H5N1感染A549细胞诱导天然免疫的作用机制

H5N1感染A549细胞诱导天然免疫的作用机制
姚春雨;邓清华;薛江东;姚睿智;樊宏超
【摘要】研究高致病性禽流感病毒H5N1亚型感染人肺癌细胞后诱导天然免疫的作用机制,用鸡胚来源的禽流感病毒50 HAU感染人肺癌细胞,通过荧光定量PCR、细胞转染以及荧光素酶报告基因等实验方法检测细胞内过表达和低表达RIG-I后干扰素-β的表达情况;用不同亚型的禽流感病毒感染细胞后,检测NS1蛋白的表达情况.结果表明,在细胞内过表达RIG-I能够提高禽流感病毒对IFN-β基因启动子的刺激.相反,细胞内过表达RIG-I的阴性区域(RIG-I-K270A)则抑制了禽流感病毒诱导的IFN-β反应.来源于高致病性禽流感H5N1的NS1蛋白更明显拮抗了干扰素的效果.说明高致病性禽流感H5N1通过RIG-I的识别诱导干扰素的产生;NS1蛋白是拮抗干扰素发挥效应的关键蛋白.
【期刊名称】《内蒙古民族大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2017(032)002
【总页数】5页(P138-142)
【关键词】禽流感病毒;H5N1亚型;干扰素;A549细胞
【作者】姚春雨;邓清华;薛江东;姚睿智;樊宏超
【作者单位】内蒙古民族大学动物科学技术学院,内蒙古通辽 028043;内蒙古民族大学动物科学技术学院,内蒙古通辽 028043;内蒙古民族大学动物科学技术学院,内蒙古通辽 028043;内蒙古民族大学动物科学技术学院,内蒙古通辽 028043;内蒙古民族大学动物科学技术学院,内蒙古通辽 028043
【正文语种】中文
【中图分类】S852.65
流感病毒属于正黏病毒科，流感病毒属，病毒基因组由8条单股负链的RNA片段组成.禽流感病毒能够感染多种动物，包括人、猪、马、禽等.根据禽流感病毒毒力不同可分为：无致病性禽流感病毒、低致病性禽流感病毒和高致病性禽流感病毒，高致病性禽流感病毒可以导致家禽全身脏器的感染，引起高发病率和高死亡率.禽流感不仅给养禽业带来巨大经济损失，也对人类公共卫生安全造成严重威胁.与季节性流感病毒的临床症状和致病机制不同，导致H5N1病毒感染患者高死亡率的主要原因是病毒引起肺脏急性损伤导致的呼吸窘迫综合征〔1〕.高致病性H5N1病毒最关键的毒力决定因素是HA基因上的多碱性氨基酸裂解位点，这是病毒在禽类系统中感染的分子基础〔2〕.先天性免疫在H5N1病毒的致病机制中发挥着关键作用.首先黏液通过与病毒非特异性结合保护上皮细胞免受感染，同时快速启动先天性细胞免疫.模式识别受体Toll-like和受体RIG-Ⅰ等可以识别病毒RNA，在激活先天性免疫应答过程中发挥了很关键的作用.Ⅰ型IFN（干扰素，interferon）在这两个受体介导的信号通路诱导下迅速产生，启动抗病毒反应〔3〕.
干扰素在机体抗病毒过程中占据着重要的地位，通过宿主细胞的抗病毒免疫机制，抑制病毒在细胞内复制，起间接的抗病毒作用，其转录活性与生物学功能直接影响细胞的抗病毒能力.合成的干扰素立即穿过细胞膜，向周围细胞扩散，并随着血液循环通过与不同受体结合激发不同的信号转导通路.
Seo S H等的研究结果表明，干扰素或肿瘤坏死因子预处理SJPL细胞能够抑制人流感病毒A/Sydney/5/97（H3N2）的复制，却无法抑制从人分离到的高致病性禽流感病毒A/HK/156/97（H5N1）的复制，该病毒NS1第92位谷氨酸在上述细胞因子抗性上发挥重要作用，E92D突变使病毒对干扰素敏感及致病力下降
〔4～6〕.所以本研究主要用H5N1感染A549细胞来研究干扰素对高致病性禽流感的作用机制.
1.1 试验材料及试剂病毒株A/Tree sparrow/Henan/1/04（H5N1）；
A/Chicken/Hubei/3/98（H9N2）.10日龄SPF鸡胚购自北京维通利华实验动物技术有限公司；RPMI-1640培养基和RIPA裂解液购自Gibco.
1.2 试验方法
1.2.1 病毒和细胞：取10日龄SPF鸡胚，经羊膜腔和尿囊腔接种标本0.2 ml，每份标本接种4只胚，置33～35℃培养72 h.然后将鸡胚置4℃过夜（或置-20℃冰箱1 h再置4℃数小时），分别收获尿囊液和羊水并检查HA活性.人肺腺癌细胞A549培养于含10%胎牛血清RPMI-1640培养基中，并且在培养基中加入终浓度为100 IU/ml的氨苄青霉素和100 μg/ml的链霉素.
