苦豆草植物HPLC指纹图谱的建立

苦豆草植物HPLC指纹图谱的建立
王秀芬;陈海燕;冷晓红
【摘要】目的建立苦豆草的指纹图谱分析方法,为评价及控制其质量提供依据.方法采用Agilent TC-C18(2)色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),以乙腈-0.05moL·L-1的磷酸二氢钾溶液(2.0mL·L-1三乙胺)为流动相,进行梯度洗脱,流速1.0mL·min-,检测波长205nm,柱温30℃.测定16批样品色谱图,建立苦豆草指纹图谱.结果确定苦豆草指纹图谱有17个共有峰,苦豆草之间的相似度均大于0.950.结论建立的HPLC指纹图谱分析方法精密度、重复性和稳定性良好,可用于苦豆草的质量评价.【期刊名称】《宁夏医科大学学报》
【年(卷),期】2016(038)007
【总页数】5页(P763-767)
【关键词】苦豆草;高效液相色谱;指纹图谱
【作者】王秀芬;陈海燕;冷晓红
【作者单位】宁夏职业技术学院,银川750021;宁夏职业技术学院,银川750021;宁夏中药材开发与利用工程技术研究中心,银川750021
【正文语种】中文
【中图分类】R284
苦豆草为豆科槐属植物苦豆子Sophora alopecuroides L.的干燥地上部分，在我国西北地区分布广泛，是西北道地的沙生植物，具有清热解毒、祛风除湿的作用[1]。

通过对苦豆草化学成分研究，已发现20多种单体生物碱，主要含有槐定碱、
氧化苦参碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐果碱、苦豆碱[2]，具有镇静、抗心律失常、抑菌、抗病毒、抗肿瘤等药理活性，其中苦参碱、氧化苦参碱及总生物碱已取得国家原料药批准文号，形成产业化生产。

对苦豆子根指纹图谱的研究已有文献报道[3]，但对苦豆草指纹图谱尚未见报道，本研究对主产区的16批苦豆草指纹图谱进行研究，建立评价苦豆草质量的HPLC指纹图谱分析方法，为苦豆草的质量控制
提供依据。

1.1 仪器
高效液相色谱仪：Agilent1220、Agilent C18(250mm×4.6mm，5μm，美国安
捷伦公司)、自动进样器，DAD紫外检测器；电子分析天平(十万分之一)：Mettler Toledo仪器(上海)有限公司。

1.2 试药
乙腈为色谱纯(美国TEDIA)、三乙胺、磷酸二氢钾、甲醇为分析纯、试验用水为重蒸水；8种对照品分别为苦参碱(批号110805-200508)、氧化苦参碱(批号110780-201007)、氧化槐果碱(批号111652-200301)、槐定碱(批号110784-200303)，以上试药均购于中国食品药品检定研究院，氧化槐定碱、槐果碱(由宁
夏紫荆花药业股份有限公司提供，HPLC检测为单峰，归一化法检测纯度≥99.0%)。

相似度计算软件：国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2008版)。

1.3 材料
采集宁夏、甘肃、内蒙、新疆、陕西等地16个苦豆草样品，由宁夏药检所韩义欣主任药师鉴定为豆科槐属植物苦豆子Sophora alopecuroides L.的干燥地上部分，不同产地苦豆草来源见表1。

2.1 色谱条件
Agilent C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以
0.05moL·L-1磷酸二氢钾水溶液(三乙胺2.00mL·L-1)为流动相B，按表2中的规
定进行梯度洗脱；检测波长205nm；流速1.0mL·min-1；进样量10μL，柱温30℃；记录60min色谱图。

2.2 对照品溶液的制备
精密称取苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、氧化槐定碱、槐果碱和氧化槐果碱对照品适量，加甲醇溶解并定容，摇匀，得质量浓度约为0.12mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备
精密称取不同产地苦豆草粗粉各约0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入30mL甲醇，1mL浓氨水，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，得供试品
溶液。

2.4 结果
2.4.1 精密度考察取同一批供试品溶液(4号)20μL，按确定的色谱条件重复进样6次，记录色谱图。

将所得数据用“中药指纹图谱相似度评价系统”软件进行处理分析，相似度在0.996以上，各共有峰相对峰面积的相对标准偏差(RSD)<
3.0%，相对保留时间的RSD<2.5%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性考察精密称取苦豆草(4号)粗粉6份，按2.3项下方法制备供试品溶液，按确定的色谱条件进样20μL，记录色谱图。

将所得数据按2.4.1项下相同软
件进行处理，相似度在0.998以上，各共有峰相对峰面积的RSD<2.96%，相对保留时间的RSD<2.0%，表明该法重复性良好。

2.4.3 稳定性考察精密吸取同一供试液(4号)20μL，在放置0、2、6、8、12和
24h后用上述色谱条件进样，记录色谱图。

将所得数据按2.4.1项下相同软件进行处理，相似度高于0.995，各共有峰相对峰面积的RSD<2.98%，相对保留时间的
RSD<1.2%，表明样品溶液在24h内稳定。

2.5 不同产地苦豆草HPLC指纹图谱研究
2.5.1 不同产地苦豆草HPLC指纹图谱的建立根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》和《中药指纹图谱研究技术》[4]要求，按2.1项下方法分别测定混合对
照品溶液及16批不同产地的苦豆草供试品溶液，结果见图1和图2(样品编号同表1)。

