腹毛目纤毛虫颗粒尖毛虫射出胞器的研究

腹毛目纤毛虫颗粒尖毛虫射出胞器的研究
唐文君;范鑫鹏;倪兵;顾福康
【摘要】Ultrastructural observation showed that a great number of long elliptical extrusomes were distributed beneath the pellicle on the dorsal and ventral sides of a hypotrichous ciliate , Oxytricha granulifera.The mature extrusomes were filled with different electron dense fibrous materials at their posterior parts , and had hollow cavities at their anterior parts .The anterior end of the mature extruso-mes was close to the pellicle, and distributed in longitudinal, diagonal or arc rows.During ejection, the anterior membrane of extruso-mes fused with the plasma
membrane .After extrusion , the extruded contents often remained in the surface of the cells .Considered that the extruded contents of extrusomes of O.granulifera always adhere to the surfaces of the cells and its morphology has no obvious differ -ence from the resting extrusomes , it can be supposed that during ejection , the contents may be slowly excreted toward outside through the pellicle.Therefore, the extrusomes of O.granulifera might be a kind of excretion extrusomes .Besides, the extrusomes of O.gran-ulifera can be stained by alcian blue 8GS which can rapidly stain mucin , carboxyl and sulphate-containing mucosubstances , therefore, the extrusomes of O.granulifera may contain some mucosubstances .Under the stimulus of methyl green-pyronin, the extrusomes of O. granulifera were numerously discharged , and the extruded contents of extrusomes got together to form a "capsule"which
packed the ciliate in it, thus, it might be a defensive response to harmful conditions .%超微结构观察显示，腹毛类纤毛虫颗粒尖毛虫（ Oxytricha granulifera）的整个背腹皮层表膜下分布大量的长椭圆形射出胞器。

胞器发育成
熟后，在泡后部充满不同电子密度的纤维物质，在泡前端形成凹陷小窝。

成熟射出胞器前端紧贴表膜，以纵向、斜向或弧形的列位于表膜下。

胞器射出时，前端的膜与细胞质膜融合，射出内容物后，射出物常留在细胞表面。

联系胞器射出后射出物常黏附在细胞表面，且其形态与成熟射出胞器无明显差异的现象，推测胞器射出时射出物可能经历了通过表膜向细胞外缓慢逸出的过程，因此，该射出胞器可能是一类分泌型射出胞器。

此外，颗粒尖毛虫的射出胞器可被阿尔新蓝溶液标记，由于该溶液可以快速地标记粘蛋白（mucin）及羧基化或硫酸化的粘液物质，因此认为，颗粒尖毛虫射出胞器可能含此类粘液物质；在甲基绿－派洛宁的刺激下，颗粒尖毛虫的射出胞器大量射出，射出物黏附聚集形成“壳”，将纤毛虫包裹在内，据此认为，这可能是细胞在不利环境条件下形成的一种防御机制。

【期刊名称】《生物学杂志》
【年(卷),期】2016(033)004
【总页数】5页(P38-42)
【关键词】颗粒尖毛虫;射出胞器;形态特征;结构组分;功能
【作者】唐文君;范鑫鹏;倪兵;顾福康
【作者单位】华东师范大学生命科学学院，上海200062;华东师范大学生命科学
学院，上海200062;华东师范大学生命科学学院，上海200062;华东师范大学生
命科学学院，上海200062
【正文语种】中文
【中图分类】Q954
纤毛虫细胞表膜下具有一类由膜包裹，遇到刺激时易于射出的特殊的细胞器，即射出胞器[1]。

关于射出胞器的报道主要集中于一些低等类群纤毛虫的射出胞器，如
刺丝泡[2-3]、黏液泡[4-5]等。

近年来的研究发现，在高度进化的腹毛类纤毛虫中亦存在不同类型的射出胞器，如冠突伪尾柱虫(Pseudourostyla cristata)的“类刺丝泡”射出胞器[6]、念珠异列虫(Anteholosticha monilata)的“蘑菇状”射出胞器[7]以及印度原毛虫(Architricha indica)的“杯状”射出胞器[8]等。

本文利用扫
描电镜术、透射电镜术、阿尔新蓝标记以及甲基绿-派洛宁处理等方法，对颗粒尖
毛虫射出胞器的分布和结构特征、射出胞器的内含物及可能的功能等进行了探究，所得结果可对进一步认识腹毛类纤毛虫细胞结构的分化及其胞器的功能提供新的资料。

1.1 材料
颗粒尖毛虫于2014年采自沙特一农场土壤，经分离后，以麦粒发酵产生的细菌为食，建立纯培养。

1.2 方法
扫描电镜样品制备：参照顾福康等[9]的方法稍加修改。

吸取状态良好的虫体，1%锇酸和饱和升汞1∶6混合，4℃下固定10 min。

蒸馏水洗涤3次，梯度酒精脱水，临界点干燥，离子溅射仪喷金，扫描电镜(Hitachi S-4800)观察。

透射电镜样品制备：按顾福康等[10]的方法稍加修改。

吸取状态良好的虫体，以2.5%的戊二醛和2%的锇酸1∶1混合后，4℃下固定10 min，蒸馏水洗涤3次，再以1%锇酸于4℃下固定60 min，蒸馏水洗涤3次，梯度丙酮脱水，812包埋
剂包埋，超薄切片、染色，透射电镜(HT7700)观察。

