木鳖子提取物体外抗肿瘤活性的初步研究

木鳖子提取物体外抗肿瘤活性的初步研究
赵连梅;韩丽娜;单保恩;潘晓明;刘丽华;李晓光
【摘要】目的:观察木鳖子(cochinchina momordica seed,CMS)水提物(water extract of CMS,CMSWE)和醇提物(ethanol extract of CMS,CMSEE)对肿瘤细胞生长的影响,探讨CMSEE的抗肿瘤机制.方法:制备CMSWE和CMSEE.MTT法检测CMSWE和CMSEE对人黑色素瘤B16、肺癌细胞A549、乳腺癌细胞MDA-MB-231、食管癌细胞TE-13,以及正常人外周血淋巴细胞(PBMC)生长的影响,计算细胞生长抑制率;光镜下观察细胞形态变化;瑞氏-吉姆萨染色观察B16细胞凋亡形态学变化.流式细胞技术(FCM)检测B16细胞凋亡率和细胞周期分布.结
果:CMSEE(25～300 mg/L)对B16、A549、MDA-MB231和TE-13细胞增殖均有明显的抑制作用(P<0.01),对PBMC的增殖没有明显影响.CMSWE(25～300 mg/L)对A549、TE-13、MDA-MB231、PBMC的生长没有明显影响,仅对B16细胞的增殖有较弱的抑制作用,且各浓度组抑制率均小于相同浓度的
CMSEE(P<0.01).经CMSEE处理后,B16细胞显示典型的凋亡形态变化,凋亡率明显增高(P<0.01),G~0/G_1期细胞明显增加,S期、G_2/M期细胞减少(P<0.01).结论:CMSEE体外对人肿瘤细胞增殖有明显的抑制作用,其抗肿瘤机制可能与阻滞肿瘤细胞周期和诱导凋亡有关.
【期刊名称】《癌变·畸变·突变》
【年(卷),期】2010(022)001
【总页数】5页(P19-23)
【关键词】木鳖子;抗肿瘤;细胞周期;细胞凋亡
【作者】赵连梅;韩丽娜;单保恩;潘晓明;刘丽华;李晓光
【作者单位】河北医科大学第四医院科研中心,河北,石家庄,050011;河北医科大学
第四医院科研中心,河北,石家庄,050011;河北医科大学第四医院科研中心,河北,石家庄,050011;河北医科大学第四医院科研中心,河北,石家庄,050011;河北医科大学第
四医院科研中心,河北,石家庄,050011;河北医科大学第四医院科研中心,河北,石家庄,050011
【正文语种】中文
【中图分类】R735.2
近年来,肿瘤的发病率和死亡率在全世界范围内呈持续上升趋势,给人类的生命造成
了极大威胁,因此寻找有效治疗各类肿瘤药物的研究已成为一大热点。

现代医药中
虽然筛选了不少有明显抗肿瘤作用的药物,但因毒副作用大、易产生耐药等因素,使
其应用受到一定的局限性。

能否找到既能杀伤肿瘤细胞,毒副作用又小的药物及治
疗方法,是肿瘤治疗成功的关键问题。

目前,从中草药和民族医药资源中寻找活性强、作用独特、毒性小的抗肿瘤新药研究已受到广泛重视。

蒙药木鳖子(cochinchina momordica seed,CMS)始载于宋《开宝本草》,古代医药文献记载该药具有散结
消肿、攻毒疗疮之功效,可用于治疗疮疡肿毒、乳痈、瘰疬、痔瘘、干癣、秃疮等
症[1]。

目前木鳖子在蒙药方剂中的应用非常广泛,在多种癌症的治疗方剂中出现,且效果显著。

但是关于该药物的体内外抗癌效果及机制研究,迄今国内外尚未见报道。

本实验将分析木鳖子提取物对体外培养的4种肿瘤细胞生长的影响,探讨其抗肿瘤
作用的有效成分及其作用机制,为木鳖子作为抗肿瘤药的开发和利用提供有价值的
资料。

1 材料与方法
1.1 材料和试剂
中药木鳖子购自北京同仁堂药店,经河北医科大学药学院生药教研室鉴定为正品。

PI染料、MTT试剂盒购自美国Sigma公司;瑞_姬(Wrigh_Giemsa)染液购自Baso 公司(批号:050511);胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;RPMI 1640
和胰蛋白酶购自美国Gibco公司;人淋巴细胞分离液购自Solarbio公司(批
号:P18610);无水乙醇为国产分析纯。

