一种食品中苏丹红的检测方法[发明专利]

[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 1975390A [43]公开日2007年6月6日
[21]申请号200610095290.8[22]申请日2006.12.13
[21]申请号200610095290.8
[71]申请人西南大学
地址400715重庆市北碚区天生路2号
[72]发明人黄承志 武丽萍 [74]专利代理机构重庆华科专利事务所代理人康海燕
[51]Int.CI.G01N 21/78 (2006.01)G01N 21/25 (2006.01)G01N 21/49 (2006.01)
权利要求书 2 页 说明书 7 页
[54]发明名称
一种食品中苏丹红的检测方法
[57]摘要
本发明涉及一种食品中苏丹红的检测方法，它
通过在硝酸银、氢氧化钠和氨水混合溶液中加入经
前处理的检测样品和曲通X－100溶液，观测样品溶
液的颜色变化来判断是否含有苏丹红；并通过与标
样对照来进行半定量检测；进一步采用加标回收法，
根据线性方程计算得到实际样品中苏丹红的浓度。

本发明的优点是检测简便快速，检测成本大大降低，
检测效果好；前处理只需用DMF进行搅拌萃取和过
滤分离，步骤简单，更容易操作；通过颜色变化即
可判断实际样品中是否含有苏丹红，方便快捷，整
个过程更容易实现。

200610095290.8权 利 要 求 书第1/2页 1、一种食品中苏丹红的检测方法，其步骤如下：
(1)确定检测标准：
A、定性及半定量检测的标准：将1.0-10.0mL 1.0×10-3M硝酸银溶液、
0.1-1.5mL 0.1M氢氧化钠溶液和0.1-2.0mL 0.4％氨水在试管中充分混合，然后分别加入1.0×10-5M苏丹红I、II、III、IV，浓度范围分别是0.2-2.4μM、0.1-2.4μM、0.1-2.4μM，0.2-3.0μM，和0.1-0.8mL 0.2％曲通X-100溶液，用水稀释到5.0-10.0m L，再次混匀，10-30m i n后，得到不同浓度下不同深浅的棕色溶液，对不同浓度下颜色深浅不同的苏丹红溶液拍照记录，当苏丹红浓度较小不易观察颜色变化时，用激光笔或L E D照射溶液，同样拍照记录观察到的散射光强弱，以上述记录作为定性和半定量检测的标准；
B、定量标准：步骤A中加入不同浓度的苏丹红的溶液，用F-4500荧光光度仪精确检测其散射信号，建立散射强度与苏丹红浓度的线性关系，计算得到如下参数：苏丹红I、II、III、IV的线性方程分别为，ΔI＝-130.4+1005.5 c，ΔI＝1.74+1082.6c，ΔI＝-67.9+1016.7c，ΔI＝-108.9+1092.9c，线性范围分别为0.2-2.4μM、0.1-2.4μM、0.1-2.4μM，0.2-3.0μM，相应的检出限(3σ)分别为3.2n M、3.0n M、3.2n M，2.9n M，相关系数分别为0.9973，0.9958，0.9969，0.9990，以此为实际样品的测定提供定量标准；
(2)对待测的食品进行前处理，用D M F稀释、搅拌、萃取、过滤得滤液，为检测样品；
(3)定性检测：将1.0-10.0mL 1.0×10-3M硝酸银溶液、0.1-1.5mL 0.1 M氢氧化钠溶液和0.1-2.0m L 0.4％氨水在试管中充分混合，然后再加入0.01-0.2mL的稀释后的检测样品和0.1-0.8mL 0.2％曲通X-100溶液，用水稀释到5.0-10.0m L，再次混匀，10-30m i n后，通过观测样品溶液的颜色是否
200610095290.8权 利 要 求 书 第2/2页变化为棕色来判断是否含有苏丹红；
(4)半定量检测：通过与标样对照样品溶液的颜色变化或用激光笔或L E D照射得到的散射光强弱，即可粗略确定样品中含有的苏丹红的量，从而实现对苏丹红的半定量检测。