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件，以1号样品的色谱图为参
照图谱，通过多点校正，自动匹配，以中位数法，生成苦豆草共有模式的对照指纹图谱，确定17个共有峰，可以构成指纹图谱的稳定的特征峰，见图3。

通过与对照品图谱比对，指认7号峰为槐定碱、10号峰为氧化槐定碱、12号峰为氧化苦参碱、13号峰为氧化槐果碱、15号为苦参碱、17号峰为槐果碱。

13号峰的峰面积最大且峰形稳定，将其设为参照峰(S)。

将各色谱图中共有峰的保留时间与同一图
谱中参照物峰的保留时间比较，计算各共有峰的相对保留时间，16批苦豆草的相对保留时间的RSD<2%，符合指纹图谱要求。

2.5.2 共有峰和非共有峰面积《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》规定，中药材的供试品图谱中各共有峰面积的比值与指纹图谱各共有峰面积的比值比较，单峰面积占总峰面积≥20%的共有峰，其差值不得大于±20%；单峰面积占总峰面积
≥10%，而小于20%的共有峰，其差值不得大于±25%；单峰面积占总峰面积<10%的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。

苦豆草指纹图谱中
13号峰占总峰面积的百分比为25.35%，其差值小于±20%；7、10和12号峰占总峰面积的百分比为13.5%、17%和15.6%；其他峰的单峰面积占总峰面积的百分比均小于10%。

以13号峰为参照峰(S)，计算其他各共有峰的相对峰面积，结果见表 3。

不同产地苦豆草各非共有峰面积占总峰面积百分比为0.93%～6.66%，符合指纹图谱研究规定，非共有峰总面积小于总峰面积的10%的要求,见表 4。

2.5.3 不同产地苦豆草指纹图谱的相似度评价[5] 采用“中药色谱指纹图谱相似度
评价系统(2008版)”软件，设定NO.1指纹图谱为参照图谱，利用中位数法，设定保留时间误差在0.5min以内，对16批苦豆草指纹图谱进行数据分析，相似度分析结果见表5。

从结果可以看出16批苦豆草药材相似度较高，均大于0.950。

苦豆草供试品溶液，用HPLC法检测，检测器为DAD，选择200～400nm 的波长范围进行检测，记录色谱图，苦豆草中各类生物碱在205nm波长下色谱峰分离度好、并有较强的紫外吸收，出峰数量多；同时考察了不同柱温及流速，最终确定以205nm检测波长，温度30℃和流速1.0mL·min-1为条件建立苦豆草HPLC指纹图谱。

苦豆草中化学成分较多，需要选择合适的流动相以使主要化学成分达到基线分离。

本实验流动相分别考察了甲醇-磷酸缓冲盐[6]、乙腈-磷酸缓冲盐(三乙胺)、甲醇- 磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液(磷酸浓度0.11%～0.15%)梯度洗脱。

试验结果表明，用甲醇基线漂移大，用乙腈能使基线平稳。

最终确定用乙腈-0.05moL·L-1磷酸二氢钾水溶液(三乙胺2.00mL·L-1)为流动相[7]，可使各化合物分离度良好。

本品供试品溶液制备方法中分别用甲醇、75%甲醇、80%乙醇为提取溶剂，加入适量氨水，采用回流、冷浸、超声不同提取方法，考察不同提取时间(20、30、40min)。

试验结果表明甲醇提取的苦豆草成分多，且杂质干扰少。

最终确定本品供试品溶液制备方法采用甲醇超声30min。

本实验采用甲醇加少量浓氨水超声处理样品，采用HPLC方法，以乙腈-
0.05moL·L-1磷酸二氢钾水溶液(三乙胺2.00mL·L-1)为流动相进行梯度洗脱，分离得到29个峰，用中药指纹图谱相似度评价系统软件计算，得到17个共有峰。

结果表明，16批样品的17个共有峰的相对保留时间的RSD<3%，苦豆草的化学成分比较稳定，但相对峰面积相差较大，说明不同产地的苦豆草中生物碱含量有较大的差异。

通过建立苦豆草的指纹图谱，可鉴别药材的真伪，为评价和控制苦豆草内在质量提
供科学依据。

【相关文献】
[1] 廖春燕，梁健，杨燕，等.苦豆子的药理及应用概述[J].中国民族民间医药，2009，18(3)：6-8.
[2] 秦学功，元英进.高效薄层色谱分离苦豆子生物碱的体系优化[J].中草药，2002，33(6)：513-514.
[3] 杨敏丽，陈文娟，李鹏. 宁夏苦豆子根的高效液相色谱指纹图谱研究[J].时珍国医国药，2008，19(2)：268-270.
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[5] 黄慧莲，刘科兰，邵峰，等.不同主产地黑顺片的指纹图谱研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，17(16):44-49.
[6] 田菁，范欣戎，李晓东，等．HPLC 法定性定量分析苦豆草药材中多个生物碱成分[J].药物分析
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[7] 刘振龙，张丽，魏蕾初，等.HPLC 同时测定苦豆子总碱中8种生物碱含量[J].中国实验方剂学杂志，2013,19(8)：142-145.。