分子生物复习加强版

分子生物复习加强版
分子生物学复习重点、
分子生物学
广义：从广义来讲，蛋白质及核酸等生物大分子结构和功能的研究都属于分子生物学的范畴，也就是从分子水平阐明生命现象和生物学规律。

例如，蛋白质的结构、运动和功能，酶的作用机理和动力学，膜蛋白结构与功能及跨膜运输等都属于分子生物学的研究内容。

狭义：从狭义上讲，分子生物学主要是研究生物体主要遗传物质-基因或DNA的结构及其复制、转录、表达和调节控制等过程的科学。

当然，也涉及到与这些过程有关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。

基因工程：指将一种或多种生物体(共体) 的基因或基因组提取出来, 或者人工合成的基因, 按照人们的愿望, 进行严密的设计, 经过体外加工重组, 通过一定的方法, 转移到另一种生物体(受体) 的细胞内, 使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。

分子生物学与基因工程发展简史：（主要考选
择题和判断题）
1944年，Avery在肺炎双球菌转化实验中证实了DNA是遗传的物质基础，标志着分子生物学的诞生；
1953年，Watson和Crick在Nature杂志（171：737～738）上提出了著名的DNA双螺旋模型，为分子生物学的发展奠定了坚实的基础；
1956年，Kornberg在大肠杆菌的无细胞提取液中实现了DNA的合成；
1958年，Crick提出了遗传信息的传递规律，即著名的“中心法则”；
同年，Meselson与Stahl 用实验证明了DNA复制是一种半保留复制；
1959年，Uchoa发现了细菌的多核苷酸磷酸化酶，成功地合成了RNA，研究并重建了将基因内的遗传信息通过RNA中间体翻译成蛋白质的过程；
1961年，Nirenberg和Matthaei破译了所有三联体密码子；
同年，法国科学家Jacob和Monod提出了著名的乳糖操纵子模型；
1962年，Arber首次发现DNA限制性内切酶
的存在；
1970年，Smith首次从大肠杆菌中分离到第一个限制性内切酶；同年，Temin和Baltimore首次发现在病毒中存在以RNA为模板，逆转录成DNA的逆转录酶；
1972年，Berg构建了世界上第一个重组DNA分子，开辟了生物学新领域-遗传工程；
1977年，Robert和Sharp在研究腺病毒的mRNA合成时，首次发现了断裂基因的存在；
1977年，Sanger和Gilbert分别提出了两种DNA测序技术-酶法（或双脱氧链终止法）和化学修饰法；
1981年，Cech和Altman首次发现RNA具有生物催化功能；
1983年，Mullis发明了聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，极大地推动了分子生物学的发展；
1990年，人类基因组计划启动，同时先后开展多种模式生物的基因组测序。

标志着生命科学研究进入“基因组学”时代；
1994年，Wilkins和Williams等首次提出了蛋白质组的概念；
1997年，Wilmut等首次成功地从体细胞中克隆出羊-Dolly；
到目前为止，人们已完成包括人和水稻等重要模式生物的基因组测序工作。

生命科学研究进入“蛋白质组学”的新的发展阶段。

分子生物学领域获得诺贝尔奖一览表
分子生物学与基因工程发展的五个个里程碑上个世纪50年代，Watson和Crick提出了的DNA双螺旋模型；
60年代，法国科学家Jacob和Monod提出了的乳糖操纵子模型；
70年代，Berg首先发现了DNA连接酶，并构建了世界上第一个重组DNA分子；
80年代，Mullis发明了聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术；
90年代，开展了“人类基因组计划”和模式生物的基因组测序，分子生物学进入“基因组时代”；
DNA：
核苷酸分子由三个部分组成：
碱基：嘧啶、嘌呤五碳糖：核糖或脱氧核糖磷酸
DNA双螺旋结构主要内容
（1）两条多核苷酸链以右手螺旋的形式彼此以一定的空间距离，平行地环绕于同一轴上；（2）两条多核苷酸链走向为反向平行，即一条链磷酸二酯键为5’－3’方向，而另一条为3’一5’方向，二者刚好相反；
（3）每条长链的内侧是扁平的盘状碱基，碱基一方面与脱氧核糖相联系，另一方面通过氢键与它互补的碱基相联系。