2、根据权利要求1所述的食品中苏丹红的检测方法，其特征在于还可进一步进行定量检测，步骤如下：
A、将1.0-10.0mL 1.0×10-3M硝酸银溶液、0.1-1.5mL 0.1M氢氧化钠溶液和0.1-2.0mL 0.4％氨水在试管中充分混合，然后再加入0.01-0.2mL的稀释后的检测样品和0.1-0.8mL 0.2％曲通X-100溶液，用水稀释到5.0-10.0 m L，再次混匀，平行加五组，10-30m i n后，用F-4500荧光光度仪测定散射强度ΔI，根据线性方程计算得到实际样品中苏丹红的浓度c，取平均值后即得测得值；
B、在步骤A的基础上，再加入1.0×10-5M苏丹红I、I I、I I I、或I V溶液，然后再稀释到5.0-10.0m L混匀，平行加五组，10-30m i n后，测定散射强度，根据线性方程又计算得到苏丹红的总浓度，取平均值后即得总测得值；
C、计算五次测定的回收率和相对标准偏差；
D、根据检测结果，计算辣椒油或其它样品中含有的苏丹红的含量，由于用线性方程计算得到的苏丹红含量的单位是M，即m o l/L，再根据具体检测时处理实际样品的用量以及用荧光光度仪检测时实际样品稀释的倍数，计算得到每克实际样品中含有多少毫克苏丹红。

200610095290.8说 明 书第1/7页
一种食品中苏丹红的检测方法
技术领域
本发明涉及一种苏丹红的检测方法。

背景技术：
目前，欧盟公布的检测苏丹红的标准方法是“高效液相色谱与电喷雾离子化质谱仪联用”检测法(H P L C/A P C I-M S法)。

该方法检测的步骤是，实际样品先用乙腈萃取，过滤后通过高效液相色谱分离，之后用质谱进行定量检测。

另用其它检测方法如“高效液相色谱——紫外检测方法”
(H P L C-U V法)，其前面的步骤与欧盟公布的类似，只是最后定量检测时用的是紫外分光光度仪。

还有“H P L C-D A D”检测法等。

但是，无论是哪种方法，均需用高效液相色谱进行分离，前处理复杂，且所用仪器贵重。

发明内容：
本发明的目的在于针对现有苏丹红检测方法存在的不足，提供一种步骤简单，检测准确的对食品中苏丹红进行检测的方法。

本方法所涉及的物质有：
苏丹红I、II、III、IV，为最初的研究提供标样；
D M F，即N，N-二甲基甲酰胺，用于溶解苏丹红标样及萃取实际样品； 硝酸银溶液，做氧化剂；
氢氧化钠，提供强碱性环境；
氨水，防止银离子沉淀；
曲通X-100，稳定生成的银钠米粒子；
对本醌类物质，反应产物；
银钠米粒子，另一反应产物，也是通过其宏观的棕色及其散射光来间接判断苏丹红的存在。

所使用的设备有：
QL-901型旋涡混合器，用来充分混合反应溶液；
激光笔(653n m，2.0m W)和光发射二极管(L E D，458n m，0.5m W)，用于照射反应溶液，从而用肉眼直接观察光散射现象；
F-4500荧光光度仪，用于精确测定反应后溶液的散射值，建立散射强度与苏丹红浓度的线性关系，从而实现苏丹红含量的精确测定； L C系统，利用该系统，运用欧盟公布的标准方法对实际样品进行检测，与散射法做对照，证明散射法的可靠性。

检测方法如下：
1、确定检测标准：
A、定性及半定量检测的标准：将1.0-10.0mL 1.0×10-3M硝酸银溶液、
0.1-1.5m L 0.1M氢氧化钠溶液和0.1-2.0m L 0.4％氨水在10m L试管中充分混合，然后分别加入1.0×10-5M苏丹红I、II、III、IV，浓度范围分别是0.2-2.4μM、0.1-2.4μM、0.1-2.4μM，0.2-3.0μM，和0.1-0.8mL 0.2％曲通X-100溶液，用水稀释到5.0-10.0m L，再次混匀，10-30m i n后，得到不同浓度下不同深浅的棕色溶液，对不同浓度下颜色深浅不同的苏丹红溶液拍照记录，当苏丹红浓度较小不易观察颜色变化时，用激光笔或L E D照射溶液，同样拍照记录观察到的散射光强弱，以上述记录作为定性和半定量检测的标准；
B、定量标准：步骤A中加入不同浓度的苏丹红的溶液，用F-4500荧光光度仪精确检测其散射信号，建立散射强度与苏丹红浓度的线性关系，计算得到如下参数：苏丹红I、II、III、IV的线性方程分别为，ΔI＝-130.4+1005.5
c，ΔI＝1.74+1082.6c，ΔI＝-67.9+1016.7c，ΔI＝-108.9+1092.9c，线性范围分别为0.2-2.4μM、0.1-2.4μM、0.1-2.4μM，0.2-3.0μM，相应的检出限(3σ)分别为3.2n M、3.0n M、3.2n M，2.9n M，相关系数分别为0.9973，0.9958，0.9969，0.9990，以此为实际样品的测定提供定量标准；
2、对待测的食品进行前处理，用D M F稀释、搅拌、萃取、过滤得滤液，为检测样品；
3、定性检测：将1.0-10.0mL 1.0×10-3M硝酸银溶液、0.1-1.5mL 0.1M 氢氧化钠溶液和0.1-2.0mL 0.4％氨水在试管中充分混合，然后再加入0.01-0.2mL的稀释后的检测样品和0.1-0.8mL 0.2％曲通X-100溶液，用水稀释到5.0-10.0m L，再次混匀，10-30m i n后，通过观测样品溶液的颜色是否变化为棕色来判断是否含有苏丹红。

