高效液相色谱法同时测定莱芜香肠中的五种食品添加剂_曹峰

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[4] 张海琪, 丁雪燕, 薛辉利, 等. 呋喃唑酮在凡纳滨对虾组织中代谢动力学研究[J]. 宁波大学学报:理工版, 2009, 22(4): 472-476.
[5] 杨琳, 傅红, 刘强, 等. 水产品及其苗种中硝基呋喃代谢物的高效[J]. 食品科学, 2010, 31(12): 206-211.
[6] 宋阳威. 呋喃类药物检验检疫现状及对策[J]. 中国动物检
高效液相色谱法同时
测定莱芜香肠中的五种食品添加剂曹峰，孟昭春，张建国，孟诚，徐强
莱芜市产品质量监督检验所（莱芜 271100）
摘要对高效液相色谱法同时测定莱芜香肠中的5种食品添加剂(苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、胭脂红和苋菜红)进行了研究。

此本方法采用纯水-甲醇溶液作为提取液, 氢氧化钠-硫酸锌作为蛋白质沉淀剂, 用SymmertryShield RP18柱为分离柱, 以甲醇-0.02 mol/L乙酸铵(pH 6.8)为流动相(梯度洗脱), 柱温30 ℃, 紫外检测器在波长234 nm条件下检测, 一次进样, 12 min内完成分析过程, 平均加标回收率为95.5%~103.9%, 相对标准偏差2.14%~2.67%, 检出限为1.4×10-4～3.0×10-4 g/kg。

关键词
高效液相色谱法; 莱芜香肠; 食品添加剂
Simultaneous Determination of Five Food Additives in Laiwu Sausage by High
Performance Liquid Chromatography
Cao Feng, Meng Zhao-chun, Zhang Jian-guo, Meng Cheng, Xu Qiang Laiwu Institute of Supervision and Inspection on Product Quality (Laiwu 271100)
Abstract A rapid method for simultaneous determination of fi
ve food additives (benzoic acid, sorbicacid, dehydroacetic acid, carmine and amaranth) in Laiwu sausage by HPLC was developed in this paper. This method uses water-methanol solution as extract, NaOH-ZnSO 4 as protein precipitant and liquid chromatographic separation was performed on a SymmertryShield RP18 column. The mobile phase is methanol-0.02 mol/L ammonium acetate (pH 6.8, gradient elution) with column temperature 30 ℃, and lastly detected at 234 nm through a UV detector. The separation was achieved within 12 min, the average recoveries 95.5%~103.9%, RSD 2.14%~2.67%, and detection limits 1.4×10-4~3.0×10-4 g/kg.Keywords HPLC; Laiwu sausage; food additives
食品添加剂是现代食品工业的基础，适量添加可以延长保质期，改善食品色、香、味等品质。

但目前所用食品添加剂多为化学合成所得，经动物学试验证明有些合成添加剂有致癌、致畸形等作用，如不加限制，会对人体健康产生危害[1-2]。

莱芜香肠是山东名吃，已有200多年的历史，享誉省内外。

根据GB 2760—2011 食品添加剂使用标准及《肉制品生产许可证审查细则（2006版）》的规定，莱芜香肠在日常监督检验及发证检验中苯甲酸、山梨酸、胭脂红等食品添加剂是必检项目。

高效液相色谱法是目前食品添加剂定性、定量分析的常用方法，具有分离效果好，灵敏度高、重现性好等优点[3]。

但由于食品添加剂的性质各异，目前一些国标检测方法[4-6]大多只能同时测定一种或少数几种，同时检测莱芜香肠中的苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、胭脂红、苋
菜红5种食品添加剂的高效液相色谱法少见报道。

莱芜香肠蛋白质及脂肪含量高，常见处理方法去除蛋白质及脂肪效果差，易堵塞色谱柱，造成柱效下降。

针对这一问题，参照相关研究[7-8]并加以改进，采用纯水-甲醇溶液作为提取液，氢氧化钠-硫酸锌作为蛋白质沉淀剂，较好地解决了这一问题，大大降低了对色谱柱的损害，并建立了一种准确、快速，可同时测定莱芜香肠中5种食品添加剂的高效液相色谱法。

1 材料与方法
1.1 设备与材料
Waters e2695高效液相色谱仪（带自动进样器，Em-power 3工作站）：美国Waters公司；Waters 2489紫外/可见光检测器：美国Waters公司；SymmertryShield RP18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5.0 μm）：美国Waters公司；
疫, 2003, 20(3): 37-39.
[7] 邢丽红, 孙伟红, 李兆新, 等. 液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)法快速测定水产品中硝基呋喃类代谢物[J]. 环境化学, 2011, 30(6): 1202-1203.
[8] 傅国, 李宁毅. 硝基呋喃类和硝基咪唑类药物的研究进展
[J]. 青岛大学医学院学报, 2003, 39(3): 486-488.
分析检测
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JAC-100超声波清洗器：济宁市奥波超声电气有限公司；XW-80A 旋涡混合器：上海精科实业有限公司；标准物质（苯甲酸，山梨酸，脱氢乙酸，胭脂红，苋菜红）：中国计量科学院；甲醇（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；乙酸铵（优级纯）：天津市巴斯夫化工有限公司；硫酸锌（优级纯）：天津市永大化学试剂开发中心；氢氧化钠（优级纯）：天津市风船化学试剂有限公司。

