大肠杆菌电击转化流程

大肠杆菌电击转化流程
大肠杆菌感受态制备及电转化流程
1.细菌电转化感受态细胞的制备
准备：50mL离心管3个10%甘油≥200mL 灭菌蒸馏水≥100mL 冰盒（50mL离心管预冷）2个
1）由-80℃冰箱保存的菌种划单菌落，过夜培养16-20h。

晚上将新鲜的菌落接种于装有20mLLB培养基的250mL三角瓶中，37℃振荡培养过夜（约12h），转速控制在200rpm；2）第二天，取过夜培养物以1%接种量（可适当加大）转接入2个含50mLLB培养基的250mL三角瓶中，37℃剧烈振荡（200rpm）培养至OD600约为0.5~0.6；
3）将2瓶细菌培养物分别倒入两个预冷的50mL离心管，然后至于冰水混合物中骤冷，一定要骤冷，冰水混合物中冷却至少15min （需要的话这种方式可以存放培养液数小时）3）将离心管于4℃，4000rpm，离心10min，收集菌体，弃上清；
4）用50ml灭菌蒸馏水(预冷至4℃)轻轻重悬菌体，先加入少量水重悬菌体，然后把水加满，4℃，4000rpm离心10min，弃上清，再重复一次；
5）再用10%甘油重复步骤4）两次，4000rpm离心10min，最后一次倒尽上清后，再用残存管底的甘油悬浮细胞，分装ep管，100μL/支（一般，25mL起始培养物最终用200-250μL l0%甘油悬浮）；
6）放入-80℃冰箱中速冻。

或者立即用于电转化。

注意：
1）菌种最好是-80℃冻存的，活化后生长状态较好。

2）20ml培养过夜，振荡速度不要过高（一般应该是37℃，300rpm，6h，当天转接，这样一天内工作量太大，这里我们选择过夜培养，时间长，转速控制在200rpm，可以适当缩短时间，前一天晚接种，第二天早转接）
3）培养完毕后一定要骤冷，是培养物在短时间内迅速冷却。

冰水混合物中摇动瓶子，大约15min。

4）使用的器皿一点要非常干净，没有化学物质残存，可以先用餐洗净洗，再加入NaOH 固体和蒸馏水产热，最后用蒸馏水反复冲洗干净。

注意pH值检测
5）培养完毕后的离心操作一定要低温，所用的水和甘油，离心管都要冰上预冷。

6）整个过程尽量不要用枪吹打。

7）器皿和试剂最好最后用重蒸水涮洗和配置。

8）控制好菌体的OD600值，收菌以半对数期合适，一般OD为0.5~0.6最佳，过则不佳。

9）最后一次务必倒尽上清后，用残存管底的甘油悬浮细胞，一般每管仅剩200μL左右。

切勿用过多甘油也悬浮细胞，我曾用350-500μL10%的甘油/25mL出发菌液，导致细
胞浓度下降，电转效率低2-3个数量级。

2 电转化
准备：冰盒、1.5mL离心管、电击杯、37℃的LB培养基
1)将电击杯冰上预冷，冻存的感受态细胞取出冰上溶解
2)在冰上，30μL感受态细胞加入1μL纯化的连接液（或者加入0.3-0.5未纯化的连接液），
冰上培育5min;
3)将混合液加入预冷的电击杯(不要产生气泡)，冰浴10min;
4)然后电击（注意擦干杯外的水，防止电火花），电击条件为2.5KV，200欧姆，25uF（我
们用的是BioRad电转化仪，0.2电转化杯），时间常数应该在4.5-5ms之间（其值越大，说明感受态细胞中离子去除率越彻底。

）电击（将电击杯推入电转化仪，按一下pulse 键，听到蜂鸣声）。

（Dopowt专利：klebisella 200欧姆，2.5kv4-5ms，0.2电击杯，40μL细胞+1～2μLDNA）
5)迅速加入1mL37℃保温的LB（电转完成后加入无抗性培养基的
速度很重要，一般不能
超过一分钟，否则效率大大降低），将混合液吸出，转移到1.5mL的离心管中（此步有热击的作用，室温进行）
6)37℃，220-250rpm振荡培养1h，可适当延长时间，使其充分表达抗性
7)涂板
注意：
1）电击之前保持低温状态
2）连接液要纯化，去离子，ddH2O溶，或者加入0.3-0.5μL未纯化的连接液，切勿过多以免电火花，我曾经使用过0.3μL和0.6μL连接液的加入细胞做对比，转化效率相当3）原核生物受体细胞电击以15kw/cm场强为最佳，电击电压根据电击杯厚度选择
4）电击杯使用完，用针头蒸馏水反复冲洗杯底，再用70%乙醇浸泡，4℃存放，使用前烘干即可，或者烘干后，-20℃冰箱存放5）37℃振荡培养时间切勿过长，否则会有很多的卫星菌落和轻微的菌膜干扰。

我曾培养1h45min即出现上述卫星菌落和轻微的菌膜干扰
电击杯的清洗流程
清洗方法一：
1.用清水将电击杯稍冲一下
2.向电击杯中加入75%的酒精浸泡2h
3.弃去酒精，在用蒸馏水冲洗2-3遍，然后用1mL的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10
遍以上
4.加入无水乙醇2mL于电击杯中浸泡30分钟
5.弃去无水乙醇，于通风橱内挥发干乙醇
6.将清洗好的电击杯放入-20℃冰箱内待用
7.不同样品使用的电击杯应分开；每周用1%酒精浸泡30分钟。

清洗方法二：
1、第一次使用完后，立即对着自来水冲洗几次，然后放在泡有洗
衣粉的瓶子里泡几个小时；
2、然后用牙签裹住一薄层棉花深入到夹层里来回清洗两遍（彻底除去夹缝里残存的菌液）；
3、用干净的容器装住电击杯，同时泡上单蒸水，在70度水浴一小时左右（让残余的DNA
彻底变形）；
4、倒去单蒸水之后，泡上70%的酒精；
5、什么时候想用了，拿出来到超净台吹干。