1.2.2 病毒感染：鸡胚来源的禽流感病毒50 HAU感染1×106个细胞，1 h后弃掉感染液并换上新鲜培养基继续培养细胞.
1.2.3 实时定量RT-PCR：按照Trizo（lGibco BRL）说明书提取RNA并用Invitrogen反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA.用Single Color Real-time PCR System（BIO-RAD）试剂盒进行实时荧光定量PCR.
1.2.4 jetPEI介导法转染A549：胰酶消化指数生长期A549细胞，RPMI1640完全培养基中按5×105/10 cm培养皿接种，继续培养20～24 h（此时细胞密度约在50～60%）.将8 μg待转染的质粒稀释入500 μl无菌150 mM NaCl中，15 μl jetPEI稀释入500 μl无菌150 mM NaCl中，振荡并瞬时离心；将jetPEI混合物一次性加入含质粒混合物中，立即振荡并瞬时离心；室温放置15～30 min；将上述转染混合物逐滴平均加入10 cm培养皿中.
1.2.5 报告基因试验：IFN-bete-luc，ISRE-luc和pCMV-renilla按10∶1的比例转染HEK293T或者A549细胞，12 h后刺激细胞.
1.2.6 数据处理：试验数据采用spss17.0软件进行分析，P≥0.5是无显著差异，P ＜0.5有显著差异，具有统计学意义.
2.1 干扰素预先处理的细胞显著控制高致病性禽流感病毒H5N1亚型的复制本研究所使用的H5N1和H9N2亚型流感病毒都直接分离自禽类，为了研究人干扰素在控制禽流感病毒上所发挥的作用，我们将A549细胞用重组人干扰素α2b （1000 IU/ml）处理24 h，然后用上述几种病毒感染.禽流感病毒的HA效价用PBS和20 HAU调整到80 HAU，并用其感染2×105个A549细胞1.5 h，然后换成新鲜的培养液继续培养.用qRT-PCR方法检测NP基因的拷贝数.结果表明，干扰素处理过的细胞能够显著抑制禽流感病毒基因表达（图1），说明本研究中所使用的病毒株无论强毒还是弱毒对人干扰素都是敏感的.
2.2 RIG-I参与识别禽流感病毒H5N1感染并诱导干扰素产生天然免疫反应需要宿主利用自身的模式识别受体认识入侵病原的组分，包括细菌的脂多糖以及病毒的核酸〔7〕.近几年的研究结果表明RIG-I作为宿主的天然免疫模式识别受体在识别RNA病毒感染并诱导天然免疫反应上发挥重要作用.RIG-I不仅识别病毒复制过程产生的双链RNA，还能识别5′端磷酸化的单股RNA（如流感病毒复制过程中产生的RNA）〔8～10〕.尽管致病性及宿主范围不同，不同亚型流感病毒的基因组结构及生活周期高度相似.禽流感病毒感染哺乳动物细胞同样产生5′端磷酸化的单股RNA.本研究用A549细胞与IFN-β，pCMV-renilla和RIG-Iw（t图2A）或者RIG-I K270A（图2B）受体基因共转染.转染16 h后收集细胞，利用双荧光素酶报告分析系统检测荧光素酶报告基因.结果发现，在细胞内过表达RIG-I能够提高禽流感病毒对IFN-β基因启动子的刺激（图2A）.相反，细胞内过表达RIG-I的dominant negative（RIG-I-K270A）则抑制了禽流感病毒诱导的IFN-β反应（图2B）.以上结果说明禽流感病毒在哺乳动物细胞内同样利用了RIG-I作为天然免疫反应模式识别受体来激活被感染细胞的天然免疫反应.
2.3 NS1蛋白是高致病性禽流感病毒H5N1拮抗干扰素作用的主要效应分子 NS1主要通过以下几种方式发挥其干扰素抗性作用：（1）通过RNA结合域与RNA结合，竞争性抑制PKR激活；（2）通过与宿主细胞内的PABⅡ和CPSF相互作用来抑制细胞的未成熟mRNA 3′端剪切及多聚腺苷酸化，从而使细胞RNA不能够成熟，出核及随后进行的翻译〔11～13〕；（3）与天然免疫模式识别受体RIG-I 相互作用下调天然免疫反应〔14，15〕.在病毒感染情况下，不同亚型或毒力不同毒株之间NS1表达效率相差较大，无法比较NS1蛋白在干扰素抗性上的差异.在过表达情况下，尽管来源于致病性不同毒株的禽流感病毒NS1蛋白都具有抑制干扰素产生及拮抗干扰素效应的作用，但来源于高致病性禽流感病毒H5N1的NS1蛋白在拮抗干扰素效应上具有更强的效果（图3）.
