碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌的耐药机制及其与Ⅰ类整合子的相关性研究

碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌的耐药机制
及其与Ⅰ类整合子的相关性研究
杨雪娇１ꎬ杨欢１ꎬ焦芳艳１ꎬ２ａꎬ尹铁球１ꎬ２ｂ
(１.湖南中医药大学临床医学院ꎬ长沙４１０００７ꎻ２.湖南省脑科医院ａ.临检中心ꎬｂ.检验科ꎬ长沙４１０００７)
㊀㊀ＤＯＩ:１０ ３９６９/ｊ ｉｓｓｎ １００６￣２０８４ ２０２０ １３ ０３１基金项目:湖南省临床医疗技术创新引导计划项目(２０１８ＳＫ５０６０６)ꎻ湖南省卫生计生委计划项目(Ｂ２０１６０２６)ꎻ湖南中医药大学研究生培养
质量工程项目(２０１９ＣＸ３４)
通信作者:尹铁球ꎬＥｍａｉｌ:ｙｔｑｓｔａｒ＠１６３.ｃｏｍ
中图分类号:Ｒ３７㊀㊀㊀㊀㊀文献标识码:Ａ㊀㊀㊀㊀㊀文章编号:１００６￣２０８４(２０２０)１３￣２６５４￣０５
㊀㊀摘要:目的㊀分析碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌(ＣＲＰＡ)的耐药机制及其与Ⅰ类整合子的相关性ꎮ方法㊀选取２０１８年１０月至２０１９年２月湖南省脑科医院临床分离的１１０株非重复铜绿假单胞菌进行菌种鉴定及药敏试验ꎻ
参考美国临床和实验室标准协会标准ꎬ采用改良碳青霉烯灭活试验(ｍＣＩＭ)法和改良Ｈｏｄｇｅ法检测碳青霉烯酶ꎻ采用聚合酶链反应技术检测Ⅰ类整合子及可变区ꎮ结果㊀在分离的３９株ＣＲＰＡ中ꎬ１５.３８％(６/３９)ｍＣＩＭ法和改良Ｈｏｄｇｅ试验均为阳性ꎬ１株仅表现为ｍＣＩＭ法阳性ꎻ碳青霉烯类敏感株Ⅰ类整合子的检出率为９.８６％(７/７１)ꎻ碳青霉烯类耐药株Ⅰ类整合子的检出率为３５.９０％(１４/３９)ꎬ且碳青霉烯类敏感株与碳青霉烯类耐药株的Ⅰ类整合子分布比较差异有统计学意义(Ｐ<０.０１)ꎻ在Ⅰ类整合子阳性株中ꎬ５７.１４％(１２/２１)成功扩出可变区ꎬ其中碳青霉烯类敏感株可变区检出率为２.８２％(２/７１)ꎬ而碳青霉烯类耐药株可变区检出率为２５.６４％(１０/３９)ꎮ检出的碳青霉烯酶与Ⅰ类整合子的携带具有一定的相关性(ｒ＝０.５３０ꎬＰ<０.０１)ꎮ结论㊀Ⅰ类整合子是介导ＣＲＰＡ耐药的重要原因之一ꎬ铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药可能与整合子携带相关耐药基因有关ꎮ
关键词:铜绿假单胞菌ꎻ碳青霉烯酶ꎻⅠ类整合子
ＳｔｕｄｙｏｎＲｅｓｉｓｔａｎｃｅＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＣａｒｂａｐｅｎｅｍｓ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＡｅｒｕｇｉｎｏｓａａｎｄＩｔｓＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈＣｌａｓｓⅠＩｎｔｅｇｒｏｎ
ＹＡＮＧＸｕｅｊｉａｏ１ꎬＹＡＮＧＨｕａｎ１ꎬＪＩＡＯＦａｎｇｙａｎ１ꎬ２ａꎬＹＩＮＴｉｅｑｉｕ１ꎬ２ｂ
１.ＳｃｈｏｏｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＨｕｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＣｈａｎｇｓｈａ４１０００７ꎬＣｈｉｎａꎻ２ａ.ＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｅｎｔｅｒꎬ２ｂ.ＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙꎬＢｒａｉｎＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＨｕｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅꎬＣｈａｎｇｓｈａ４１０００７ꎬＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ:ＹＩＮＴｉｅｑｉｕꎬＥｍａｉｌ:ｙｔｑｓｔａｒ＠１６３.ｃｏｍ
Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀Ｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｃａｒｂａｐｅｎｅｍｓ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ(ＣＲＰＡ)ꎬａｎｄｉｔｓｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｃｌａｓｓⅠｉｎｔｅｇｒｏｎ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀１１０ｓｔｒａｉｎｓｏｆｎｏｎ￣ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＨｕｎａｎＢｒａｉｎＨｏｓｐｉｔａｌｆｒｏｍＯｃｔ.２０１８ｔｏＦｅｂ.２０１９ｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｆｏｒｂａｃｔｅｒｉａｌｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｄｒｕｇｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔꎻａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｓｏｆＡｍｅｒｉｃａｎＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｔａｎｄａｒｄｓꎬｍｏｄｉｆｉｅｄｃａｒｂａｐｅｎｅｍｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ
(ｍＣＩＭ)ａｎｄｍｏｄｉｆｉｅｄＨｏｄｇｅｍｅｔｈｏｄｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅꎻｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｃｌａｓｓⅠｉｎｔｅｇｒｏｎａｎｄｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀Ａｍｏｎｇｔｈｅ３９ＣＲＰＡｉｓｏｌａｔｅｓꎬ１５.３８％(６/３９)ｏｆｔｈｅｍｗｅｒｅｐｏｓｉｔｉｖｅｂｙｍＣＩＭａｎｄｍｏｄｉｆｉｅｄＨｏｄｇｅｔｅｓｔꎬｏｎｅｗａｓｐｏｓｉｔｉｖｅｏｎｌｙｂｙｍＣＩＭꎻＴｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｃｌａｓｓⅠｉｎｔｅｇｒｏｎｓｏｆｃａｒｂａｐｅｎｅｍｓ￣ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｓｔｒａｉｎｓｗａｓ９.８６％(７/７１)ꎬｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｃｌａｓｓⅠｉｎｔｅｇｒｏｎｓｏｆｃａｒｂａｐｅｎｅｍｓ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｔｒａｉｎｓｗａｓ３５.９０％(１４/３９)ꎬａｎｄｔｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｃｌａｓｓⅠｉｎｔｅｇｒｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎｃａｒｂａｐｅｎｅｍｓ￣ｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｃａｒｂａｐｅｎｅｍｓ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｔｒａｉｎｓｗａｓ
ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ(Ｐ<０.０１).ＡｍｏｎｇｔｈｅｃｌａｓｓＩｉｎｔｅｇｒｏｎｐｏｓｉｔｉｖｅｓｔｒａｉｎｓꎬ５７.１４％(１２/２１)ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｅｘｐａｎｄｅｄｔｈｅ
ｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎꎬａｍｏｎｇｗｈｉｃｈｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｔｈｅｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅｃａｒｂａｐｅｎｅｍｓ￣ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｓｔｒａｉｎｓｗａｓ２.８２％(２/７１)ꎬｗｈｉｌｅｔｈａｔｏｆｔｈｅｃａｒｂａｐｅｎｅｍｓ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｔｒａｉｎｓｗａｓ２５.６４％(１０/３９).Ｔｈｅｒｅｗａｓａｃｅｒｔａｉｎｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅ
ｄｅｔｅｃｔｅｄａｎｄｃｌａｓｓⅠｉｎｔｅｇｒｏｎ(ｒ＝０.５３０ꎬＰ<０.０１).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＣｌａｓｓⅠｉｎｔｅｇｒｏｎｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｅａｓｏｎｓｏｆｍｅｄｉａｔｉｎｇＣＲＰＡｒｅｓｉｓｔａｎｃｅꎬｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｔｏｃａｒｂａｐｅｎｅｍｓｍａｙｂｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｃａｒｒｙｉｎｇｏｆｒｅｌａｔｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅｓｏｆｉｎｔｅｇｒｏｎｓ.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａꎻＣａｒｂａｐｅｎａｓｅꎻＣｌａｓｓⅠｉｎｔｅｇｒｏｎ
㊀㊀铜绿假单胞菌是一种常见的机会致病菌ꎬ是引起免疫力低下患者细菌感染的常见病原体ꎬ由于碳青霉烯类抗菌药物的临床广泛使用ꎬ该类药物耐药株不断增加ꎬ导致铜绿假单胞菌感染易反复发作ꎬ且难以控制[１￣２]ꎮ铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物发生耐药的原因多样ꎬ产碳青霉烯酶是最常见的原因之一[３]ꎮ酶基因易被可移动元件携带ꎬ进而造成耐药因子的播散ꎮ
近年来ꎬ越来越多的研究发现ꎬ整合子在介导铜绿假单胞菌从单一耐药向多重耐药转变过程中发挥了重要作用[４￣６]ꎮ整合子是一种可移动遗传元件ꎬ存在于细菌染色体或质粒中ꎬ可以捕获多种耐药基因ꎬ使细菌耐药性在同种细菌或异种菌属间发生水平转移ꎬ使细菌具有多重耐药性[７￣１０]ꎮ在目前已经发现的６种类型耐药整合子中ꎬ由于Ⅰ类整合子携带耐药基因盒种类多㊁宿主广泛ꎬ故成为引起细菌间耐药性播散的重要原因之一[１１￣１２]ꎮ故本研究以亚胺培南/美罗培南耐药的铜绿假单胞菌为研究对象ꎬ依据美国临床和实验室标准协会(ＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｔａｎｄａｒｄｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＣＬＳＩ)标准检测碳青霉烯酶ꎬ探讨铜绿假单胞菌与Ⅰ类整合子的相关性ꎬ现报道如下ꎮ１㊀资料与方法