互补碱基对A与T之间形成两对氢键，而C与G之间形成三对氢键。

上下碱基对之间的距离为0.34nm；
（4）每个螺旋为3.4nm长，刚好含有10个碱基对，其直径约为2nm；
（5）在双螺旋分子的表面大沟和小沟交替出现。

维持双螺旋结构稳定性的力：
（1）氢键
（2）疏水作用-碱基堆集力
（3）范德华力
（4）磷酸基的负电荷静电斥力
（5）碱基分子内能
DNA的精细结构
（1）依赖于序列的B-DNA构象变化；
双螺旋的许多结构参数是随碱基序列的不同而在一定范围内变化的，这称为DNA的局部构象。

在DNA中，随碱基序列的不同而变化的参数有许多，其中重要的有螺旋扭转角、螺旋桨扭角、碱基对转动角等，此外碱基对间还会发生滑动。

（2）连续AT序列的构象；
（3）含错配碱基对的B-DNA；
（4）DNA的局部构象与DNA结合蛋白
各种酶（如DNA聚合酶、RNA聚合酶等）
调节蛋白（如CAP，Cro阻遏物等）
这些蛋白质与DNA的结合涉及到生物学中的一些基本问题，如遗传和个体发育等，因此，核
酸-蛋白质交互作用已成为分子生物学中的一个研究热点。

DNA的超螺旋结构
超螺旋结构是DNA高级结构的主要形式，可分为正超螺旋与负超螺旋两大类，他们在特殊情况下可以相互转变。

超螺旋DNA可采取两种拓扑学上相当的形式。

一种相当于双螺旋绕圆柱体旋转；另一种相当于双螺旋相互盘绕。

DNA结构的上述变化可以用数学式来表述：
L = T ＋W
L称为DNA的连接数，它是DNA的一股链绕另一股链盘绕的次数，它代表环型双螺旋DNA分子的拓扑特性。

在不发生链的断裂对．它是一常数。

例如，DNA原来的L为42，放松后为36。

在右手双螺旋中，L规定为正，T称为盘绕数，它代表DNA的一股链绕双螺旋轴所做的完整的旋转数。

对B-DNA而言，它等于DNA 的碱基数除以10（晶体中）。

W为超盘绕数，代表双螺旋轴在空间的转动数，T和W是可变的。

如环型DNA的L = 42，T = 42，故W = 0，即不存在超螺旋。

它螺旋轴处在同一平面中，分子处于松弛状态。

在保留一单链区的DNA分子中，L和T都为36，分子仍未形成超螺旋。

在超螺旋DNA中，L仍为36，若使T保持未松开前的42，W就成-6，即成为超盘绕6次的负超螺旋。

天然的DNA都呈负超螺旋，但在体外可得正超螺旋。

环形DNA分子会由超螺旋化而变得更为致密，它们在超离心中的沉降速度和在凝胶电泳中的迁移速度都增加，故超螺旋DNA可通过这两种方法来检测和分离。

现在，琼脂糖凝胶电泳已成为检测DNA超螺旋程度的一种最直接的方法。

它能够分离仅差一圈的超螺旋DNA。

超螺旋的生物学意义
B-DNA是一种能热力学上稳定的结构，超螺旋的引入就提高了它的能量水平。

DNA特定区域中超螺旋的增加有助于DNA的结构转化。

它推动着结构的转化以满足功能上的需要。

熔解温度Tm的含义及影响因素
Tm的含义：是指吸收值增加的中点。

影响因素：1）DNA序列中G + C的含量或比例含量越高，Tm值也越大（决定性因素）；
2）溶液的离子强度3）核酸分子的长度有关：核酸分子越长，Tm值越大
4）某些化学物质5）溶液pH值
DNA作为遗传物质的证据：
直接证据：肺炎链球菌试验、噬菌体侵染实验间接证据：1、DNA含量是恒定的；2、DNA在代谢上较稳定；（3）DNA是所有生物的染色体所共有；（4）DNA通常只存在于细胞核染色体上，但某些能自体复制的细胞器，如线粒体、叶绿体有其自己的DNA。