由于碱性环境下的硝酸银为无色，苏丹红为亮黄色，实验所用浓度下为很浅的黄色，而当其与硝酸银发生氧化还原反应后，生成的银钠米粒子显示棕色，变化明显，这样，就可以通过颜色的变化来确定是否含有苏丹红。

4、半定量检测：通过与标样对照样品溶液的颜色变化或用激光笔或L E D 照射得到的散射光强弱，即可粗略确定样品中含有的苏丹红的量，从而实现对苏丹红的半定量检测。

5、定量检测：
A、将1.0-10.0mL 1.0×10-3M硝酸银溶液、0.1-1.5mL 0.1M氢氧化钠溶液和0.1-2.0mL 0.4％氨水在试管中充分混合，然后再加入0.01-0.2mL的稀释后的检测样品和0.1-0.8mL 0.2％曲通X-100溶液，用水稀释到5.0-10.0 m L，再次混匀，平行加五组，10-30m i n后，用F-4500荧光光度仪测定散射强度ΔI，根据线性方程计算得到实际样品中苏丹红的浓度c，取平均值后即
得测得值；
B、在步骤A的基础上，再加入1.0×10-5M苏丹红I、I I、I I I、或I V溶液，然后再稀释到5.0-10.0m L混匀，平行加五组，10-30m i n后，测定散射强度，根据线性方程又计算得到苏丹红的总浓度，取平均值后即得总测得值；
C、计算五次测定的回收率和相对标准偏差；
D、根据检测结果，计算辣椒油或其它样品中含有的苏丹红的含量，由于用线性方程计算得到的苏丹红含量的单位是M，即m o l/L，再根据具体检测时处理实际样品的用量以及用荧光光度仪检测时实际样品稀释的倍数，计算得到每克实际样品中含有多少毫克苏丹红。

为保证实际检测的可靠性，我们用高效液相色谱法，用L C系统对同样批次的实际样品进行平行检测，通过最终计算结果的对比，证明散射法的准确性。

本发明是从完全不同的角度出发而设计的简便快速检测食品中苏丹红的方法，检测成本大大降低，检测效果好；本方法前处理，只需用D M F 进行搅拌萃取和过滤分离，步骤简单，更容易操作；此外，通过颜色变化即可判断实际样品中是否含有苏丹红，方便快捷，整个过程更容易实现。

比较欧盟标准方法检测苏丹红I的检出限，1.3×10-2μg/mL，本方法更灵敏，检出限为1.1×10-3μg/mL。

具体实施方式
实施例1：市售辣椒油中苏丹红含量的检测
1、先确定检测标准：
A、定性及半定量检测的标准：将2.25m L 1.0×10-3M硝酸银溶液、0.4
m L 0.1M氢氧化钠溶液和0.25m L 0.4％氨水在10m L试管中充分混合，然后分别加入1.0×10-5M苏丹红I、II、III、IV，浓度范围分别是0.2-2.4μM、0.1-2.4μM、0.1-2.4μM，0.2-3.0μM，和0.3mL 0.2％曲通X-100溶液，用水稀释到5.0m L，再次混匀，20m i n后，得到不同浓度下不同深浅的棕色溶液，对不同浓度下颜色深浅不同的苏丹红溶液拍照记录，当苏丹红浓度较小不易观察颜色变化时，用激光笔或L E D照射溶液，同样拍照记录观察到的散射光强弱，以上述记录作为定性和半定量检测的标准；
B、定量标准：对步骤A中得到的不同浓度的苏丹红的溶液，用F-4500荧光光度仪精确检测其散射信号，建立散射强度与苏丹红浓度的线性关系，计算得到如下参数：苏丹红I、II、III、IV的线性方程分别为，ΔI＝-130.4+ 1005.5c，ΔI＝1.74+1082.6c，ΔI＝-67.9+1016.7c，ΔI＝-108.9+1092.9c，线性范围分别为0.2-2.4μM、0.1-2.4μM、0.1-2.4μM，0.2-3.0μM，相应的检出限(3σ)分别为3.2n M、3.0n M、3.2n M，2.9n M，相关系数分别为0.9973，0.9958，0.9969，0.9990，以此为实际样品的测定提供定量标准。