１.１㊀菌株来源及鉴定㊀选取２０１８年１０月至２０１９年２月湖南省脑科医院临床分离的１１０株非重复铜绿假单胞菌ꎮ入组菌株经全自动细菌鉴定仪鉴定ꎬ根据ＣＬＳＩ２０１８版标准[１３]中亚胺培南或美罗培南的最低抑菌浓度判断药敏检测结果ꎬ其中最低抑菌浓度ȡ８μｇ/ｍＬꎬ判定为碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌(Ｃａｒｂａｐｅｎｅ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａꎬＣＲＰＡ)ꎻ最低抑菌浓度ɤ２μｇ/ｍＬꎬ判定为碳青霉烯类敏感铜绿假单胞菌ꎮ质控菌株为标准菌株ＡＴＣＣ２７８５３和ＡＴＣＣ２５９２２ꎬ均选自卫生部门临床检验中心ꎮ
１.２㊀仪器与试剂㊀实验仪器包括全自动细菌鉴定仪(法国梅里埃公司ꎬ型号:ＶＩＴＥＫ￣２ｃｏｍｐａｃｔ)ꎻＪＵＮＹＩ电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司ꎬ型号:ＪＹ６００Ｃ)ꎻ凝胶成像仪(美国柯达公司ꎬ型号:ＧｅｌＬｏｇｉｃ２１２)ꎻ超微量分光光度计(美国赛默飞世尔科技有限公司ꎬ型号:ＮａｎｏＤｒｏｐＬｉｔｅ)ꎮ试剂包括美罗培南药敏纸片(英国Ｏｘｏｉｄ公司ꎬ批号:２４０８０７５)ꎻ细菌ＤＮＡ提取试剂盒(美国Ｏｍｅｇａ公司ꎬ批号:００Ｄ３３５００１００００Ｇ２０Ｒ０７９)ꎻＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ试剂盒(日本ＴａＫａＲａ公司ꎬ批号:ＡＩ５１２３９Ａ)ꎻ１００ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ(北京Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司)ꎻ引物由上海生工及湖南擎科公司合成ꎮ
１.３㊀方法
１.３.１㊀碳青霉烯酶的检测㊀①改良Ｈｏｄｇｅ法:依据２０１７年ＣＬＳＩ标准[１４]ꎬ首先调制０.５麦氏浊度大肠埃希菌ＡＴＣＣ２５９２２的菌悬液ꎬ按１ʒ１０稀释ꎻ然后按照纸片扩散法步骤将稀释后菌液涂布于ＭＨ平板上ꎬ干燥３~１０ｍｉｎ后贴美罗培南纸片ꎬ最后将待测菌垂直于药敏纸片ꎬ从纸片边缘向平板边缘划线(２０~２５ｍｍ)ꎬ在３５ħ条件下孵育１６~２０ｈꎮ结果判读标准为待测菌在抑菌圈内呈现矢状生长者为阳性ꎮ②改良碳青霉烯灭活法(ｍｏｄｉｆｉｅｄｃａｒｂａｐｅｎｅｍｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄꎬｍＣＩＭ):依据２０１９年ＣＬＳＩ标准[１５]ꎬ用１０μＬ接种环将满环过夜生长待测菌落接种于２ｍＬ胰蛋白胨大豆肉汤中ꎬ充分涡旋振荡１０~１５ｓ后ꎬ向每支试管中加入一片含１０μｇ美罗培南的无菌纸片ꎬ在３５ħ条件下孵育４ｈꎮ孵育即将结束时ꎬ立即调制０.５麦氏浊度ＡＴＣＣ２５９２２菌悬液ꎬ菌悬液制备后必须在１５ｍｉｎ内涂布于ＭＨ平板上ꎬ干燥３~１０ｍｉｎꎻ将美罗培南纸片从胰蛋白胨大豆肉汤中取出ꎬ控干多余液体后贴在已涂布ＡＴＣＣ２５９２２的ＭＨ平板上ꎬ随后在３５ħ条件下孵育１８~２４ｈꎮ结果判读标准如下ꎮａ.碳青霉烯酶阳性:没有抑菌圈或抑菌圈直径６~１５ｍｍꎬ或抑菌圈直径１６~１８ｍｍꎬ但抑菌圈内有散在菌落ꎻｂ.碳青霉烯酶阴性:抑菌圈直径ȡ１９ｍｍꎻｃ.碳青霉烯酶中性:抑菌圈直径为１６~１８ｍｍꎬ或抑菌圈直径ȡ１９ｍｍꎬ但抑菌圈内有散在菌落ꎬ无法判定是否产生碳青霉烯酶ꎮ
１.３.２㊀Ⅰ类整合子的检测㊀采用聚合酶链反应(ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎꎬＰＣＲ)技术检测Ⅰ类整合子ꎮ
①制备ＤＮＡ模板ꎮ参考提取细菌ＤＮＡ试剂说明书提取细菌ＤＮＡꎬ使用超微量分光光度计检测模板纯度ꎬＡ２６０/Ａ２８０在１.７~１.９ꎬ于－２０ħ冰箱中保存备用ꎮ②扩增整合酶基因ꎮＰＣＲ反应体系为２５μＬꎬＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ１２.５μＬꎬ模板ＤＮＡ０.７μＬꎬ上下游引物各０.８μＬ(引物序列见表１[１６])ꎬＲＮａｓｅＦｒｅｅｄｄＨ２Ｏ１０.２μＬꎻ配置反应体系在冰上进行ꎬ以减少核酸降解ꎮ反应条件:９５ħ预变性５ｍｉｎꎬ９５ħ变性３０ｓꎬ
５２.５ħ退火３０ｓꎬ７２ħ延伸１ｍｉｎꎬ共３５个循环ꎬ７２ħ延伸１０ｍｉｎꎮ扩增后产物经１.５％琼脂糖凝胶在１００Ｖ恒压下电泳３０ｍｉｎꎬ经凝胶成像仪扫描后观察结果ꎮ