1.2 色谱条件
流动相为甲醇-0.02 mol/L乙酸铵缓冲液（pH 6.8），梯度洗脱（甲醇：5%保持5 min；5%~30%，10%/min；30%继续3 min；30%~5%，12.5%/min），流速为1 mL/min，进样量为20 μL，柱温为30 ℃，紫外检测器波长234 nm。

以保留时间定性，峰面积定量。

1.3 样品处理
准确称取绞碎的莱芜香肠样品2.000 g左右于25 mL比色管中，加入5 mL纯水，5 mL甲醇，混匀后加入1.0 mL 0.5 mol/L氢氧化钠溶液，涡旋混匀，于超声波清洗器中超声提取10 min，然后加入0.42 moL/L硫酸锌溶液1.5 mL，涡旋混匀1 min，再加入1.5 mL 0.5 mol/L氢氧化钠溶液，涡旋混匀30 s，用纯水定容至25.0 mL，混匀，静置10 min，过滤，弃去初滤液，其余滤液再经0.45 nm滤膜过滤，待测。

2 结果与分析
2.1 色谱条件的优化2.1.1 检测波长的选择
苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、胭脂红、苋菜红5种食品添加剂均具有紫外吸收，因此选择紫外检测器，但其最大吸收波长各不相同，苯甲酸和山梨酸最大吸收波长为230 nm，脱氢乙酸为234 nm [1]，苋菜红、胭脂红最大吸收波长为254 nm [5]。

参考国标方法[4-6]分别在230 nm，234 nm，240 nm，254 nm 4种波长下对这5种食品添加剂进行检测，发现234 nm时5种食品添加剂的灵敏度都相对较高，因此选择234 nm作为检测波长。

2.1.2 流动相及洗脱条件的选择
参照相关文献[4-6,9]，本研究选择甲醇-乙酸铵缓冲液（0.02 mol/L，pH 6.8）作为流动相，以体积比10∶90和5∶95对混合标准物质在波长为234 nm条件下进行等度洗脱，结果分别见图1和图2。

由图1可以看出在甲醇-乙酸铵体积比为10∶90条件下等度洗脱，山梨酸和脱氢乙酸不能很好的分离，影响检测效果。

由图2可见在甲醇-乙酸铵体积比为5∶95条件下等度洗脱，苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸出峰时间集中在4~9 min，三者能完全分离，但苋菜红、胭脂红未能在30 min内出峰，可能是由于这两种物质在此洗脱条
件下柱内保留性较强，出峰时间在30 min以后，这不利于提高检测效率。

相关研究[10]表明采用梯度洗脱，后期加强洗脱强度，可以提高分离效果，缩短分析时间。

甲醇-乙酸铵以5∶95体积比为起始洗脱比例，对梯度洗脱做了进一步的研究，最终确定梯度洗脱方法为：甲醇：5% 保持5 min；5%~30%，10%/min；30%继续3 min；30%~5%，12.5%/min。

试验结果表明，该洗脱方法能使苯甲酸等5种被分析物质在较短时间内很好的分离，且峰形良好，整个分析过程在12 min内
完成。

图1 混合标准溶液色谱图
图2 混合标准溶液色谱图
2.1.3 柱温的选择
柱温对色谱柱的分离效果有一定影响，随着温度升高，柱压下降，被分析物的保留时间缩短，而降低柱温有利于组分的分离[7]。

本研究参考相关资料在25 ℃，30 ℃，35 ℃，40 ℃四种温度下测试色谱柱的分离效果，结果显示，在35 ℃时山梨酸、脱氢乙酸不能完全分离，40 ℃时苋菜红、胭脂红的两个峰也部分重叠，25 ℃和30 ℃时5种添加剂都能很好的分离，但25 ℃的条件下，出峰时间拖后，所以选择柱温为30 ℃。

通过以上试验，确定色谱条件为：流动相为甲醇-0.02 mol/L乙酸铵缓冲液（pH 6.8），梯度洗脱（甲醇：5% 保持5 min；5%~30%，10%/min；30%继续3 min；30%~5%，12.5%/min），流速为1 mL/min，进样量为20 μL，柱温为30 ℃，紫外检测器波长234 nm。

