溶菌酶产生菌诱变选育的研究

溶菌酶产生菌诱变选育的研究
李晓清;于宏伟;郭润芳;贾英民
【摘要】采用紫外线、60 Coγ辐射对溶菌酶产生菌溶杆菌S2-6b进行诱变,通过初筛和平板复筛获得多株高产菌株,经多次摇瓶复筛表明,其中菌株UCo1产溶菌酶酶活力达8 148.60 U/mL,其平均酶活力比出发菌株提高了50%以上.连续传l0代,产酶活力稳定.%With ultraviolet ray and 60Co γ ray as the mutation agency radiating lysozyme-prod-ucting strain dissolving bacteriair s2-6b, many high production activity strains were obtained by the first screening and flat re-screening. The result of many fermentation re-screening in shake flask showed that the enzyme activity of strain Ucol was 8 148. 60 U/mL and the average production of lysozyme was increased by more than 50%. The enzyme activity remained steady after 10 continuous subcultures.【期刊名称】《河北农业大学学报》
【年(卷),期】2011(034)004
【总页数】6页(P69-74)
【关键词】溶菌酶;60C0γ射线;紫外线;突变株
【作者】李晓清;于宏伟;郭润芳;贾英民
【作者单位】河北农业大学食品科技学院,河北保定071000;河北农业大学食品科技学院,河北保定071000;河北农业大学食品科技学院,河北保定071000;河北科技大学生物科学与工程学院,河北石家庄050000
【正文语种】中文
【中图分类】Q814
溶菌酶(Lysozyme,LYZ),其化学名称为N-乙酰胞壁质聚糖水解酶,按照对肽聚糖作
用位点的差异,溶菌酶可分为作用于聚糖链的胞壁质酶(M uramidase)、作用于肽
桥的内肽酶(Endopep-tidase)以及作用于连接聚糖链与肽桥间酰胺键的N-乙酰-
L-丙氨酸酰胺酶[1](N-acety lmuramoy l L-alanine am idase)。

破坏肽聚糖支架,在内部渗透压的作用下细胞胀裂开,引起细菌裂解[2-3]。

溶菌酶作为动物自身的一
种非特异性免疫因子,以其广谱高效的杀菌、无残留、无污染的特性吸引众多研究
者的视线。

溶菌酶在食品防腐、医药、生物工程和畜禽饲料中应用非常广泛,是当前国内外市
场中非常紧俏的一种生化产品。

目前,在我国境内销售的产品主要是鸡蛋清溶菌酶。

黑龙江、辽宁、天津、北京、河北、山西、山东、湖南、湖北、江苏等地均有溶菌酶原料的生产。

但据调查,这些企业中多数生产能力有限,年产量不足吨级,而且有些厂家的产品质量也难以保证,主要表现为产品生物活性低。

对微生物产生溶菌酶的
研究,始于上个世纪中期。

研究较多的有拟内串生孢霉(Chalarosis)、球孢链霉菌(Streptom yces g lobisporus)、丙酮丁酸梭菌(C lostridium acetobuty licum)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)以及几种细菌噬菌
体等产生的溶菌酶[2-3]。

其中,国内对于微生物来源的溶菌酶研究较少,主要集中在链霉菌属和芽孢杆菌属。

但所研究菌株产酶能力低,无法达到应用要求。

为此,本试
验在本实验室已筛选的产溶菌酶野生菌株溶杆菌S2-6b基础上,利用紫外线和γ射线诱变,以期提高其产酶活力。

1.1.1 菌种①溶杆菌S2-6b(Lysobacter S2-6b):由本实验室从土壤中筛选所得并
保存;
②金黄色葡萄球菌(Staphy loccocus aureus Rosenbach):由河北农业大学食品科技学院酶工程实验室保存;
③溶壁微球菌(M icrococcus lysodeikticus)冻干粉购自Sigma公司。

