酱香大曲中一株酿酒细菌的筛选及酶活测定

酱香大曲中一株酿酒细菌的筛选及酶活测定
赵群丽;吴天祥;刘昕
【摘要】以酱香大曲为研究材料,从中初筛选出14株细菌.利用透明圈初筛从中筛选出4株产淀粉酶的菌株以及2株产蛋白酶的菌株,采用液体发酵培养方法,考察其中的淀粉酶活力以及蛋白酶活力等指标,从而筛选出1株酶活力较高的菌株,命名为3J-1,其淀粉酶活力为3.72 U/mL,蛋白酶活力为70.15 U/mL.菌株3J-1通过16S rD-NA分子生物学鉴定为枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis).%Fourteen bacteria strains were isolated from Jiangxiang Daqu. 4 amylase-producing strains and 2 protease-producing strains were screened out by transparent circle method. Then strain 3J-1 (its amylase activity as 3.72 U/mL, its protease activity as 70.15 U/mL) was further screened out by measuring the activities of amylase and protease through liquid fermentation culture of those strains. Strain 3J-1 was then iden-tified as Bacillus subtilis through 16S rDNA sequencing&molecular biology.
【期刊名称】《酿酒科技》
【年(卷),期】2015(000)011
【总页数】4页(P41-44)
【关键词】微生物;酱香大曲;淀粉酶;蛋白酶;菌株;筛选
【作者】赵群丽;吴天祥;刘昕
【作者单位】贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳550025;贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳550025;贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳550025
【正文语种】中文
【中图分类】TS261.1;Q93-3;TS262.3;TS261.7
茅台酒是我国传统酱香蒸馏酒的代表，与白兰地、威士忌、俄得克、兰姆酒、金酒并列为世界六大蒸馏酒。

而我国白酒种类繁多，地方性强，香型各异，产品各具特色，生产工艺各有特点。

酱香型白酒是我国白酒主要香型之一，以茅台酒为代表，其风格特征是酱香突出、幽雅细腻、酒体醇厚、回味悠长、空杯留香持久［1］。

白酒酿造是多种微生物共同参与的过程。

大曲是大曲酒酿造中的糖化发酵剂，其中含有多种微生物菌系和各种酿酒酶系。

大曲中与酿酒有关的酶系主要有淀粉酶（包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和糖化型淀粉酶）、蛋白酶、纤维素酶和酯化酶等。

大曲
中的微生物包括细菌、霉菌、酵母菌和少量的放线菌，但在大曲酒发酵过程中起主要作用的是酵母菌和专性厌氧或兼性厌氧的细菌［2］。

酱香大曲的质量直接影响酒的品质及产量，因此，研究酱香大曲中的细菌具有十分重要的现实意义。

本实验以酱香大曲为菌株筛选源，从中筛选出1株淀粉酶活力、蛋白酶活力较高的菌株。

1.1 材料
原料：酱香大曲（采自贵州省仁怀市某酒厂）。

分离培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，
琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，121℃灭菌20 min。

种子培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，蒸馏水1000 mL，121℃灭
菌20 min。

淀粉酶透明圈培养基［3］：可溶性淀粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖0.5%，NaCl 0.5%，牛肉膏5%，琼脂2%，121℃灭菌20 min。

淀粉酶发酵培养基［3］：玉米粉2%，黄豆饼粉1.5%，CaCl20.02%，
MgSO40.02%，NaCl 0.25%，K2HPO40.2%，柠檬酸钠0.2%、硫酸铵0.075%
（溶解后加），Na2HPO40.2%，pH7.0，121℃灭菌20 min。

酪素培养基［4］：干酪素20 g，葡萄糖1 g，K2HPO41 g，KH2PO41 g，NaCl 5 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，121℃灭菌20 min。

蛋白酶发酵培养基［5］：（NH4）2SO41 g，酵母浸出粉1 g，葡萄糖1 g，NaCl 1 g，MgSO40.5 g，MnCl20.05 g，CaCl22 g，干酪素2g，蒸馏水
1000mL，pH7.0，121℃灭菌20min。

仪器设备：高压灭菌锅，电热恒温培养箱，超净工作台，恒温振荡摇床，电子恒温水浴锅，紫外分光光度计。

1.2 实验方法
1.2.1 菌株的分离纯化
（1）稀释涂布平板分离法：称取10 g酱香大曲在研钵中研磨后（无菌条件下），置于装有玻璃珠的90 mL无菌水中，振荡20 min，使样品与水充分混合后，沸水浴10 min，静置后取上清液1 mL置于9 mL无菌水试管中，得到10-1的稀释液，以此类推，依次制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的稀释样。

吸取100 μL梯度稀释液10-4、10-5、10-6、10-7均匀涂布于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上进行初步分离，置于37℃培养箱中培养24 h。