（5）在各类生物中能引起DNA结构改变的化学物质都可引起基因突变。

C值：单倍体基因组的DNA总量是恒定的。

C值悖理：C值与生物进化复杂性不相对应的现象。

真核生物基因组的特点：
真核生物基因组与原核生物的相比，主要有以下几方面的差异（特点）：
（1）分布部位
（2）基因特性
（3）遗传信息的传递过程
（4）自身的复制过程
染色体的结构特征：
染色体是由染色质（chromatin）构成的，染色质是由DNA、RNA和蛋白质形成的复合体。

染色体是动态的物体，其外观随细胞周期的不同阶段发生明显的改变。

仅当细胞分裂时，每个染色体才呈现出凝聚型
DNA变性：它是指当双螺旋DNA加热至生理温度以上（接近100ºC）时，它就失去生理活性。

这时DNA双股链间的氢键断裂，最后双股链完全分开并成为无规则线团的过程。

简而言之，就是DNA从双链变成单链的过程。

增色效应：它是指在DNA的变性过程中，它在260 nm的吸收值先是缓慢上升，到达某一温度后即骤然上升的效应。

DNA复性：它是指热变性的DNA如缓慢冷却，已分开的互补链又可能重新缔合成双螺旋的过程。

复性的速度与DNA的浓度有关，因为两互补序列间的配对决定于它们碰撞频率。

蛋白质的结构与功能
丙氨酸Ala A 精氨酸Arg R
天冬酰氨Asn N 天冬氨酸A sp D
半胱氨酸 Cys C 谷氨酰胺Gln Q
谷氨酸Glu E
甘氨酸Gly G 组氨酸
His H
异亮氨酸 Ile I 亮氨酸
Leu L
赖氨酸Lys K 甲硫氨酸Met M
苯丙氨酸 Phe F 脯氨酸
Pro P
丝氨酸Ser S 苏氨酸
Thr T
色氨酸Trp W 酪氨酸
Tyr Y
缬氨酸Val V
蛋白质二级结构：
它是指多肽链中主链原子的局部空间排布即构象，不涉及侧链部分的构象。

蛋白质主链构象的结构单元主要有α-螺旋、β-折迭、β-转角和无规则卷曲四种。

蛋白质的功能举例：
1）生命活动所需的许多小分子物质和离子的运输离不开蛋白质，如血红蛋白负责运输氧，铁传递蛋白负责运输铁等；
（2）细胞与外界环境以及细胞间的信息传递，依赖于处在细胞表面的或跨膜的蛋白质来实现。

总结：
DNA是携带遗传信息的载体，细胞分裂前，通过DNA的复制作用，遗传信息从亲代DNA 分子传递到子代DNA分子中。

DNA复制时，是从一个特定的起始点开始的，两条DNA链分别作模板，在DNA聚合酶等许多酶和蛋白质因子
的参与下，以四种脱氧单核苷酸dNTP为原料，依据碱基互补的原则合成新的DNA分子。

合成方向为5’到3’。

经过复制后DNA分子中，一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制；
由于DNA复制时，两条链分别作模板，有一条链是连续合成的，这条链称为前导链；而另一条链合成时，只能以5’3’先合成冈崎片段，然后利用DNA连接酶将各个片段连接起来形成随从链，所以，DNA的复制是半不连续合成。

