动元件，不同于噬菌体和转座子，它可以在葡萄球菌属菌株之间水平传播，同时SCCmec 还可以整合除mec 基因以外的许多耐药基因，无论β-内酰胺类抗生素在体外药敏试验结果敏感与否，也可能同时对氨基糖苷类、大环内酯类和喹诺酮类产生耐药，因此对所有β-内酰胺类抗生素治疗无效，造成多药耐药。

采用分子生物学识别技术对SCC mec基因分类，己经分成Ⅰ-Ⅷ8种不同的类型[i]，在各个分型中又分别有具体的亚型，不同地区各型流行情况各异。

建立MRSA SCCmec 分类方法；了解MRSA 菌株流行类别，确定分离到的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA ) 葡萄球菌染色体盒(SCCmec)基因型，并进行耐药性研究，为临床诊断、防治疾病的流行与控制感染提供理论依据。

SCCmec分型的方法目前应用比较多的是Oliveira等提出的和Zhang等提出的多重PCR法。

Zhang法根据基因序列和结构确定基因，设计一系列引物。

一种单片段描述分型的特点而一条带对应着一种分型，简便，更容易判断结果，能鉴别Ⅰ~Ⅴ型和Ⅳ型的亚型。

但是结构单一，对于新型的SCCmec不能有效判断。

而Oliveira法是利用基因分析的基础上，选取9各位点A、B、C、D、E、F、H、M，包括特异性位点、共同位点、鉴别位点和对照位点。

M位点是SCCmec共有的位点，位于mecA基因里，可作为MRSA的阳性对照位点；A 位点位于pls基因的下游，是Ⅰ和ⅠA型共有的；B位点位于kdp基因的上游，是Ⅱ型的特异性位点；C位点位于mecⅠ基因的上游，是Ⅱ、Ⅲ型共有的；D位点位于mecA基因的下游dcs(恒定序列)，存在于Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型中；E位点质粒p1258和转座子Tn554之间，是Ⅲ型的特异性位点；F位点在转座子Tn554与SCCmec右侧切入点orfX之间，也是Ⅲ型的特异性位点；G位点在IS431与质粒pUB110之间，是ⅠA型的特异性位点，在Ⅰ型中不存在；H位点位于质粒pT181与IS431的结合处，存在于Ⅲ型，而ⅢA型中无，是Ⅲ与ⅢA型的鉴别点。

该方法能鉴别Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型，不能区分Ⅴ型及Ⅳ亚型。

但一些新型的鉴别有用处。

Oliveira 的多重PCR方法步骤包括：DNA 模板的制备，PCR 扩增PCR ，产物纯化及测序。

需要注意的是：由于引物比较多，若想PCR达到比较理想的结果，需要使反应体系中多对引物的浓度达到一定比例。

因此，需要先将引物按比例预混。

将合成的引物在简短离心，用灭菌去离子水稀释至100备用。

PCR结束之后需要进行基因测序比对。

由于SCCmec基因元件的移动，不断有新的SCCmec型或亚型的出现，原有的检测方法有一定程度的局限性，需要根据其基因序列的分析不断地改良。

同时原有的命名方法也许已不能适应新的要求。

菌株的药敏测定：(1)制备菌悬液(2)接种于培养基(3)药敏(4)观察记录
血浆凝固酶试验：病原性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使血浆中纤维蛋白原变为不溶性纤维蛋白，附于细菌表面，生成凝块，因而具有抗吞噬的作用。

凝固酶试验对于判定该菌株是否具有致病力，很有帮助。

葡萄球菌凝固酶试验被广泛地用于常规鉴定金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌。

MRSA的检测方法有纸片扩散法、E-test试验、PCR扩增mec A基因等。

一些新型的抗菌素被研发出来。

如：从海洋微生物假单胞菌变种UJ-6（Pseudomonas sp. UJ-6）分离到了抗MRSA 的活性物质、枝芽胞杆菌A的衍生物1a（marinopyrrole A），此化合物抗MRSA的活性万古霉素的4倍。

七、艾滋病疫苗
艾滋病病毒的特殊性：（1）高度的变异性，难以寻找到广谱中和抗体对其进行攻击；（2）可以将前病毒整合到宿主细胞的基因组中，逃避机体的免疫监视；（3）在感染早期就可以在宿主体内建立隐蔽的病毒库；（4）机体抗艾滋病的保护机制仍然不明确；
艾滋病疫苗的研究进程可以大致划分为3个阶段，第一个阶段是致力于研究体液免疫中的中和性抗体（neutralizing antibodies ，NAbs），意欲用重组的可溶性蛋白刺激机体产生中和抗体来消灭艾滋病毒，但是由于病毒的高度变异性而未能产生预防作用；第二个阶段是致力于研究刺激CD8 T细胞介导的细胞免疫，意欲用病毒载体来激活细胞途径特异。