糖尿病肾病患者血浆miR-192、miR-29c水平变化及诊断价值

糖尿病肾病患者血浆miR-52,miR-29c水平变化及诊断价值
罗伯殉①张卫平②卫国红③
糖尿病肾病（DN）是2型糖尿病最严重并发症之一［/,DN 起病隐匿，早期无明显症状，当发现症状，出现大量蛋白尿时肾功能已发生不可逆的损伤，病情进展快，预后差［］。

微小RNAs （miRNAs）是一类由20~25个核昔酸组成的非编码单链小分子RNA,参与基因转录后水平调控以及细胞分化增殖、凋亡等多种病理生理过程，与恶性肿瘤、心血管疾病、自身免疫性疾病和慢性肾病等多种疾病有关［］，目前研究发现miRNAs参与慢性肾脏纤维化进程，在DN发病机制中起到重要作用,有望为DN诊断和疾病进展评估的标志物［］。

miR-57参与肺癌、肝癌、DN发病进程，与DN预后密切相关［］。

miR-29c参与多种疾病病理过程，与乙型肝炎并发症、糖尿病、鼻咽癌、膀胱癌及胶质瘤发生发展均有关.Shoe等［］指出mO-29c是糖尿病诊断的标志性miRNA,与DN肾脏纤维化进程有关。

本研究拟探讨miR-52、miR-29c表达与DN的关系，分析其对DN的诊断价值。

资料与方法
1临床资料选择2019年09月~2019年02月于惠州市中心人民医院肾内科及中山大学附属第一医院内分泌科诊治的187例2型糖尿病患者95纳入标准:①符合《中国2型糖尿病防治指南》诊断标准［4;②年龄18周岁以上，男性不限,资料完整。

（2）排除标准:①原发性肾病、高血压肾病、狼疮肾等其他因素导致肾脏疾病;②先天肾动脉狭窄;③合并其他内分泌疾病、免疫性疾病、心脑血管疾病者；④恶性肿瘤、乙肝患者;⑤糖尿病酮症酸中毒、高渗性非酮症性糖尿病昏迷、低血糖昏迷等症状;⑥）型糖尿病、妊娠期糖尿病或特殊类型糖尿病。

DN诊断标准［］：大量蛋白尿;视网膜病变伴微量蛋白尿。

根据是否合并DN将2型糖尿病患者分为两组，DN组98例（尿清蛋白排泄率30-300mg/24h）,DM组61例（尿清蛋白排泄率<30mg/24y/9］。

另选择我院门诊体检的80例健康志愿者为对照组,本研究获得伦理委员会批准，参与者均知情同意，签署同意书，诊疗过程严格遵循伦理学原则。

7血浆miR-52、miR-29c检测方法所有受试者入组后均留取外周静脉血标本和清晨中段尿标本，标本均存储于我院检验中心。

取静脉血标本5ml,注入EDTA抗凝管,4t、7000r/min于TDZ4-WS低速自动平衡离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）离心10min（离心半径10cm,离心力1740x g），取上层血浆于EP管置于-80t超低温冰箱（Ther­mo Fisher公司）保存。

取血浆样本，加入TRIzo/美国Invitrogen Life Technologies公司）提取总RNA,ND-1000紫外分光光度计（Na/oDrop公司）检测RNA纯度和完整性。

取20~30pg总RNA,采用M-MLV逆转录酶（Epicentre公司）将RNA逆转录为cDNA,反应体系20pi,反应条件：/t34min,45t 34min,85t5min灭活。

CFX96实时荧光PCR仪（美国Bic-Rad）检测miR-192、miR-29c表达水平，实时荧光定量PCR （quantitative Real Wme polymerase chain reaction,qRT-PCR）流程:将cDNA样品分别加入qRT-PCR反应体系，反应液配制如下：0.4pi PCR引物F（10pmo/L）,0.4pi PCR引物R （10pmo/L）J pLPCR缓冲液（10x）,1pl dNTP（2.5mmol/L）, 0.9pi氯化镁溶液,0.5U Tag聚合酶,0.7pi ROX Reference Dye J.8pmol/L荧光染料Syyer green）,加水至5pl。

反应条件：95t变性18s,65t退火20s；72t延伸18s,共44个循环。

引物购自金域医学检验中心，序列如下:mO-192,上游7 -GGGGCTGACCTATGAATTGA-3；下游：5；-CAGTG-CAGGGTCCGAGGT-3',miR-29c,上游5；-GTAGCAC-CATTTGAAATCAG-3'；下游:5；-TTGGCACTAGCACATT-3；U6：上游4GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3,下游5,CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3。