DNA复制时，先由拓扑异构酶作用于DNA 双螺旋分子，使之松弛，然后由DNA解链酶作用，解开双链，此时在引发酶的作用下合成一段RNA作为引物，在DNA pol III的聚合作用下连续地合成前导链；随从链的合成依靠多种酶与蛋白质因子的参与：首先在引发酶的作用下合成RNA引物，然后在DNA pol III的聚合作用下合成DNA片段，它们共同形成冈崎片段。

RNA引物是靠DNA聚合酶I进行切割的，并由DNA 聚合酶I填补RNA引物切除后留下的空隙，最
后由DNA连接酶形成一条完整的链。

DNA复制的准确性很高，在原核生物中主要依靠DNA聚合酶I的外切活性来校正复制过程中的碱基错配，而真核生物则依靠DNA聚合酶来完成。

DNA复制的一般过程：
DNA双螺旋是由两条方向相反的单链组成，复制开始时，双链打开，形成一个复制叉(从打开的起点向一个方向形成)或一个复制泡(从打开的起点向两个方向形成) 。

两条单链分别做模板。

各自合成一条新的DNA链。

在以3′→5′方向的母链为模板时，复制合成出一条5′→3′方向的前导链，前导链的前进方向与复制叉打开方向是一致的，因此前导链的合成是连续进行的，而另一条母链DNA是5′→3′方向，它作为模板时，复制合成许多条5′→3′方向的短链，叫做随从链。

随从链的前进方向是与复制叉的打开方向相反的。

随从链只能先以片段的形式合成，这些片段就叫做冈崎片段，原核生物冈崎片段含有1000-2000核苷酸，真核生物一般10000
核苷酸。

最后再将多个冈崎片段连接成一条完整的链。

由于前导链的合成是连续进行的，而随从链的合成是不连续进行的，所以从总体上看DNA的复制是半不连续复制。

DNA复制的全部过程可以人为地分成三个阶段，第一个阶段为DNA复制的起始阶段，这个阶段包括起始点，复制方向以及引发体的形成；第二阶段为DNA链的延长，包括前导链及随从链的形成和切除RNA引物后填补空缺及连接冈崎片段；第三阶段为DNA复制的终止阶段。

在DNA复制的整个过程中需要30多种酶及蛋白质分子参加。

大肠杆菌复制过程图
DDRP与DDDP的区别
相同：1）都需要DNA做模版；2）条件：Mg2+ Mn2+ ：3）聚合原则：碱基互补原则；
45’3‘5）聚合结果：3，5磷酸二酯键。

不同：
DDRP DDDP
模版，单链DNA 双链DNA
原料：NTP dNTP
引物：需要不需要
原则：A—U A—T
产物: RNA DNA
转录的一般过程：识别起始（6步走）；延长：终止。

水解酶
工具酶合成酶
修饰酶
PCR全称：聚合酶链式反应
定义：在试管中，利用DNA聚合酶、一对引物和四种dNTP，对模板DNA反复多次地进行复制，从而得到大量扩增特定产物的反应过
程，称为PCR
PCR技术的基本原理：
模拟DNA的天然复制过程，由变性－复性－延伸三个基本反应步骤构成：
根据目的DNA片段两端的碱基序列，合成两个不同的寡聚核苷酸引物，它们分别与DNA的两条链互补配对
将适量的寡聚核苷酸引物与4种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、DNA聚合酶及含有目的DNA 的模板DNA分子混合，经过高温变性（使DNA 双链解开）、低温复性（使引物与模板附着）和中温延伸（合成新的DNA片段）三个阶段的一次循环，DNA的量即可以增加1倍，则30次循环后，DNA的量增加230倍
PCR的三个阶段：
模板DNA的变性：模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA经加热至94℃一定时间后，解离变性成单链，以便与引物结合
模板DNA与引物的复性：温度降至55℃左右，等于或小于引物Tm时，引物与模板DNA单链
的互补序列配对结合
引物的延伸：DNA模板－引物结合物在Taq DNA聚合酶作用下，以4种dNTP为反应原料，目的DNA序列为模板，按碱基配对与半保留复制原则，从引物3’端催化复制链以5’——3’方向延伸,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

