实验三：药敏资料讲解

(80单位）
金葡菌
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
结果
细菌生长
-- - -- ++
++
青霉素浓度 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125 0.0625 对照--
结果判断:抑制肉眼可见生长的最低药物浓度
为该药对检测菌的MIC
影响因素？临床意义？
定量的测试菌的制备
1、将金黄色葡萄球菌ATCC25923和金黄色葡 萄球菌临床种的6小时肉汤培养物，调整浓度 至0.5麦氏比浊管（相当于1.5×108CFU/ml)； 或挑新鲜培养的单个菌落，在无菌生理盐水中 研磨，校正其浓度至0.5麦氏比浊管。
2、将调好浊度的菌液用无菌肉汤稀释10倍， 即可使用。
思考题： 影响因素？ 1、培养基的质量：双层抑菌圈的出现？ 2、纸片质量 3、接种细菌的菌量 4、孵育的温度和时间 5、操作因素
稀释法
微量稀释法 常量稀释法（试管稀释法）
常量稀释法（试管稀释法）
1、实验目的： 用于测量某种药物对测试菌的最小抑菌浓
度（MIC） 2、实验原理：
将抗菌药物混合于肉汤中作一系列的稀释， 再加入定量的测试菌，经一定时间和温度培养 后，无细菌生长的最低药物浓度即为该药对此 菌的MIC。
3、若抑菌圈内有散在菌落出现，排除污染菌 的存在和其他影响因素，若无污染菌等，需重 做。
结果观察： 1、结果解释：用毫米尺量取抑菌圈直径，参照书上的标
准判读结果。按敏感（S）、中介（I）、耐药（R）报 告。 例如：抗菌药物丁胺卡那霉素（AMK），每张纸片含药 量30微克，抑菌圈≤14mm为耐药，15-16mm为中介， ≥17mm为敏感。 2、质量控制：标准菌株的抑菌圈应落在书上的预期范围 内，如果超出该范围，应为失控，而不发报告，应及时 查找原因，予以纠正。 例如：抗菌药物丁胺卡那霉素（AMK），每张纸片含药 量30微克，金黄色葡萄球菌ATCC标准株的抑菌圈应在 20-26mm之间。
3、平板在室温下干燥5分钟，用无菌镊子将抗菌药物 纸片贴于琼脂表面，各纸片中心相距大于24mm，距 平板內缘大于15mm， 37 ℃温箱中孵育16-18小时， 量取抑菌、准确量取抑菌圈直径，若抑菌圈为椭圆形， 量其最长径和最短径，取其平均值。
2、若出现双层抑菌圈，一般药物测量内圈， 而磺胺类药物则量其外圈。
步骤和方法 将抗菌药物用肉汤稀释成不同浓度，加入定量
测试菌。
编号
1 2 3 4 5 6 7 8 9（对照）
无菌肉汤管 1.8 1 1 1 1 1 1 1 1
（ml）
青霉素 0.2 1 1 1 1 1 1 1 弃去
(80单位）
稀释的金葡菌0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
方法:（4人一组，2人做金葡菌标准种，2人做 临床种，每种菌选4个不同的药物纸片）
1、制备MH琼脂平板：将加热融化的琼脂冷却至 60℃左右时倾注于直径为9cm的无菌平板中，使琼脂 厚度为4mm，待琼脂凝固后使用，如有冷凝水产生， 可放置37 ℃温箱中15-30分钟后使用。
2、无菌棉签蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌 液后在平板表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板 60°，最后沿平板內缘涂布1周。
实验三 药敏
实验内容
一、纸片扩散法（K-B法） 二、稀释法 (MIC)
实验目的
一、掌握纸片扩散法的原理、操作方法、结果 的判断及其临床意义。
二、掌握纸片扩散法的质量控制(采用标准菌 株控制可变因素)。
三、掌握肉汤稀释法抗生素敏感性试验的原理、 操作方法、结果判断及临床意义。
四、了解稀释法的质量控制(采用标准菌株控 制可变因素)。
纸片扩散法（K-B法）
器材与试剂
菌种： 金黄色葡萄球菌ATCC25923和金黄色 葡萄球菌临床种的6小时肉汤培养物，调整浓 度至0.5麦氏比浊管（相当于1.5×108CFU/ml)； 或挑新鲜培养的单个菌落，在无菌生理盐水中 研磨，校正其浓度至0.5麦氏比浊管。 培养基：水解酪蛋白培养基（MH琼脂）。 其他：无菌棉签、抗菌纸片、镊子、直尺等。
（ml)
37℃培养16-18小时
结果观察:
完全抑制细菌生长的最低药物浓度即为该抗菌 药对此菌的MIC。
此次实验即为青霉素对金黄色葡萄球菌ATCC 株和临床株的MIC。
结果举例：
编号
123456 7 8 9
无菌肉汤管 1.8 1 1 1 1 1 1
1
1
（ml）
青霉素
0.2 1 1 1 1 1 1 1 弃去