1.2 木鳖子提取物的制备
取一定量的木鳖子原药材,粉碎后称取10 g,加去离子水100 ml,室温下浸泡过夜,水浴回流提取2次,每次1 h,合并上清液,2%活性炭80℃蒸煮脱色30 min,8000
r/min离心10 min,取上清液用旋转冷冻蒸发器蒸发干燥,所得干粉视为木鳖子水提物纯品(water extract of cochinchina momordica seed,CMSWE)。

称取粉碎后的木鳖子10 g,加入10倍体积的无水乙醇,室温密闭浸泡7 d,纱布滤去渣滓,加入2%活性炭,80℃蒸煮脱色,旋转冷冻蒸发器减压蒸发成粉状物,所得干粉视为木鳖子醇提物纯品(ethanol extract of cochinchina momordica seed,CMSEE)。

使用CMSEE时经乙醇溶解,并使乙醇终浓度＜0.1%,CMSWE使用时用PBS溶解,二者均用RPMI 1640培养基稀释,经无菌滤器除菌,4℃保存备用。

1.3 细胞培养
乳腺癌细胞株MDA_MB_231,小鼠黑色素瘤细胞株B16,食管癌细胞TE_13均由河北医科大学第四医院科研中心保存,肺癌细胞A549购自中科院上海细胞库。

所用
细胞均以体积分数为100 ml/L胎牛血清的RPMI 1640培养液(含青霉素100
U/ml,链霉素100 μ g/ml)于37℃、5%CO2培养箱中培养,以0.25%的胰蛋白酶
消化细胞传代,取对数生长期细胞用于实验。

常规密度梯度离心法提取健康人外周
血淋巴细胞(PBMC)。

1.4 四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测肿瘤细胞生长抑制率
取对数生长期肿瘤细胞,调整细胞浓度为1×105/ml,PBMC浓度为1×106/ml,均接种于96孔培养板,每孔180 μ l,实验组各孔分别加入不同浓度的木鳖子水提物(CMSWE)和醇提物(CMSEE)各20μl,使其终浓度分别为300、200、100、50、25 mg/L;空白对照孔加入完全培养基;阴性对照孔加入含有0.01%乙醇的培养基,每组均设4个复孔,置于饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱中培养24 h,各孔加入
MTT(5 mg/ml)20μl,继续培养4 h,弃去培养上清,每孔加入DMSO 150μl,混匀后以测定波长492 nm、参考波长620 nm检测各孔光密度D(492)值,按下式计算对细胞增殖的抑制率(inhibitory rate,IR)。

IR(%)=[对照组D(492)值-实验组D(492)值]/[对照组D(492)值-空白对照组D(492)值]×100%
1.5 细胞形态学观察
于96孔板中加入不同种类的肿瘤细胞(每孔1×104个),用CMSEE(200 mg/L)分别处理24 h后,倒置相差显微镜下观察形态学变化。

另取对数生长期的B16细胞,调整细胞浓度为1×105/ml,加入6孔培养板中(孔内预先放置灭菌盖玻片),每孔2 ml,培养24 h,待细胞在盖玻片上贴壁良好后,加入1 ml不同浓度CMSEE(终浓度分别为200、100、50 mg/L),继续培养24 h,取出玻片,生理盐水冲洗3次,晾干,滴加瑞_姬染料(Wright_Giemsa)染色1 min,加3倍体积蒸馏水,混匀静置15 min,用清水冲洗干净,普通光学显微镜下观察结果。

1.6 细胞凋亡率分析
分别以50、100、200 mg/L的CMSEE作用于B16细胞24 h,收集细胞,用预冷的70%乙醇固定12 h;离心弃去固定液,PBS重悬5 min后300目筛网过滤;加入PI
染液,4℃避光染色30 min,流式细胞仪分析细胞周期及凋亡率。

1.7 统计学方法
采用SPSS 11.5软件进行统计学分析,实验数据以±s表示,多组间的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD检验,以α=0.05为检验水准。

2 结果
2.1 木鳖子提取物对肿瘤细胞增殖的影响
CMSEE(25～300mg/L)对B16、A549、MDA_MB_231、TE_13细胞的增殖具有明显的抑制作用,并呈剂量依赖性(表1),最高抑制率(300mg/L)分别为79.70%、68.19%、70.93%、56.99%,对B16细胞的生长抑制作用明显高于其他3组细胞(P＜0.01),对PBMC细胞的生长没有明显影响。

CMSWE(25～300 mg/L)对MDA_MB_231、TE_13和A549细胞的增殖没有明显的影响(P＞0.05)(表2),仅对B16细胞的生长有抑制作用,如图1所示,且抑制效果显著低于CMSEE(P＜0.01)。