扩增反应结束后进行熔解曲线分析，共做3次平行试验。

以U6snRNA为内参, 7-me’计算miR-52、miR-29c在各组相对表达量。

3临床资料收集收集患者一般资料包括年龄、性别、身体质量指数（body mass index,BMI），糖尿病病程，生化指标［总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、血肌）（Scr）、尿素氮（BUN），肌）清除率（Ccr）、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）、肾损伤分子-1（KIM-1）/尿蛋白排泄率］。

4生化指标检测方法入院后45h内采集空腹静脉血5~10mi,采用罗氏Modular全自动生化分析仪检测TC、TG、LDL-C、HDL-C、Scr、BUN,采用Cochcroft-Gault（C-G）公式计算Ccr。

采用酶联免疫吸附试验法测定NGAL、KIM-1,采用放射免疫法检测蛋白排泄率。

5统计学方法SPSS25.0进行数据分析,Kolmogorov-Smirnov检验计量资料正态性,/vene检验方差齐性，符合正态分布以（4±s）表示，三组间比较采用单因素方差分析，组间两两对比采用LSD-t检验，两组间比较采用独立样本t检验。

不符合正态分布，经自然对数转换后采用MD（P25,P75）表示采用非参数检验。

计数资料以率（％、表示采用X7检验。

Peanon 相关或Spearman秩相关系数进行相关性分析，受试者工作特征曲线（ROC）分析各指标对DN的诊断价值。

所有统计均采用双侧检验，检验水准a=0.05。

结果
1基线资料比较三组年龄、男性比例、TG、HDL-C、
*本课题为惠州市医疗卫生类科技计划项目（No.2919Y949）；广东省医学科研基金资助项目（No.A2913775/国家自然科学基金资助项目（No.85700675）
①广东省惠州市中心人民医院肾内科（惠州519095）
②广东省惠州市中心人民医院感染控制部（惠州519095）
③中山大学附属第一医院内分泌科（广州519089/
LDL-C 比较差异无统计学意义(P>2. 25) ,DN 组BUN 、Scr 、
Ccr 、NGAL 、KIM - 1、尿蛋白排泄率高于DM 组和对照组(P <
2.25),D M 组与对照组比较差异无统计学意义(P >2. 25) °DN 组、DM 组 BMI 、PFG 、HbA)c 、TC 高于对照组(P <2.25),DN 组 T2DM 病程、PFG 、HbA)c 高于 DM 组(P < 2. 25 ),但
BMXTC 与DM 组比较差异无统计学意义(P>2.25) °见表)o
注:与对照组比较2 P <0.05;与DM 组比较2P<0.05
表1各组患者基线资料情况 (+$
组n
年龄(岁)男［例(％)T2DM 病 ( 年
BMg kg/m 5 ) PFG( mmotL))HbA1(%)TC( mmoL/L )TG( mmoL/L )DM 组
61
48.75 ±5.84 49(47.54)6235±2247
25.48 ±8.9、*
7225±223*7235±3245*4282±2295*(.55 ±0.8、
DN 组
9848.25 +5.74 48(4878)
9.35 ±8.0、°
26235±4212* 1.05 +4.33 *△ 9.54±8.45*°4297±2292*1261±2236
对组8240.25 ±5.10 40(50.50)-22213±3232
4232±22354232±22273285±2272
(.50+0.20F/z/t/x 1 值
1235412313527292824378222879225284(.59822681P 值
22262
2251922222
22222
22222
22222
22222
22272
组
n
HDL-C (mmoL/L )LDL-C
(mmoL/L )
bun
(mmoL/L )
Scs ([xmoL/L)Ccr) mt • mix -1 •
L05 m-5)
NGAL (pg/mi )KIM-9(pg/mi )尿蛋白排泄率1 ［Jia/m i u)
DM 组61
1242±22590.28 + 0.29 5.7、(4.8K957)58(4(,25)
94.2)±e.07168269±21242
3222±8239
43224±7235DN 组
981235±2262 4.27 + 0.32 8.05(5.e,K.e) *△(e(27,K4) *△7、.e±3.35*
△22.5( ±54.5( *△55.05 ±3.38*°136. 3±3.35必
对组821253±2251 4.5、+0.36 2.04(9e,S.58)
5、(97K 95235±24271
184.58 +2.0(
32242±729
42235±7261
F/z/t/x 1 值
22147
(.097162737452325
372726
99 2971792763
282164P 值
2211922335
22222
2222222222
22222
22222
22222
7 血浆miR-32、miR-29c 水平变化 三组血浆miR-
12、miR - 25c 水平差异有统计学意义(P<2.25),DN 组血浆 miR-197水平低于DM 组和对照组(P <2.25) , DM 组血浆 miR - 17低于对照组(P<2. 25) ;DN 组血浆miR -25c 水平高
于DM 组和和对照组(P <2.25) , DM 组血浆miR -29c 高于对 照组(P<2.25)o 见表7o
表7 各组血浆miR -32、miR-29c 表达差异 (+$
注:与对照组比较2 P <0.05;与DM 组比较，△ P<0.05
组
n
mib - 10mib - 29 c DM 组61
2265±2215*
2235±2235*
DN 组
980.35 ±0.1 *△8.20 +0.05 *△对组
82
1223±2226
1226±2229
F 值
332744
482164P 值
22222
22222
3血浆miR-32、miR-29c 表达与DN 肾功能指标相关
性分析 Pearson 相关或Spearman 秩相关分析miR - 37表达 与DN 患者NGAL 、KIM - 1、尿蛋白排泄率呈负相关(r =
-2.41、-2. 367、- 2. 295,均 P < 2. 25), miR -25c 表达与
NGAL 、KIM - 1、尿蛋白排泄率呈正相关(r = 2. 368,2. 268、
2. 07),均 P <2.25) , miR - 32、miR -29c 与 BUN 、Scr 、Ccr 无明
显相关性(P>2.25)o
4 血浆miR-32、miR-29c 诊断价值分析 建立基于血 浆 miR - 32、miR -29c 、miR - 37 + miR -29c 预测模型，通过
ROC 曲线下面积(AUC )评估其诊断DN 的准确性，miR-)92、
miR-29c 、miR-32 + miR-29c 诊断诊断 DN 的 AUC 、灵敏
度、特异度见表3,见图)o
表 3 miR-)92、miR-29c 、miR-)92 +miR-29c 诊断 DN 效能分析
指标
AUC (95 % C/)
P
Cut - oL 灵敏度(％)
(%
mib-1940.052(0.075 〜0.88、)
020000242
6923980233mib - 49c
9.694(9.01、〜0.777)020003201
6322777205mib - 194 + mib - 29c
0.858(0.799 〜0. 91)02000
/
91263
88252
讨 论
DN 发病机制复杂，包括糖、脂代谢紊乱、血液动力学、氧化
应激和细胞因子的改变2起肾小球基底膜增厚、细胞外基质 积聚、肾小球硬化、滤膜损伤、肾小管萎缩、肾间质纤维化。