（2）划线平板分离法：根据稀释涂布平板分离所得到的单菌落的特征，挑取形态不同的菌株在平板上划线纯化3～4次，得到单菌落后接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基斜面，37℃培养24 h后保藏备用。

1.2.2 产淀粉酶菌株的初筛
经分离纯化后的细菌，用透明圈法进行初筛。

将分离纯化得到的细菌在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上活化2次后点种于淀粉酶透明圈培养基平板中，倒置于37℃
培养箱中培养，24 h后倾倒稀碘液于菌落周围，在菌落周围有透明圈产生证明该
菌株产淀粉酶。

用游标卡尺分别测量出菌落直径D和透明圈直径d的大小，每组
重复3块平板，计算平均值。

根据两者比值（d/D）大小初步确定淀粉酶活力高低，所得比值越大，表示产淀粉酶能力越强［6］。

1.2.3 产淀粉酶菌株的复筛
淀粉酶菌株的复筛采用3，5-二硝基水杨酸显色法［3］。

（1）按表1绘制麦芽糖标准曲线。

①取19支20 mL具塞刻度试管，预先洁净灭菌干燥编号，按表1加入试剂（每个浓度做3个平行）；②摇匀，沸水浴中煮沸
5 min。

取出后冷却至室温，加蒸馏水定容至20 mL，以1号管作为空白，在520 nm波长下比色测定吸光度值，并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。

（2）粗酶液淀粉酶活力测定
①待测粗酶液的制备。

将淀粉透明圈初筛得的菌株经平板活化后接种于种子培养基中，37℃培养24 h，然后以3%的接种量接种于淀粉发酵培养基中摇床培养，160 r/min、37℃培养48 h后将发酵液以4000 r/min离心20 min，收集上清液即为待测粗酶液。

②按以下顺序操作。

取20 mL具塞刻度试管，预先洁净灭菌干燥，编号。

取粗酶
液1 mL，2%的可溶性淀粉1 mL，蒸馏水3 mL，于60℃水浴中预热5 min，加浓度0.1 mol/L pH6.0柠檬酸缓冲液1 mL，于60℃水浴中保温30 min，再加入
1.5 mL 3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5 min，迅速冷却，加蒸馏水定容至20 mL。

③空白对照加发酵液后加pH值为3.6以下的酸钝化α-淀粉酶，使酶失活，其余
步骤同上。

④定容后，摇匀，用分光光度计测定OD520 nm值。

1.2.4 产蛋白酶菌株的初筛
经分离纯化后的细菌，用透明圈法进行初筛。

将分离纯化得到的细菌在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上活化2次后点种于蛋白酶透明圈培养基平板中，倒置于37℃
培养箱中培养，24 h后观察平板。

菌落周围有透明圈产生，证明该菌株产蛋白酶。

用游标卡尺分别测量出菌落直径D和透明圈直径d的大小，每组重复3块平板，
计算平均值。

根据两者比值大小初步确定蛋白酶活力高低，所得比值越大，表示产蛋白酶能力越强。

1.2.5 产蛋白酶菌株的复筛
蛋白酶菌株的复筛采用福林酚法［7］。

（1）酪氨酸标准曲线的绘制。

取不同浓度酪氨酸溶液1 mL，各加入5 mL的0.4 mol/L碳酸钠溶液，福林酚试剂1 mL，于40℃下恒温水浴显色20 min，用分光光度计680 nm波长下比色测定吸光度值，用空白管（酪氨酸为0 μg/mL）作对照，以吸光度值为纵坐标，以酪氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。

（2）粗酶液淀粉酶活力测定
①待测粗酶液的制备。

将蛋白酶透明圈初筛得到的菌株经平板活化后接种于种子培养基中，37℃培养24 h，然后以3%的接种量接种于蛋白酶发酵培养基中摇床培养，160 r/min、37℃培养48 h后将发酵液于4000 r/min离心20 min，收集上清液即为待测粗酶液。

②试样测定。

吸取粗酶液1 mL注入10 mL离心管，在40℃水浴中预热5 min，准确加入20 g/L酪蛋白溶液1 mL，计时准确保温10 min，立刻加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸溶液，以沉淀多余的蛋白质，终止酶解反应，15 min后离心分离。