1.1.2 培养基①指示菌培养基、初筛培养基及菌株的保存培养基均为营养琼脂:蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,氯化钠 5 g,琼脂 15～20 g,蒸馏水1 000 m L。

pH 至7.2～
7.4,121℃灭菌20min。

②划线纯化培养基:1.0%蛋白胨,0.5%牛肉膏,1%NaCl,1.5%～2.0%琼脂。

pH值调至7.2～7.4,121℃灭菌20min。

③基础培养基:1.0%蛋白胨,0.5%牛肉膏,1%NaCl。

pH值调至7.2～7.4,121℃灭菌20m in。

④驯化及摇瓶发酵产酶培养基:1.25%可溶性淀粉,2.5%牛肉膏,1.0%玉米
浆,0.1%Tween-80,pH值调至7.0,121℃灭菌20 min。

1.1.3 诱变剂紫外线,60 Co-γ射线(北京师范大学,化学系钴源室)。

1.2.1 菌株生长曲线的测定采用浊度法,菌液适当稀释后,每隔2 h测定其600 nm 处的吸光值。

1.2.2 紫外诱变方法[4-5] ①菌悬液的制备。

将出发菌株S2-6b接种于装有种子培养基的锥形瓶中(40 m L/300m L),28℃振荡培养到对数生长期,取1.1 m L于1.5 m L离心管离心,用灭菌的生理盐水洗菌3次,取其 1 m L将其配制成浓度为
1×108 CFU/m L菌悬液。

②诱变步骤。

取5个直径为6 cm的培养皿,事先进行灭菌,每平皿加入5 m L菌液,在磁力搅拌子搅拌状态下,选用18W 的紫外灯,照射距离为28 cm,照射时间分别为10 、15、20 、25、30 s。

将诱变后的菌液再稀释至10-5、10-6,取100μL涂平板,每个稀释度3个平行。

将原液稀释至10-7、10-8作为对照,每个稀释度3个平行。

用黑布包好,28℃培养3 d,计算致死率。

1.2.3 60 Coγ射线诱变[7] ①菌悬液的制备。

紫外线诱变后筛选出的产溶菌酶活性最大的突变菌株接种于装有基础培养基的锥形瓶中(40 m L/300 m L),28℃振荡培
养24 h,各取10m L菌液,装于已灭过菌的试管里。

②60 Coγ射线诱变步骤。

将 25、50、100、200、400、600和1 200Gy等不同的辐射剂量进行照射处理。

将每个处理取出1 m L进行系列梯度稀释,分别取0.1
m L涂布基础培养基平板,28℃培养3 d。

1.2.4 筛选①初筛。

以金黄色葡萄球菌为指示菌,采用混菌方法制成筛选平板,备用。

将基础培养基分离的诱变后的单菌落,用点样法点到初筛平板上,28℃培养24 h,挑
取每个初筛平板上水解圈直径与菌落直径比值相对最大的突变菌株。

②平板复筛。

将初筛所得的优质菌株在纯化培养基上进行平板划线,于28℃培养3 d,待长出单菌落,进行打孔试验,将所得的菌块放入已备好的平板中(用蒸馏水浸泡滤纸,然后放进培养皿中灭菌)3个平行,28℃培养过夜。

再将菌块放入初筛平板中28℃培养过夜,选取水解圈直径最大的菌株。

③发酵摇瓶复筛:将初筛选出的产酶活力较高的菌落接种到驯化培养基中,28℃培养
24 h,然后以3%的接种量接种于发酵培养中,28℃、200 r/min摇床培养,在40、44、48和52 h分别取发酵液,于8 000 r/min离心15 min,离心上清液作为粗酶液,测定酶活。

根据产酶活力,确定筛选菌株。

1.2.5 死亡率的计算方法[8]
1.2.6 溶菌酶活力测定方法采用浊度法[9-10],用0.1mol/L、pH 7.0的巴比妥缓冲液配制一定浊度(OD450 nm=1.0～1.1)的溶壁微球菌菌悬液。