在此条件下，5种食品添加剂标准物质混合样的
色谱图如图3所示，香肠样品色谱图见图4所示。

分析检测
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图3 混合标准溶液色谱图
图4 莱芜香肠样品色谱图
2.2 5种食品添加剂的线性、精密度和检出限
在优化的条件下，对质量浓度在0.20~150 mg/L之间的5种食品添加剂标准物质溶液进行测定，结果显示浓度和峰面积之间均有良好的线性关系。

其回归方程、相关系数、检出限（在色谱条件下，以3倍信噪比为检出限[11]）、相对标准偏差（RSD）见表1。

表1 5种食品添加剂的标准曲线及检出限
食品添加剂线性范围/
mg・L -1
回归方程
相关系数检出限/g・kg -1
RSD/%苯甲酸0.20~150
Y =34 800X +2810.999 71.9×10-4 2.57山梨酸0.20~150Y =122 000X +2 3900.999 72.5×10-4 2.62脱氢乙酸0.20~150Y =1 250 000X -119 000
0.999 8
1.6×10-40.96
苋菜红0.20~150Y =108 000X +12 5000.999 23.0×10
-4
2.84胭脂红
0.20~150
Y =64 500X +1 7800.999 91.4×10-40.4
注: Y , 峰面积, X , 质量浓度mg /L。

2.3 样品加标回收率的测定
称取适量的香肠样品，按线性检测范围加入一定量的混合标准物质，按照1.3方法处理后，进行加标回收试验，测定6次，结果如表2所示。

从表中结果可以看出，在优化的分析条件下苯甲酸等5种食品添加剂的平均加标回收率为95.5%~103.9%，相对标准偏差（RSD）为2.14%~2.67%，测定结果准确可靠，完全满足食品添加剂的检测要求。

表2 加标回收试验（n =6）
食品添加剂本底值/mg・L -1加标量/mg・L -1
实测值/mg・L -1回收率/%RSD/%山梨酸 2.55257.46198.8 2.14脱氢乙酸04 3.82195.5 2.67苋菜红05 4.78595.7 2.41胭脂红
3.28
5
8.603103.9 2.32
2.4 干扰试验
在样品中分别加入日常检测中常用到的食品添加剂安赛蜜、糖精钠、柠檬黄、日落黄等物质，采用该法进行分析，结果显示所加入的食品添加剂均不干扰苯甲酸、山梨酸等5种食品添加剂的测定。

3 结论
本方法采用纯水-甲醇溶液为提取液，氢氧化钠-硫酸锌为蛋白质沉淀剂，甲醇-乙酸铵缓冲液为流动相，梯度洗脱，紫外检测器波长为234 nm，一次进样，可以在12 min内同时完成莱芜香肠中的苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸 、胭脂红、苋菜红5种食品添加剂的分析，平均加标回收率为95.5%~103.9%，相对标准偏差为2.14%~2.67%，检出限为1.4×10-4~3.0×10-4 g/kg。

该方法具有简便、分离效果好、准确、快速、抗干扰能力强等特点，适合食品检验机构的日常检验。

参考文献：
[1] 陈英, 谢晓峰, 狄俊伟. 高效液相色谱法测定食品中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸[J]. 理化检验-化学分册, 2007, 41(10): 887-888.
[2] 马康, 蒋孝雄, 赵敏, 等. 高效液相色谱法同时测定软饮料中20种食品添加剂[J]. 分析化学, 2012, 40(11): 1661-1667.[3] 黄海, 庄莉, 崔群. 高效液相色谱法同时测定榨菜中的10种食品添加剂[J]. 化学分析计量, 2011, 20(11): 20-22.[4] 中华人民共和国卫生部. GB/T 5009. 29—2003 食品中苯甲酸、山梨酸的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2003.[5] 中华人民共和国卫生部. GB/T 5009.35—2003 食品中合成着色剂的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2003.[6] 中华人民共和国国家质量监督检疫总局. GB/T 23377—2009 食品中脱氢乙酸的测定(高效液相色谱法)[S]. 北京: 中国标准出版社, 2009.
[7] 程盛华, 丁丽, 林玲, 等. 高效液相色谱法同时测定月饼中的苯甲酸、山梨酸和糖精钠[J]. 食品科学, 2008, 29(6): 376-378.
[8] 王士霞. 肉制品中防腐剂检测方法及应用研究[D]. 青岛: 青岛大学硕士论文, 2011.
[9] 吴光斌, 吕禹泽, 陈发河. 反相高效液相色谱法同时测定九种食品添加剂[J]. 食品科学, 2006, 27(11): 457-461.[10] 王亚平, 周勇, 黄鹂, 等. 高效液相色谱法同时测定酱腌菜中6种对羟基苯甲酸酯[J]. 浙江海洋学院学报: 自然科学版, 2008, 27(4): 425-429.
[11] 杨春林, 李佳峻, 吴蔚, 等. 高效液相色谱法测定糕点中5
种食品添加剂[J]. 食品研究与开发, 2012, 33(2): 146-49.
分析检测。