HPLC溶剂液相色谱适应性分析的影响因素

HPLC溶剂液相色谱适应性分析的影响因素
汪晓银
【摘要】HPLC溶剂的液相色谱适应性即梯度淋洗,是HPLC溶剂的一项重要的质
量指标,这项指标是否符合技术要求是决定该溶剂能否应用于高效液相色谱的重要
条件.如果这项指标超出标准规定的数值,那么在作为高效液相色谱的流动相使用时,就会形成溶剂杂质干扰,使样品的检测结果失真.
【期刊名称】《广州化工》
【年(卷),期】2010(038)004
【总页数】3页(P165-167)
【关键词】HPLC;溶剂;高效液相色谱;液相色谱适应性;梯度淋洗
【作者】汪晓银
【作者单位】安徽化工学校,安徽,安庆,246005
【正文语种】中文
HPLC溶剂的液相色谱适应性的检测方法是:对液相色谱法所使用的溶剂是否适用
于梯度分析进行实验,在液相色谱法的常规操作条件下评估溶剂的性能适宜性。

选
择此溶剂的操作参数来模拟典型的梯度分析。

记录该方法的梯度段已洗提的峰值(水对溶剂的峰值)。

对于一台新购置的高效液相色谱而言,要完成上述操作,必须考虑几方面因素的影响。

本文以HPLC乙腈为例,解析新购置高效液相色谱在测试溶剂液相色谱适应性过程
中的几个主要影响因素。

岛津液相色谱 SPD-10Avp,高压二元梯度,带在线脱气装置:
检测器:紫外 -可见检测器;
灵敏度:0.02AUFS(全刻度吸光单位);
色谱柱:C18聚合相,250×4.6mm,5um,12%C装载量,末端有盖。

待检验的试剂(HPLC乙腈);高纯水。

(1)开启仪器预热 30min,基线达到稳定后开始设定条件进行分析。

(2)把液相色谱系统按如表 1的溶剂—水梯度条件配制。

分别在210nm和254nm波长下按以上梯度条件进行梯度洗脱,流速2.0mL/min。

色谱图中最大峰值不应大于全刻度的25%(即 0.005吸光单位)。

由于 HPLC级溶剂自身纯度较高,杂质含量极低,所进行的检测均属痕量检测,所以如何避免在检测过程中引入干扰杂质影响检测结果就显得尤为重要。

对于一台新购置的仪器要进行衡量分析时,由于仪器在制造和安装过程中,系统内部
存在大量污染源,如不进行正确的清洗即投入运行,会导致色谱柱污染,无法进行分析,污染严重甚至会使色谱柱报废(见图 1)。

正确的清洗方法是:
①先用待分析的 HPLC乙腈与高纯水按 20：80的比例和分析用的 2.0mL/min流速冲洗。

经过试验系统内仍有很多的杂质峰 (见图 2)。

在此项检测中,对参比水的要求很高。

如果参比水的纯度达不到要求,水中的杂质无
疑会干扰检测结果。

普通样品进行梯度洗脱分析时,可用实验室用三级水经石英二次蒸馏水器重蒸馏后
使用,对分析结果不产生影响。

用这样的二次蒸馏水进行HPLC溶剂的梯度适应性
分析,从上面的色谱图可见经过清洗后的几个大的色谱峰是水中的干扰杂质产生的。

经过对比试验,市售饮用纯水直接进行HPLC溶剂的梯度适应性分析时杂质较多,用市售纯水进行二次蒸馏后再进行 HPLC溶剂的梯度适应性分析,干扰杂质峰变小。

以上这些参比水虽然进行了精致处理,但电导率和 TOC(总有机碳)仍会超标。

高纯水的理论电阻率为18.2MΩ·cm,理论电导率为0.055μS/cm,电阻率是电导率的倒数,水中离子的含量与电导率成正比。

而且即使使用的是高纯水,在使用过程中也要十分注意,因为高纯水暴露在外界环境中时,会被外界环境污染。

实验室的空气中含有大量离子,这些离子可以进入高纯水中。

此外,还应尽量减少参比水的转移,以防止在这些过程中带入离子污染物。

参比水中的有机污染物以 TOC水平为指标进行计算,超纯水的 TOC小于 10ppb。

高水平的 TOC会对 HPLC溶剂的梯度适应性分析产生不良影响。

有机杂质会包被在色谱柱中固定相表面,降低分离效果,抬高基线,并产生干扰峰。

目前市场上可购买到 4L瓶装 HPLC水 (大都为进口产品,价格昂贵),或用超纯水器生产的超纯水可满足 HPLC溶剂的梯度适应性分析要求 (在其他的影响因素都排除后)(见图 4)。

从理论上来说,此项分析进行之前,溶剂和参比水均应用≯0.45μm的微孔滤膜进行过滤,以滤去不利于痕量分析的污染物。

但是通过试验发现,溶剂及参比水经过过滤与未经过滤,分析结果却截然相反(分别见图 5、图 6)。

这可能是国内的滤膜生产技术尚未达到该项分析的要求,滤膜上的某些物质在过滤的过程中被溶剂溶解,产生新的污染物,反而使过滤的过程变成污染的过程。

常规分析中,特别是分析盐类产品,为防止固体杂质进入系统,必须在流动相的进口处要接上专用的溶液过滤头。

但在HPLC溶剂液相色谱适应性分析过程中,经过多次的试验,带有过滤头时常常会在同一保留时间下出现杂质峰,可能是过滤头中细小的孔中有某种固定的杂质,会不定时的被流动相带出而影响检测结果。

将过滤头除掉后,再经过很多的试验,此保留时间下不再出现杂质峰。

为了分清分析过程中出现的杂质峰是否是被检溶剂中存在的杂质,我们在同等试验条件下用进口的 HPLC溶剂进行多次的对比试验来进行条件的摸索和影响因素的
排查,最后成功地得出了 HPLC溶剂液相色谱适应性分析(衡量分析)的最佳条件。

用于 HPLC溶剂液相色谱适应性的分析即梯度淋洗是衡量分析,只能用精度较高的进口液相色谱仪,有些国产液相色谱仪由于检测精度不高,即使系统不清洗处理、使用一般的纯净水、检测一般的试剂,色谱图中都不会出现杂质峰。

如果使用这样的液相色谱仪检测HPLC溶剂,就有可能把不合格的产品误检成合格产品。

对于HPLC溶剂液相色谱适应性的分析结果准确与否,直接影响企业的生存。

如果直接按照标准要求进行分析,很难得到准确的分析结果,对于新购置的仪器必须经过对比试验逐一排除干扰因素。

进行 HPLC溶剂液相色谱适应性分析的仪器精度要高并要专用,不能进行其他产品的分析。

只有经过梯度淋洗检测合格的 HPLC溶剂才能作为液相色谱分析其他产品的流动相,否则对其他产品的检测结果会造成干扰并产生分析误差,将对行业产生很大的影响,造成浪费或更大的经济损失。

【相关文献】
[1] 美国化学协会标准第九版,简称ACS Acetonite标准.
[2] 美国 Fisher公司乙腈质量标准:ITEM CAT#A998.
[3] 美国AST M578—76标准.
[4] 美国 TED I A公司乙腈质量标准:AB—1124、AS—1122.。