取2 m L适当稀释的发酵液加入6 m L溶壁微球菌悬液中。

对照为经沸水浴15min灭活的酶。

75℃保温15 min,在450 nm分别测定反应前后吸光值(A)。

酶活力单位定义为:上述条
件下,每m in反应体系吸光值降低0.001所需的酶量为一个活力单位(U)。

其中ACK15min,D为稀释倍数,T为反应时间(min)。

测定溶菌酶活力,根据产酶活
力,确定筛选菌株。

2.1.1 紫外诱变致死率用紫外线对处于对数生长期的出发菌株S2-6b的菌悬液诱变,考察诱变时间与菌株致死率的关系,结果见图1。

由图1可知,该菌株对紫外线照射比较敏感,随着紫外线照射时间的延长,在10、15
和20 s照射时间时,致死率分别为 76.34%、83.80%、95.36%,上升较快。

照射时间约为25、30 s时,菌体几乎全部死亡。

一般而言,紫外照射的致死率在75%～85%时,高产菌株诱变效果较好,但对于未经过诱变处理的野生菌,则可采用较高的剂量处理效果较好,综合考虑,以提高菌种的突变率为目的,选择紫外照射15 s作为诱变剂量。

2.1.2 初筛将诱变后的菌落培养至长出单菌落,用灭过菌的牙签将这些菌落点接于
筛选平板上,28℃培养20 h左右,选取在每个筛选平板上圈径比最大的菌株进入平
板复筛。

初筛结果如图2。

图2作为初筛结果中的一个,计算圈径比(即H/C值),编号为2的菌株为该初筛平板上圈径比最大的菌株,将其保存,共筛选到300株菌。

将所得的这些菌株进行平板复筛。

同时,初筛采用点样法,较以往常用的平板涂布法,可以极大的缩短了初筛时间。

2.1.3 平板复筛将由初筛所得到的每个平板上最好的菌株进行平板复筛,即琼脂块法,每株菌做3个平行,28℃培养过夜,结果如图3所示。

选择透明圈比出发菌株大
且稳定(即3个平行的透明圈都大)的菌株,图中编号6的为出发菌株S2-6b,第一批
编号为39的菌株符合要求,将其保存。

将透明圈直径大于出发菌株的诱变菌的值求平均数记录,结果见表1。

表1可见,绝大多数的菌所产透明圈大于出发菌株,所以,初筛的效果明显。

经平板复筛获得50株较好的菌株,准备进行摇瓶复筛。

2.1.4 摇瓶复筛经过大量的初筛和平板复筛,将所得到的50株菌株进行摇瓶复筛,测定菌种发酵40、44、48、52 h时的产酶活力,将出发菌株S2-6b最高产酶活力作
为100%,各菌株的酶活力以相对酶活力表示,结果见表2。

表2显示,出发菌株产酶活力峰值在40 h,与该菌株的最大酶活力相符。

诱变后的各菌株相对酶活力的峰值不尽相同,经比较,通过紫外线诱变得到高产菌株 U11-2,其产酶活力提高12.4%,该菌株经连续传代后产酶活力稳定,将其保存并作为60 Coγ射线诱变的出发菌株。

2.2.1 60 Coγ射线诱变剂量的选择紫外线诱变得到高产菌株U11-2,用60 Coγ射线对其进行诱变,考察诱变时间与菌株致死率的关系,见图4。

由图4看出,随着60 Coγ射线辐照时间的延长,在辐照计量为25 、50 、100、200 Gy时,致死率分别为 77.10%、90.00%、92.30%、97.50%。