因此我们将对CMSEE的抗肿瘤作用作进一步的研究。

2.2 肿瘤细胞形态学改变
倒置显微镜下观察,对照组细胞生长旺盛,大小均一,贴壁生长,细胞轮廓清楚,透明饱满,成多边形,颗粒较少,细胞间结构紧密。

经200μ g/mlCMSEE作用24h后,部分细胞体积变小,逐渐变圆并浮起,细胞间接触变松,折光性及贴壁能力减弱(图2)。

Wright_Giemsa染色后在光学显微镜下观察,未经处理的B16细胞呈圆形,体积较大,呈紫红色,核仁多个,深紫红色,细胞质淡蓝色;经CMSEE(200、100、50mg/L)处理24h后,部分细胞发生凋亡特征性改变,细胞体积变小,染色质浓缩、深染,核碎裂成多个块状及凋亡小体形成等(图3)。

2.3 细胞凋亡和细胞周期分布
结果见表3、图4。

经不同浓度CMSEE(50、100、200 mg/L)处理24h后,B16细胞凋亡率明显增高,组间比较有显著性差异(P＜0.01),200mg/L诱导的细胞凋亡率
可达34.5%。

G0/G1期细胞明显增加,处于S期、G2/M期细胞减少,与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.01)。

3 讨论
蒙药木鳖子是一味散血热、除痈毒之要药,临床上主要用于治疗疮痈肿痛、多种关节炎及皮肤病,疗效肯定。

目前发现木鳖子入药对多种癌症具有治疗作用[2],但迄今未见有关于木鳖子体内外抗肿瘤的实验研究。

本实验提取了木鳖子的水提物(CMSWE)和醇提物(CMSEE),对4种不同组织来源的肿瘤细胞(人肺癌细胞A549、乳腺癌细胞MDA_MB_231、食管癌细胞TE_13、黑色素瘤B16)进行了体外生长抑制研究,结果表明,CMSEE对4种肿瘤细胞的生长均有显著的抑制作用,对黑色素瘤细胞B16的抑制作用最为明显。

而CMSWE只对B16细胞有较弱的生长抑制作用,对其他3种肿瘤细胞的生长则无明显影响,提示木鳖子抗肿瘤活性成分主要存在于醇提物。

因此本实验以B16为研究对象,对CMSEE的抗肿瘤作用进行进一步的研究,为木鳖子抗肿瘤活性物质的进一步分离、提取、纯化、筛选抗肿瘤活性成分及抗肿瘤机制的研究奠定了基础。

恶性黑色素瘤是来源于皮肤黑色素细胞的一种恶性程度很高的肿瘤,突出特点为对多数化疗药耐药,转移率和致死率高,病人生存期限仅为6～10个月[3]。

大量的研究表明,恶性黑色素瘤中细胞凋亡信号转导通路中相关基因表达的“关闭”,使其具备了强大的生存能力[4],是导致其对临床各种化疗药物耐受的主要原因。

因此,寻找对黑色素瘤敏感的有效药物成为黑色素瘤治疗的重点。

本研究结果发现,不同浓度CMSEE(25、50、100、200、300mg/L)对恶性黑色素瘤细胞B16的生长具有显著抑制作用,300mg/LCMSEE作用于B16细胞24 h后,生长抑制率可达到79.70%,且(50～200mg/L)CMSEE作用24h,B16细胞均出现明显的凋亡形态学变化,凋亡
率明显升高,且可将B16细胞阻滞于G0/G1期。

以上结果提示,CMSEE可诱导B16细胞凋亡,有作为抗黑色素瘤治疗进行开发利用的潜力,为黑色素瘤的治疗提供新的有效的治疗手段,但其具体分子生物学机制尚需研究证实。

有报道提出,木鳖子为一种有毒的中药,但关于木鳖子毒性的记载历代本草存在争议[5-7]。

《开宝本草》言“无毒”;《本草纲目》称其“有小毒”。

目前,对于木鳖子抗肿瘤效应与其毒性剂量关系方面的研究尚未见报道,本研究发现,CMSEE和CMSWE在对肿瘤细胞有抑制作用的浓度范围内,对外周血单个核细胞的生长均无显著影响,提示CMSEE对机体的免疫细胞没有损伤作用。

沈丕安[8]报道,用木鳖子饮片水煎服治疗肿瘤和类风湿关节炎的最大剂量为3～9g,没有发现明显的毒副作用。

但是关于木鳖子抗肿瘤活性的浓度及其与毒性剂量的关系尚需进一步研究,以确保用药安全有效。

参考文献
【相关文献】
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[2] 林慧彬,彭湘军,路俊仙,等.木鳖子的本草考证[J].四川中医,2009,27(2):54-56.
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[8] 沈丕安.中药药理与临床运用[M].北京:人民卫生出版社,2006:888.。