重复循环变性－复性－延伸，就可获得更多的半保留复制链，而这种新链又可成为下次循环的模板。

dNTP
DNA模版
反应体系E（Taq DNA聚合酶）
引物
缓冲液和MgCl2
RT—PCR PCR
模版mRNA DNA
E 反转录TaqE
产物
PCR的应用：体外变异诱导、DNA 测序、基
因克隆和筛选、基因诊断、法医诊断、分子进化研究
产物检测：2n /2n+1
DNA测序技术：双脱氧链终止法（ddNTP终止法）、化学修饰法
双脱氧链终止法（ddNTP终止法）原理：利用DNA聚合酶合成DNA，在DNA的聚合过程中在特异性的核苷酸位置终止反应而进行测序
反应的终止依赖于底物2’,3’-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）。

在DNA聚合酶作用下能通过其5’三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，形成磷酸二酯键，但由于缺乏3’羟基而不能同后续的dNTP或ddNTP形成磷酸二酯键，因此，一旦ddNTP掺入DNA的新生链中，聚合反应就会终止。

化学修饰法原理：1）放射性同位素标记待测DNA3`末端或5`末端;
2）用特殊的化学试剂处理来裂解具末端放射标记的DNA分子,造成碱基的特异性切割，由此产生一组不同长度的DNA片段
3）然后用电泳分离分析断裂片段的大小，放射自显影，读胶确定DNA序列
生物芯片的主要特点：高通量、微型化和自动化生物芯片主要分为基因芯片和蛋白芯片
cDNA文库构建
将生物某一组织细胞中的总mRNA分离出来作为模板，在体外用反转录酶（Reverse Transcriptase）合成互补的双链DNA （Complementary DNA，cDNA），而后接到合适的载体上，导入受体细胞后形成的所有克隆就叫cDNA文库
cDNA克隆可作于限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序、确定基因的转录方向、转录起始点等
构建步骤：
分离细胞总RNA，然后利用真核mRNA分子的3’端多聚A结构将mRNA从tRNA和rRNA 中分离出来
以mRNA为模板逆转录合成cDNA第一条链
合成cDNA第二条链有两种方法:一是用大肠杆菌的RNaseH切割RNA-DNA杂交分子产生RNA短片段，DNA聚合酶I以RNA短片段为
引物合成新的DNA链;二是利用cDNA第一链的3’端出现的发夹环结构，即第一链末端返折为合成cDNA第二条链提供引物
这些体外合成的cDNA经两端补齐后而具平头末端，在cDNA分子的两端与带有限制性核酸内切酶位点的人工接头连接，然后酶切后与载体(通常是λ噬菌体)连接，导入大肠杆菌，即得cDNA文库
绘制四张图谱（遗传图、物理图、序列图、转录图）
遗传图：指基因或DNA标记在染色体上的相对位置与遗传距离
物理图：以已知核苷酸序列的DNA片段（序列标签位点，sequence-tagged site,STS）为“路标”，以碱基对作为基本测量单位（图距）的基因组图
序列图：序列图是指整个人类基因组的核苷酸序列图，也是最详尽的物理图。

转录图：以EST（expressed sequence tag，表达序列标签）为标记，根据转录顺序的位置和距离绘制的图谱。

EST：通过从cDNA文库中随机挑选的克隆进行测序所获得的部分cDNA的5'或3'端序列称为表达序列标签（EST），一般长300-500bp左右。

1990年9月美国政府批准实施世界上第一例基因治疗临床方案、对一名患有重度联合免疫缺陷症（SCID）的4岁女童进行基因治疗并获得成功以来，基因治疗已从单基因疾病扩大到多基因疾病，从遗传性疾病扩大到获得性疾病如恶性肿瘤、心血管疾病和神经性疾病等
基因治疗包括:
体内直接转移基因法（体内法）
靶细胞介导的基因治疗（回体法）。