表１㊀Ⅰ类整合子及可变区引物序列[１６]
引物名称引物序列５ᶄ￣３ᶄ
产物(ｂｐ)Ⅰ类整合子(Ｆ)
ＧＣＡＴＣＣＴＣＧＧＴＴＴＴＣＴＣＧ
４５７Ⅰ类整合子(Ｒ)ＧＧＴＧＴＧＧＣＧＧＧＣＴＴＣＧＴＧ可变区(Ｆ)ＧＧＣＡＴＣＣＡＡＧＣＡＧＣＡＡＧＣｖａｒｉａｂｌｅ
可变区(Ｒ)ＡＡＧＣＧＡＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＡＴ
１.３.３㊀可变区的检测㊀可变区ＰＣＲ反应体系为２５μＬ:ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ１２.５μＬꎬ上述Ⅰ类整合子阳性菌株的基因组ＤＮＡ为模板ＤＮＡ０.７μＬꎬ上下游引物各０.８μＬꎬＲＮａｓｅＦｒｅｅｄｄＨ２Ｏ１０.２μＬꎻ配置反应体系在冰上进行ꎬ以减少核酸降解ꎮ反应条件:
９５ħ预变性５ｍｉｎꎬ９５ħ变性３０ｓꎬ５８ħ退火３０ｓꎬ
７２ħ延伸６０ｓꎬ共３５个循环ꎬ７２ħ延伸１０ｍｉｎꎮ扩增后产物经１.５％琼脂糖凝胶在１００Ｖ恒压下电泳５０ｍｉｎꎬ经凝胶成像仪扫描后观察结果ꎮ
１.４㊀统计学方法㊀采用ＳＰＳＳ２２.０统计软件进行数据处理ꎬ计数资料比较采用χ２检验ꎬ相关性计算列联系数ꎬＰ<０.０５为差异有统计学意义ꎮ２㊀结㊀果
２.１㊀碳青霉烯酶检测结果㊀１１０株临床分离的铜绿假单胞菌中ꎬ经ＶＩＴＥＫ￣２ｃｏｍｐａｃｔ细菌鉴定仪以及药敏试验检出ＣＲＰＡ３９株ꎬ其中１５.３８％(６/３９)表现为ｍＣＩＭ法和改良Ｈｏｄｇｅ试验同步阳性ꎬ仅
１株表现为ｍＣＩＭ法阳性ꎬ部分实验结果见图１ꎮ２.２㊀Ⅰ类整合子检测结果㊀Ⅰ类整合子检出率为１９.０９％(２１/１１０)ꎬ其中碳青霉烯类敏感株Ⅰ类整合子的检出率为９.８６％(７/７１)ꎬ耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌Ⅰ类整合子的检出率为３５.９０％(１４/３９)ꎬ差异有统计学意义(χ２＝１１.０４９ꎬＰ＝０.００２)ꎬ见表２ꎮＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳Ⅰ类整合子的扩增产物为４５７ｂｐ左右ꎬ与目的条带大小一致ꎬ见图２ꎮ
２.３㊀ＰＣＲ检测可变区㊀以检出的２１株Ⅰ类整合子阳性菌株基因组ＤＮＡ为模板扩增可变区ꎬ结果显示ꎬ５７.１４％(１２/２１)可变区成功扩增ꎬ可变区片段长度为８００~４５００ｂｐꎬ大小不等ꎬ见图３ꎬ其中碳青霉烯类敏感株可变区检出率为２.８２％(２/７１)ꎬ而碳青霉烯类耐药株可变区检出率为２５.６４％(１０/３９)ꎬ差异有统计学意义(χ２＝１３.４９３ꎬＰ<０.
０１)ꎮ
ｍＣＩＭ:改良碳青霉烯灭活法ꎻＣＲＰＡ:耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌ꎻ２㊁６㊁８㊁１６㊁１８㊁２０为菌株编号ꎬ其中２㊁１６为ｍＣＩＭ法和改良Ｈｏｄｇｅ试验阳性
图１㊀ＣＲＰＡ碳青霉烯酶检测结果
表２㊀Ⅰ类整合子在碳青霉烯耐药组与碳青霉烯
敏感组中的分布差异
(株)菌株类型Ⅰ类整合子
＋
－
合计碳青霉烯耐药１４２５３９碳青霉烯敏感
７６４７１合计
２１
８９
１１０
ＰＣＲ:聚合酶链反应ꎻＭ:标志物Ｍａｒｋｅｒꎻ－:阴性对照ꎻ＋:阳性对照ꎻ
２㊁１６㊁２０㊁２３为菌株编号
图２㊀Ⅰ类整合子ＰＣＲ
产物电泳图
ＰＣＲ:聚合酶链反应ꎻＭ:标志物Ｍａｒｋｅｒꎻ－:阴性对照ꎻ２０㊁２３㊁４１㊁５６㊁
６７㊁７１㊁８１㊁８７㊁８８㊁９０㊁９３㊁１１５㊁２７３㊁２８３为可变区阳性株
图３㊀Ⅰ类整合子阳性株可变区ＰＣＲ产物电泳图
２.４㊀Ⅰ类整合子与碳青霉烯酶的关系㊀在３９株ＣＲＰＡ中ꎬ７株检出碳青霉烯酶铜绿假单胞菌ꎬ且均携带Ⅰ类整合子ꎬ碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌产碳青霉烯酶与Ⅰ类整合子的携带具有一定相关性(ｒ＝
０.５３０ꎬＰ<０.０１)ꎬ见表３ꎮ
表３㊀３９株ＣＲＰＡ中Ⅰ类整合子与产碳青霉烯酶
菌株的分布情况
(株)
碳青霉烯酶
Ⅰ类整合子
＋
－
合计＋７０
７