这 些病理改变导致尿白蛋白排泄率升高，出现缓慢性进展性蛋白 尿，最终引起肾衰竭和ERSD 的发生〔讪° miRNAs 通过调节肾
细胞周期变化、炎性与免疫反应、上皮-间充质转化等多种机 制参与DN 发病机制［13，对DN 预防和早期诊断、临床治疗均
具有重要临床价值。

miR - 37是具有多种生物学效应的miRNAs,miR - 37在
肾脏尤其是肾皮质中高表达,1R - 37表达降低与肾小球滤 过率降低密切相关°本研究DN 组血浆miR - 167mRNA 表
达明显降低，说明miR - )97可能参与DN 的发病进程。

可能
是因为转化生长因子P)(TGF- B ］)通过调控miR - 17表达控 制肾纤维化进程,TGF- B )是一种介导肾脏纤维化和炎症的细 胞因子，通过抑制近端肾小管上皮细胞miR - )97表达,降低肾 小球滤过率，加速肾纤维化进程。

md - )97过表达可抑制锌 指E 框结合同源框1 ( Zehl )和ZeU5表达，Zeb)、ZeU5作为 TGF- B )信号通路下游转录因子，可抑制上皮型钙黏蛋白(E -
cadhe/n)抑制肾纤维化进程。

早期生长反应因子1 ( Egr))通过
促使TGF-內表达参与肾纤维化进程,md - 37通过3= UTR 靶向抑制Egr)表达，预防肾小管间质纤维化［13］。

相关性分析 发现miR - )97mRNA 表达水平与肾功能指标NGAL 、KIM - 1、 尿蛋白排泄率均呈负相关,Jm 等［3］同样发现md - 105mRNA
表达与蛋白尿水平密切相关，说明miR - 167mRNA 表达越低， 肾功能损伤程度越重，肾功能越低，提示md - 167mRNA 表达 可反映DN 肾功能损伤情况。

miR -59c 定位于人人染色体lq32. 2,由88个碱基组成，
具有促使细胞分化、增殖、凋亡多种生物学功能,参与肿瘤发生
00.20.40.60.8 1.0
图1miR-192、miR-29c、miR-192+miR-29c
诊断DN的ROC图
和侵袭转移40o mid-22o表达于肾小球，高糖可诱细胞和血管内皮细胞表达mid-29c,进而诱导细胞凋亡，增加细胞外基质沉积，促使肾纤维化进程40o尿液中mid-29c水平与2型糖尿病患者蛋白尿水平，其水平升高可作为DN 加重的标志物44o本研究DN组血浆mid-29cmRNA表达水平高于DM和对照组,DM组高于对照组，说明mid-29c参与2型糖尿病微血管损，mid-29c的升高是糖尿病肾损伤的敏志物。