阿尔新蓝标记：参考Steedman[11]的阿尔新蓝标记方法并加以修改，将虫体加入波恩液中，室温下固定5 min，蒸馏水洗涤3次，加入pH 2.5溶于3%乙酸的1%阿尔新蓝8GS溶液，室温下染色20 min，蒸馏水洗涤3次，显微镜(Olympus BX51)下观察。

甲基绿-派洛宁处理及其扫描电镜样品制备：参照Foissner[12]的甲基绿-派洛宁活体染色方法。

将甲基绿-派洛宁溶液稀释至极低浓度(0.003%)，加入状态良好的虫体，室温下处理2～3 min，吸取适量处理后的虫液滴于载玻片上，将四角涂上少量凡士林的盖玻片置于虫液上，显微镜(Olympus BX51)下观察。

将经极低浓度甲基绿-派罗宁处理后的虫体，按照上述扫描电镜样品制备方法进行样品制备，扫描
电镜(Hitachi S-4 800)观察。

2.1 扫描电镜观察
非分裂期颗粒尖毛虫细胞背、腹皮层表面含有大量的颗粒样结构(图1-A、图1- B)。

进一步放大显示，这些颗粒为颗粒尖毛虫细胞表面处于不同射出状态的射出胞器射出物。

在细胞腹面额棘毛之间区域，颗粒分布比较稀疏，排列无规则(图1-C)；在缘棘毛与腹棘毛之间的区域，颗粒以连续的纵向短列状分布(图1-A)；在腹面末端，颗粒以4～5列呈弧形排列(图1-D)。

在细胞背面，前端的颗粒以4～5列呈弧形
分布，此后的颗粒主要以纵向和斜向的短列分布(图1-B、图1-E)。

此外，在分裂
期和生理改组期细胞表面也含有相似的颗粒，但颗粒稀疏分布(图1-F、图1-G)。

细胞皮层表面横断面显示，成熟的射出胞器定位于细胞表膜下，呈长椭圆形，长约1 μm，宽约0.5 μm，靠近细胞表膜的一端扁平，另一端稍尖(图1-H)。

细胞表面可见处于不同射出状态的射出物(图1-I)。

胞器射出物的形态与定位在表膜下的成
熟射出胞器无明显差异，其前端扁平具小窝，小窝直径约为0.2 μm，尾部稍尖，且射出物常留在细胞表面(图1-J)。

2.2 透射电镜观察
成熟的射出胞器定位于细胞表膜下，由单层膜包裹，内含电子密度不同的纤维状物质，膜内电子密度由外到内逐渐降低，中心区域电子密度较低，顶端凹陷小窝内几乎无电子密度(图2-A)。

在细胞质内亦存在大量的处于不同发育阶段的囊泡样射出胞器前体，胞器前体不断向表膜迁移，其内含物的电子密度逐渐增加(图2-B)。

大致可分为4个阶段：1)囊泡边缘出现低电子密度的纤维物质(图2-C)；2)囊泡边缘的纤维物质进一步增加，同时囊泡由椭圆形变为一端扁平另一端稍尖的不对称形态，扁平的顶端几乎无电子密度(图2-D)；3)囊泡边缘的纤维物质不断聚集形成高电子密度的纤维层(图2-E)；4)囊泡内的纤维物质由边缘向中心逐渐延伸，最终除了顶
端凹陷小窝和中心区域外，纤维物质几乎充满整个囊泡(图2-F)。

射出胞器射出时，胞器前端的膜与表膜融合(图2-F、图2-G)，射出内容物后，相应部位成一空泡(图2-H)，射出物则常留在细胞表面(图2-I、图2-J)。

2.3 阿尔新蓝标记观察
颗粒尖毛虫经1%阿尔新蓝8GS溶液(pH 2.5)染色显示，在细胞背、腹面分布大量的蓝色颗粒(图3-A、图3-B、图3-C)。

蓝色颗粒在腹面前端排列不规则，在腹面
末端呈弧形排列，其他部分呈纵向短列状分布(图3-A)；蓝色颗粒在背面前端呈弧形排列，其他部分呈纵向和斜向短列分布(图3-B)。

细胞侧面显示，蓝色颗粒在细胞表膜下呈长椭圆形(图3-D)。

蓝色颗粒的排列及形状与扫描电镜观察的射出胞器排列及形状一致，说明颗粒尖毛虫射出胞器可被阿尔新蓝标记。

2.4 甲基绿-派洛宁处理及其扫描电镜观察
在极低浓度甲基绿-派洛宁处理下，颗粒尖毛虫分泌物质形成“壳”，包裹整个细
胞(图4-A)。

放大观察发现，“壳”是由许多杆状颗粒紧密粘附形成的(图4-B)。

将从“壳”逸出的细胞重新培养，部分细胞仍能够存活。

进一步观察经极低浓度甲基绿-派洛宁处理后的扫描电镜样品发现，将细胞包裹起来的杆状颗粒，实际上是
大量的呈长杆状的射出胞器射出物(图4-C、图4-D)，该射出物长约2 μm，宽约
0.5 μm，一端扁平具凹陷小窝，另一端稍尖(图4-F、图4-G)。