吸取上层清液1 mL注入试管中，加入5 mL 0.4 mol/L的碳酸钠溶液和1 mL福
林酚试剂，摇匀，在40℃水浴显色20 min。

③空白试验。

与试样测定同时进行，离心管中先后注入粗酶液1 mL、三氯乙酸2 mL、20 g/L酪蛋白溶液1 mL。

15 min后离心分离，以下操作均与试样测定相同。

以空白试液为对照，在680 nm波长下比色测定吸光度。

1.2.6 目标菌株的鉴定
1.2.6.1 目标菌株菌落及形态观察
将分离得到的目标菌进行菌落形态观察和个体形态显微观察进行初步鉴定。

1.2.6.2 分子生物学鉴定
将筛选出的目标菌株送生工生物工程（上海）股份有限公司进行16S rDNA分子
生物学鉴定。

2.1 分离纯化
根据分离平板上单菌落的菌落形态特征初步选定14株细菌进行复筛。

2.2 菌株的初筛
通过透明圈法对分离出的14株细菌株进行初步筛选。

淀粉酶透明圈的直径和菌落直径的测定结果见表2，蛋白酶透明圈的直径和菌落直径的测定结果见表3。

淀粉透明圈培养基中的淀粉被细菌分泌出的淀粉酶分解以后，用碘显色剂进行显色，菌落周围产生透明圈。

淀粉分解越多，则透明圈越大，表明该菌株产糖化酶能力越强，反之则越弱。

由表2可知，直径比值（d/D）＜2的有2株，直径比值（d/D）＞2的有2株。

从中选取直径比值（d/ D）大于2，即产淀粉酶能力较强的2株
3J-1、3J-3进行下一步的复筛实验。

菌株代谢产生的蛋白酶与酪素培养基中的干酪素发生生化反应而产生透明圈，透明圈越大，表明该菌株产蛋白酶能力越强，反之则越弱。

分离纯化得到的14株菌中只有3J-1、3J-3产蛋白酶，选定这2株菌进行下一步的复筛实验。

2.3 菌株的复筛
通过透明圈法初筛得到2株菌3J-1、3J-3用于液体发酵并测定其粗酶液的淀粉酶活力和蛋白酶活力。

2.3.1 麦芽糖标准曲线
2.3.2 酪氨酸标准曲线
2.3.3 淀粉酶和蛋白酶活力测定结果（见表4）
由表4可知，菌株3J-1粗酶液的淀粉酶和蛋白酶活力相对较高，分别为3.72
U/mL、70.15 U/mL，所以确定3J-1为筛选的目标菌株。

2.3.4 目标菌株的鉴定
以菌株3J-1的基因组DNA为模板，经PCR扩增出16S rDNA序列，大小为1452 bp，其电泳检测结果见图3。

将3J-1菌株扩增得到的16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列进行比较，从GenBank中获得和该菌株序列相近种、属的16S rDNA序列，应用MEGA5软件构建系统发育树，见图4。

菌株3J-1与枯草芽孢杆菌的同源性最高，相似度达99%，可确定3J-1为Bacillus subtilis。

通过平板稀释涂布分离从酱香大曲中分离得到14株细菌，再通过透明圈法初筛出4株产淀粉酶的菌株和2株产蛋白酶的菌株，接着将其液体发酵测定粗酶液的淀粉酶活力和蛋白酶活力，最终得到1株淀粉酶活力和蛋白酶活力相对较高的菌株3J-1。

经过生工生物工程（上海）股份有限公司进行16S rDNA鉴定，结果表明，菌株3J-1为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

从酱香大曲中筛选得到的枯草芽孢杆菌是高温大曲中主要芽孢杆菌群之一，有研究表明芽孢杆菌在大曲发酵过程中产生的淀粉酶和蛋白酶等多种酶类和代谢产物对酱香风味的形成有较大贡献［8］。

后续研究将以该菌株为目标菌用于酿酒试验，并对其液态发酵工艺进行优化。

【相关文献】
［1］吴天祥，田志强.品鉴贵州白酒［M］.北京：北京理工大学出版社，2014：16-17.
［2］肖冬光.白酒生产技术［M］.北京：化学工业出版社，2005：72-73.
［3］唐丽江，王振华，王迪.高产淀粉酶芽孢杆菌菌株的筛选［J］.安徽农业科学，2009，37（12）：5362-5363.
［4］卫春会，黄治国，黄丹.高温大曲高产蛋白酶菌株的分离鉴定及其产酶性能研究［J］.食品与机械，2014，30（4）：24-29.
［5］马校卫，颜林春，汤二将，等.高温大曲中产耐热性蛋白酶芽孢杆菌的筛选和鉴定［J］.食品工业科技，2012（15）：169-173.
［6］王旭亮，王异静，王德良，等.白酒发酵高糖化性能霉菌的筛选及鉴定［J］.酿酒科技，2012（9）：22-28.
［7］王福荣.酿酒分析与检测［M］.北京：化学工业出版社，2012：14-15.
［8］罗建超，谢和.大曲中产酱香芽孢杆菌的筛选及其代谢产香探析［J］.酿酒科技，2012（5）：35-40.。