目前mid-29c在DN发病机制尚未完全阐明，有报道认为mid-29c通过腺昔5磷酸活化蛋白酶(AMPK)/雷帕(mTOR)信号转，刺激近端肾小管上皮细胞分泌促炎细胞因子，介导局部炎症和纤维化4]o分析发现mid-22c与NGAL、KIM-2尿蛋白排泄率呈正相关, mid-22c表达升高促使DN肾损。

ROC分析结果显示mid-12、mid-29c对DN均具有一定诊断价值，但存敏低的弊端，联合mid-12与mid-29c有效降低DN诊断的漏诊和误诊率，提示mid-12与mid-29c联合DN高性和真实性,可为临床诊治工作提供更：信息。

综上，血浆mid-12、mid-29c表达均与DN患者肾功能密切相关,可作为DN诊断的辅助指标，联合mid-192、mid-29、可提高诊断DN的率。

参考文献
9Sistani SS,AlidWi A,MogUabam AA,et aU Compwisox of rexei aderivi resistive indey in mye2UiaUetiv upkppWUy smye0-41Et J Trausi Myol,201,29(4)：53641
21UmauatU K,Lewis JB”Update ox UiaUetiv uepkropatUg:2010cur­riculum22131Am J Kidney Dis,201,2、(6)：854-545•
31KaPePkobn SP,SSukle V,Varghese VK,et aU ClnstereP midNAs and tUeir role in CR/vRel functions and aiseaseS1Biol Rea CamU Philos Soo,2213,45(4)：1055-1861
41Deli D,Eisele C,Schmid R,et—•Urinap Exosomei miRNA Siq-nature in Type II Diahe/c NepkropatUg Patients•PLob One, 2219,1)(3)/01014•
51Me X,Ln C,La C,et aW The expression of miR-12and its siq-nificanco in UiaUetio uepkropatUg pW/xts witU di/erext urine ai-Uumin creatinine ratio.1Diahetes Res,201,2016：67594021
61Shoo H,Hnanc Y,Hn HL,et aU Effect of mid-22c on rexei fi-Crosis in UiaUetio rats vie tUe AMPKmTOR siona/nc kWUwcg1 Eno Rea MeP Phaunacoi Sd,201,23(1)：2250-K
7•中华医学会糖尿病学•中国2型糖尿病防治指南(2219年版)•中华糖尿病杂志,201,1(、)：4-691
3.中华医学会糖尿病学微血管并症学组•糖尿病肾病防
治专家共识(201年版)•中华糖尿病杂志,201,6(1、)：792 -8011
9•黄炎，黄伟，章爽，等.血清NGAL、hs-CRP、CysC和U-mALB对糖尿病肾病早期诊断价值的初步探讨5医学,201,24(10)：118-129
10.Tana J,Yvo D,Yan H,et al.The pie of micro RNAs in tUe
pathooexesis of diahetic nephppathy.Int J Endocrinol,2210, 201：871060.
19熊思,彭辉勇，柳迎昭，等.MicpRNAs在糖尿病肾病中的研究进展.中国医学杂志,221422()):70-661
11陈月英，罗晓星，谢咏梅，等•糖尿病肾病患者尿液mid-102的表达及临床意义•检验医学与临床,2018,15(18)：271、-27101
21Lin F,Zhanc ZP,Xin GD,et aW mid-12ppexts rexei tuPn-lointerstitici fidrosis in diahe/e nephropatUg by taree/nv Egr)•Eno Rea MeP Phaunacoi Sd,201,22(1)：4252-42601
14.Iie Y,Guan M,Zhexo Z,et aW midNAs in urine extracel/lor
vesicles os ppPicma of earig-staye diahetie uephropatUgI5 Diahetes R os,201,2016：79327651
11Li W,Yi J,ZU—a X,et aU mid-22c p/ys v suphPssive role in ereast cancer by targe/nc tUe TIMP5/dTAT)//OXO)pWU-wcg1C/n Epicexetics,2215,14：74•
11Chen HY,Chen CY,Chin YH,ot al.DifferexPol microRNA pp-filos kPpRt diahe/c nephropatUg ppo—ssRp in miwwu Int J MeP Sd,2215,15(5)：459-4551
(收稿:4419-42-4)修回:4424-45-25
)。