辐照计量为400、800、1 200 Gy时,细菌几乎全部死亡。

据报道,出发菌株为经过诱变所得到的菌株,其致死率在75%～85%时,较易获得稳定的高产诱变菌[11]。

所以,本试验确定的诱变剂量为25Gy。

2.2.2 60 Coγ射线诱变突变菌株筛选采用与紫外诱变同样的初筛和平板复筛方法,得到39株产酶活力较高的菌株,对其进行摇瓶复筛,将有代表性的16株菌初筛结果(采用透明圈与菌落的比值即H/C值)、平板复筛结果平均值和摇瓶复筛产酶活力记录,结果见表3。

表3可见,菌株溶菌酶活力与H/C值大小不成正相关,有的菌株溶菌酶活力并不高,但H/C值却比较高,如 1-5、4-5、4-51等,同理,平板复筛类似,所以,H/C值和平板复筛只能作为一个初步筛选指标,真正确定产酶能力只能通过发酵培养采用比浊法测活。

经过发酵培养发现:有3株菌株4-8、6-8和5-6(即UCo1)产酶活性均比原始菌株产酶酶活显著提高。

最后,获得一株酶活力提高51.0%高产菌株5-6(即UCo1),将其编号为UCo1。

将出发菌株产酶活力设为100%,诱变谱系及酶活提高情况如下:
2.2.3 UCo1的遗传稳定性为了观察溶菌酶突变株UCo1的遗传稳定性,进行了菌
种传代产酶性能试验。

将突变株UCo1连续传代10次后,测其溶菌酶活力。

由表4可以看出,突变株UCo1产溶菌酶活力与传代前所得的菌株产溶菌酶活力相比无显著差异,表明突变株UCo1遗传性质稳定。

对溶菌酶进行酶活测定时,所采用的计算公式目前有多种,在多次测酶活的试验过程中,发现灭活后的酶代替反映体系中的未失活的酶,其他条件不变,水浴反应15min 后,吸光值均有减少,即ΔACK一般会是正值,分析其原因,可能是底物溶壁微球菌的自然沉降造成的。

所以,为了消除这个原因所产生的吸光值变化,本试验采用未灭活酶反应前后吸光值(ΔA)减去灭活的(ΔACK),代入公式,用这种方法计算酶活则更为科学。

为了开发新的溶菌酶资源,降低生产成本,促进其在实践中的应用。

对本实验室已筛选到的菌株进行诱变,对于诱变途径,目前有2种:一是通过常规的微生物育种技术来提高酶活力;另一种是利用基因工程技术,克隆耐热酶基因并高效表达[12]。

常规育种技术简便易行,科研实践中较为常用,它能使酶活得以增加。

目前,主要采用诱变育种,包括紫外线照射、低能离子注入、亚硝基胍处理诱变育种技术。

本试验将紫外线和60 Co-γ射线结合使用,诱变效果较好,其酶活力在出发菌株基础上提高了51.5%。

关于诱变方法,本试验参考微波诱变方法[13],经多次试验,没有明显的致死率,表明该出发菌株(属于溶杆菌)对微波诱变不敏感。

然后将紫外线和60 Coγ射线进行诱变,通过酶活测定结果观察,效果较好于单独使用紫外诱变。

另外关于筛选方法,本试验曾经采用过多种方法如钝化指示菌法、混菌法培养诱变菌株再涂布指示菌的方法、低硬度平板初筛法、YoshimotoT等[14]和谢群英等[15]所采用过的双层平板法等不同方法,这些方法在该试验应用的结果不佳,都在15 d以上才可以观察到较明显的现象。

其原因可能是指示菌与目的菌共同培养,形成竞争,从而推迟甚至抑制透明圈的产生。

采用影印法,结果菌落不规则因素给本试验的筛选工作带来了困难。

而
金葡平板点样,移块初筛法进行初筛,时间短(12～24 h)并且效果较好。

此方法点样的菌形相对较为规则,但操作要规范以免菌形震散,打孔移块可使目的菌先长起来,从而防止金黄色葡萄球菌对目的菌的抑制。

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