2、对辣椒油进行前处理：分别取1.0g辣椒油加入到试管中，用D M F稀释到10mL后充分搅拌，萃取其中可能含有的苏丹红，搅拌1h后静置10分钟，用0.45μm的微孔滤膜过滤上层清液，将滤液稀释10倍后进行检测；
3、在10m L试管中依次加入2.25m L 1.0×10-3M硝酸银溶液、0.4m L 0.1M氢氧化钠溶液和0.25m L 0.4％氨水，充分混合，然后再加入0.03m L上述处理好的辣椒油样品和0.3mL 0.2％曲通X-100溶液，稀释到5.0mL，再次混匀，平行加五组，20m i n后，测定散射强度，根据线性方程可计算得到实际样品中苏丹红的浓度，取平均值后即得“测得值”；
4、在步骤3的基础上，再加入0.4m L 1.0×10-5M苏丹红I V溶液，稀释
到5.0m L ，然后混匀，平行加五组，20m i n 后，测定散射强度，根据线性方程又计算得到苏丹红的总浓度，取平均值后即得“总测得值”；
4、计算五次测定的回收率和相对标准偏差；
具体结果列于下表中：
5、根据检测结果，计算辣椒油样品中含有的苏丹红的量为：1.64×10
-2mg/g；
为证明本方法的实际可靠性，我们利用欧盟公布的标准——高效液相色谱法用L C 系统对相同批次的实际样品进行检测对照。

测定的结果是
3.38×10-2mg/g。

二者非常接近，证明我们的方法简单可信。

实施例2：市售辣椒酱中苏丹红含量的检测
采用的检测标准与实施例1相同。

1、先对辣椒酱进行前处理：分别取1.0g 辣椒酱加入到试管中，用D M F 稀释到10m L 后充分搅拌，萃取其中可能含有的苏丹红，搅拌1h 后静置10分钟，用0.45μm 的微孔滤膜过滤上层清液，将滤液稀释10倍后进行检测；
2、在10m L 试管中依次加入2.25m L 1.0×10-3M 硝酸银溶液、0.4m L
实际样品中的苏丹红的含量(n＝5)
样品
测得值
(μM)
加入值(μM)总测得值(μM)回收率(％)相对标准偏差(％)辣椒油0.430.80 1.1690.8-102.5 4.0所有测定值均是以苏丹红IV的线性方程为标准，平行测定五次取平均值得到
的结果。

各物质浓度：AgNO 3，4.5×10-4M；NaOH，8.0×10-3
M；NH 3·H 2O，0.02％；TritonX-100.0.012％.λ＝452nm.
0.1M 氢氧化钠溶液和0.25m L 0.4％氨水，充分混合，然后再加入0.02m L 上述处理好的辣椒酱样品，和0.3mL 0.2％曲通X-100溶液，稀释到5.0mL ，再次混匀，平行加五组，20m i n 后，测定散射强度，根据线性方程可计算得到实际样品中苏丹红的浓度，取平均值后即得“测得值”；
3、在步骤2的基础上，再加入0.15m L 1.0×10-5M 苏丹红I V 溶液，稀释到5.0m L ，然后混匀，平行加五组，20m i n 后，测定散射强度，根据线性方程又计算得到苏丹红的总浓度，取平均值后即得“总测得值”；
4、计算五次测定的回收率和相对标准偏差；
具体结果列于下表中：
5、根据检测结果，计算辣椒酱样品中含有的苏丹红的量为：7.61×10
-3mg/g。

实际样品中的苏丹红的含量(n＝5)
样品
测得值
(μM)
加入值(μM)总测得值(μM)回收率(％)相对标准偏差(％)辣椒酱0.200.300.4993.3-103.3 4.9所有测定值均是以苏丹红IV的线性方程为标准，平行测定五次取平均值得到
的结果。

各物质浓度：AgNO 3，4.5×10-4M；NaOH，8.0×10-3
M；NH 3·H 2O，0.02％；TritonX-100，0.012％.λ＝452nm.。