其逸出的细胞表面仍残留有少量的颗粒物(图4-E)。

3.1 颗粒尖毛虫射出胞器特征及其与其他纤毛虫射出胞器的比较
超微结构观察显示，颗粒尖毛虫的整个背腹皮层表膜下含有大量的长椭圆形射出胞器。

胞器发育成熟过程中，首先在胞质囊泡内缘出现低电子密度的纤维物质，纤维物质不断聚集形成高电子密度的纤维层，向泡中心逐渐延伸，最终形成在泡后部充满不同电子密度的纤维物质和泡前端凹陷小窝的成熟胞器。

成熟胞器以纵向、斜向或弧形的列位于表膜下，其前端紧贴表膜。

胞器射出时，其前端的膜与细胞质膜融合，射出内容物后，射出物常留在细胞表面。

近年来，作者所在实验室在对腹毛类纤毛虫射出胞器的研究中先后对冠突伪尾柱虫(P. cristata)[6]和印度原毛虫(A. indica)[8]的射出胞器进行了较系统的观察。

相比之下，颗粒纤毛虫射出胞器与冠突伪尾柱虫射出胞器在形态上有较大差异，而与印度原毛虫相比较，尽管两者射出胞器在形态上有相似之处，但颗粒尖毛虫射出胞器的前端结构及胞器在细胞腹面的分布则与印度原毛虫有差异。

值得注意的是，如同印度原毛虫[8]那样，颗粒尖毛虫射出胞器在胞器射出后射出物常黏附在细胞表面，且其形态与成熟射出胞器无明显差异的现象，联系该纤毛虫扫描电镜和透射电镜样品中经常显示其胞器射出物暴露于细胞表面所显示的不同逸出状态特征，对照草履虫(Paramecium)的刺丝泡、四膜虫(Tetrahymena)的黏液泡等其他纤毛虫的射出胞器，其胞器射出物快速通过表膜逸出后形态发生明显变化、在大多数情况下并非黏附在细胞表面的情况[1,13-14]。

作者推测，颗粒尖毛虫的射出胞器其胞器射出
时射出物是缓慢逸出的，其胞器射出过程中其射出物可能经历了通过表膜向细胞外分泌的过程，因此，该射出胞器可能是一类分泌型射出胞器。

3.2 颗粒尖毛虫射出胞器的结构组分
纤毛虫中不同类型的射出胞器可能含有不同的结构组分。

例如，双小核草履虫
(Paramecium aurelia)刺丝泡含刺丝泡蛋白[15]；嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)黏液泡含颗粒晶格蛋白(Granule lattice proteins)[16-17]；长肠袋虫(Balantidium elongatum)黏液泡含酸性粘多糖[14]；毛板壳虫(Coleps hirtus)毒素泡含游离脂肪酸和微量双萜类物质[18]。

基于阿尔新蓝8GS可以快速地标记粘蛋白(mucin)[11]，以及1%阿尔新蓝8GS溶液(pH 2.5)能够标记羧基化或硫酸化的黏液物质[19]等的研究结果，由于颗粒尖毛虫的射出胞器可被1%阿尔新蓝
8GS溶液(pH 2.5)标记，据此推测，颗粒尖毛虫射出胞器可能含此类黏液物质。

3.3 颗粒尖毛虫射出胞器的可能功能
目前对于射出胞器功能的研究主要集中于低等种类纤毛虫。

例如草履虫刺丝泡对其捕食者具有防御功能[20]；环毛双栉虫(Didinium nasutum)和毛板壳虫(C. hirtus)的毒素泡具有捕食功能[21, 18]；绿色爽口虫(Climacostomum virens)的皮层颗粒具有化学防御功能[22]。

颗粒尖毛虫在通常情况下经历射出胞器的发生、成熟并在一定刺激下射出，这显示了这种射出胞器同其他纤毛虫的射出胞器乃至高等真核生物细胞中广泛存在的分泌性囊泡均属于受调控的胞外分泌型胞器[23]，因此，颗粒尖毛虫的射出胞器或也具有防御、协助摄食和细胞物质更新等功能。

在甲基绿-派罗宁的刺激下，颗粒尖毛虫射出胞器大量射出并聚集形成“壳”，这与四膜虫在阿尔新蓝的刺激下形成的壳相似，可能是细胞利用射出胞器对外界不良条件形成的物理性防御[24]。

协助捕食的胞器通常分布在口区或其他摄食部位，并呈现特定的形态[25]，而颗粒尖毛虫射出胞器呈杯形并广泛存在于整个细胞皮层，因此，其射出胞器可能不具备捕食功能。

颗粒尖毛虫射出胞器射出后，射出胞器膜残留于表膜处，这类似于黏液泡发射后膜的行为，因此推测，射出胞器膜可能对表膜的更新起到了物质贡献作用[1]。

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