图3中，A为HEK293T细胞与ISRE-luc报告基因和pCMV-renilla共转染.转染16 h后，用2000 IU/ml hIFNa2b处理细胞12 h.B为HEK293T细胞与ISRE-luc 报告基因和pCMV-renilla共转染.转染16 h后，用禽流感病毒感染细胞2 h，然后用2000 IU/ml hIFNa2b处理12 h.收集细胞并且用双荧光素酶报告基因检测荧光素酶报告基因的活性.
高致病性禽流感病毒不仅对养禽业同时也对人类的健康构成巨大威胁.截止到2006年9月28日世界卫生组织报道了258例人感染高致病性禽流感病毒，致死率高达50%以上〔16〕.WHO已将高致病性禽流感病毒H5N1列为威胁人类健康的重要潜在病原并要求每个国家做好相应的准备工作.考虑到普遍人群对高致病性禽流感病毒缺乏免疫力，一旦由高致病性禽流感病毒引起人类流感的爆发，死亡率将高达1亿〔17〕.高致病性禽流感病毒由禽传染给人并获得在人际间传播的能力需要突破很多屏障，其中包括对人细胞受体的亲和力以及宿主天然免疫和获得性免疫系统的攻击.天然免疫构成了防御高致病性禽流感病毒感染的第一道防线.如何控制宿主细胞的天然免疫反应决定着高致病性禽流感病毒能否在该细胞中顺利复制.
本研究以直接分离于禽且致病性不同的禽流感病毒为研究对象，观察其感染A549细胞后对干扰素作用的影响.研究结果表明，尽管经过鸡胚扩增的禽流感病毒都能
够感染哺乳动物细胞并检测到病毒的基因表达，但毒力不同的毒株之间侵染哺乳动物细胞以后病毒基因的表达效率存在较大差异.感染哺乳动物细胞以后，高致病性
禽流感病毒具有比低致病性禽流感病毒更高的基因表达效率，这也是其具有高致病性的重要原因之一.正常情况下病毒感染诱导IFN-β产生是一个正反馈信号放大过程，该过程分为初级反应和次级反应两个阶段.初级反应产生的IFN-β通过IFNAR 受体诱导抗病毒因子表达的同时也诱导干扰素信号通路上一些分子如RIG-I和
IRF7的表达，这些表达的分子再参与识别病毒感染并放大干扰素产生的信号通路，导致大量干扰素表达.我们的研究结果表明高致病性禽流感病毒H5N1感染A549
细胞后尽管产生一定量的IFN-β，能够激活JAK-STAT信号通路并诱导RIG-I基因转录，但RIG-I的表达量却很低，说明高致病性禽流感病毒H5N1感染通过某些
机制抑制了RIG-I分子的表达，破坏了干扰素正反馈信号通路，致使宿主细胞无法产生大量的干扰素，病毒感染和宿主的天然免疫反应维持在相对平衡的状态，保证病毒能够在该细胞上正常复制.高致病性禽流感病毒H5N1预先感染HEK293T细
胞显著抑制了人干扰素α2b对RIG-I诱导表达，如果在HEK293T细胞中过量表
达RIG-I则提高了高致病性禽流感病毒H5N1对IFN-β报告基因的激活，以上结
果进一步说明高致病性禽流感病毒H5N1可以通过控制RIG-I的表达来调控宿主
细胞的天然免疫反应.高致病性禽流感病毒H5N1一旦已经感染细胞就会通过两个方面来削弱干扰素的生物学作用，一是病毒感染本身不能够产生大量的干扰素；二是干扰素诱导的抗病毒效应受到抑制.如果用干扰素提前处理细胞，由于细胞内抗
病毒状态已经启动并产生了抗病毒因子，高致病性禽流感病毒H5N1的感染则受
到显著抑制.
天然免疫是宿主抗病毒反应的第一道防线.干扰素作为天然免疫重要的组成部分，
其产生及发挥生物学效应是一个由大量分子参与的信号转导过程，其中每一个环节都受到严格调控以保证宿主细胞遭受病原侵染后能够迅速作出反应并限制病原的扩散.病毒在长期进化过程中获得了一些对抗宿主天然免疫反应的策略，从而达到对宿主天然免疫反应的控制以利于病毒自身的复制.流感病毒对抗宿主天然免疫反应可以分为几个层次.首先，流感病毒感染通过抑制天然免疫反应模式识别受体如RIG-I表达使宿主细胞无法大量产生干扰素；另外，流感病毒还能通过抑制宿主细胞抗病毒效应分子的表达来拮抗干扰素的生物学效应，使被感染的宿主细胞无法对干扰素刺激作出有效的反应.
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