－
７
２５３２合计１４
２５
３９
㊀㊀ＣＲＰＡ:耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌
３㊀讨㊀论
铜绿假单胞菌是医院感染的主要病原菌之一ꎬ常引起皮肤黏膜㊁呼吸道㊁泌尿道等感染ꎮ碳青霉烯类药物是临床治疗铜绿假单胞菌感染的常用抗菌药物ꎬ具有抗菌谱广㊁抗菌活性强的特点[１７]ꎬ但随着碳青霉烯类药物的广泛应用ꎬ铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物的敏感性不断下降ꎮ据２０１７年全国细菌耐药监测网统计ꎬ在革兰阴性菌分离榜中ꎬ铜绿假单胞菌感染居第三位ꎬ其对碳青霉烯类药物的耐药率平均为２０.７％[１８]ꎮ本研究中ꎬＣＲＰＡ的检出率为
３５.４５％ꎬ提示湖南省脑科医院铜绿假单胞菌的感染形势依然严峻ꎬ故需严密监测和减少铜绿假单胞菌感染ꎬ以避免铜绿假单胞菌的院内大规模感染ꎮ因此ꎬ探讨不同地区ＣＲＰＡ耐药性及整合子耐药基因的表达ꎬ并分析其耐药机制ꎬ以指导临床科学用药和控制院内感染[１９￣２１]ꎮＣＲＰＡ的耐药机制主要包括产生碳青霉烯酶㊁孔蛋白突变㊁ＭｅｘＡ￣ＭｅｘＢ￣ＯｐｒＭ外排泵超表达等ꎬ其中碳青霉烯酶的产生是ＣＲＰＡ耐药的重要原因之一[２２￣２３]ꎮ本研究结果显示ꎬ１７.９５％(７/３９)临床分离的ＣＲＰＡ为产碳青霉烯酶ꎬ说明碳青霉烯酶是导致湖南省脑科医院铜绿假单胞菌对碳
青霉烯类药物耐药的原因之一ꎮ
铜绿假单胞菌的耐药机制复杂ꎬ整合子作为一种可移动的遗传元件ꎬ是介导细菌耐药的重要因素之一ꎮ有研究显示ꎬ与未携带Ⅰ类整合子菌株相比ꎬ携带Ⅰ类整合子菌株对多数抗生素的耐药率较高ꎬ提示Ⅰ类整合子在铜绿假单胞菌耐药形成中发挥着重要作用[２４]ꎮ本研究中ꎬⅠ类整合子在碳青霉烯类敏感株与碳青霉烯类耐药株的分布差异有统计学意
义ꎬⅠ类整合子的检出率为１９.０９％(２１/１１０)ꎬ与上述文献报道趋势一致ꎮ此外ꎬ本研究中ꎬ７株产碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌均携带了Ⅰ类整合子ꎬＣＲＰＡ产碳青霉烯酶与Ⅰ类整合子的携带具有一定相关性(Ｐ<０.０１)ꎬ提示湖南省脑科医院铜绿假单胞菌碳
青霉烯类耐药可能与Ⅰ类整合子携带相关耐药基因盒密切相关ꎻ有５７.１４％(１２/２１)的Ⅰ类整合子阳性菌株成功扩出可变区ꎬ且可变区片段均较大ꎬ多在
３０００~５０００ｂｐ附近ꎬ提示Ⅰ类整合子整合的耐药基因较多ꎬ可能携带除碳青霉烯酶以外的其他类型耐药基因盒ꎬ从而加速细菌耐药性的播散及流行ꎻ其中ꎬ９３号菌株存在两条独立条带ꎬ可能携带了不同
类型的整合子或不同的耐药基因盒ꎮ
本研究结果显示ꎬⅠ类整合子和碳青霉烯酶的携带在铜绿假单胞菌对碳青霉烯酶类耐药甚至多重耐药中发挥了重要作用ꎬ两者具有中度一致性ꎮ但本研究样本量较小ꎬ仍需进行大样本量各类整合子分析ꎬ通过基因测序技术分析可变区相关耐药基因盒的携带情况ꎬ从而进一步明确铜绿假单胞菌的耐药性机制ꎮ
综上所述ꎬ研究期间湖南省脑科医院铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药可能与Ⅰ类整合子携带相关耐药基因有关ꎮ应继续严格实施抗生素管理制度㊁加强院内感染监测ꎬ进一步完善整合子的相关研究ꎮ参考文献
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ｔｒｕｍｂｅｔａ￣ｌａｃｔａｍ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔＰｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓａｎｄＭｏｒｇａｎｅｌｌａｍｏｒ￣
ｇａｎｉｉｃｌｉｎｉｃａｌｉｓｏｌａｔｅｓｗｉｔｈｓｕｌ１￣ｔｙｐｅｃｌａｓｓ１ｉｎｔｅｇｒｏｎａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｉｎ
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收稿日期:２０１９￣０９￣２０㊀修回日期:２０２０￣０２￣２６㊀编辑:李瑾。