结核分枝杆菌PE_PGRS33蛋白的研究进展

中国人兽共患病学报
2020,36(11)Chinese Journal of Zoonoses949 DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.155・综述・结核分枝杆菌PE_PGRS33蛋白的研究进展
鞠晓红，王月华，方芳
摘要：PE_PGRS33蛋白是典型的PE2_PGRS(Prolinc-Glutamic_polymorphic GC-rich repeat sequence,PE_PGRS)亚家族成员，由R ul818c基因编码，属于结核分枝杆菌(Myobaceium tuberculosis,MTB)细胞壁暴露抗原，只表达于结核分枝杆菌复合群，与结核分枝杆菌的致病性、毒力、抗原变异密切相关.本文就近年来有关PE_PGRS33蛋白的结构、功能、致病机制、基因调控及在疫苗和诊断试剂研发中的应用价值等方面的研究进展做一简要综述，为结核病致病机制的研究及制定预防诊断策略提供参考.
关键词：结核分枝杆菌；PE家族；PE_PGRS亚家族；PE_PGRS33
中图分类号汨378.91；S8552文献标识码:A文章编号：1002—2694(2020)11—0949—07
Research progress on the PE_PGRS33protein of Mycobacterium tuberculosis
JU Xiao-hong,WANG Yue-hiia,FANG Fang
(J iLin Medical University,J itin132013,China)
Abstract：The PE_PGRS33protein is a member of the proline—glutamic_polymorphic GC—rich repeat sequence(PE_ PG R S)sub family,which is encoded by the Rv1818c gene.It is exposed on the cell wall surface in Mycobacterium tuberculosis and is expressed only in the Myobacteim tuberculosis complex.PE_PGRS33protein is closely associated with the pathogenic-ty,virulenceandantgenicvariatonof Mycobacteriumtuberculosis.Herein,toprovideareferenceforthestudyofthepatho-genic mechanism of tuberculosis and the development of preventive and diagnostic strategies,wc review PE_PGRS33's struc-ture,function,pathogenesis,generegulationandapplicationsinthedevelopmentofvaccinesanddiagnosticreagents.
Keywords：Myobaceim tuberculosis;PE family；PE_PGRS subfamily；PE_PGRS33
Corresponding author:Fang Fang,Email：*****************
PE_PGRS亚家族是分枝杆菌属细菌特有蛋白，绝大多数只存在于结核分枝杆菌复合群，部分可在其他致病性分枝杆菌表达，如海分枝杆菌、溃疡分枝杆菌等［1］。

因其N端有高度保守的脯氨酸-谷氨酸(Proline-Glutamic,PE)基序、C端富含多态性的鸟嘌吟胞嘧啶重复序列(polymorphic guanine cyto­sine rich repeat,sequence,PGRS)而得名，是一个功能极其复杂的结核分枝杆菌复合群特异的多态性蛋白家族，包括60多个成员。

虽然近年来研究证实一些家族成员与结核分枝杆菌的致病性与毒力密切相关，在研发新型疫苗和抗结核治疗方面表现出巨大潜力［5］。

但迄今为止的多数研究只集中于少数几个成员的结构和功能，大多数成员在致病性和生物
通讯作者：方芳»Email：****************；
ORCID：0000-0001-7958-5723
作者单位：吉林医药学院，吉林132013学功能方面的作用仍不清楚。

众多成员中，最具代表性的是PE_PGRS33蛋白，有许多独特功能，同时也是研究得较为深入的一个成员。

本文就将近年来有关PE_PGRS33的研究进展做一简要综述，以期为今后进一步研究该家族蛋白的生物学功能、致病机制及基因调控机制等提供参考，为利用PE_ PGRS蛋白开发新型疫苗和诊断试剂及治疗策略提供依据。

1PE_PGRS33蛋白的结构域
PE_PGRS33蛋白由Rv1818c基因编码, Rv1818c基因位于结核分枝杆菌H37Rv的2061178〜2062674之间，全长1497bp,GC含量高达7&打％。

编码的PE_PGRS33蛋白是一种稳定的疏水蛋白，位于结核分枝杆菌细胞壁上，暴露于细胞表面。

蛋白全长498个氨基酸，分子量约41
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kDa,共有19种氨基酸组成，其中甘氨酸约占41%,丙氨酸约占20%.完整蛋白由3个结构域构成，分别是N端的PE结构域(PE domain)、C端的PGRS 结构域(PGRS domain)和连接二者的一段短的连接区(linker region,LR)，也有学者将其称为过渡区(transition domain)或跨膜区(transmembrane re­gion)(图1).但生物信息学预测显示归,PE_ PGRS33蛋白无跨膜螺旋，全部存在于膜外侧.PE 结构域含100个氨基酸残基，高度保守，第8位和第9位是PE家族蛋白的标志性基序Proline-Glutamic (PE)；PGRS结构域含357个氨基酸残基，富含甘氨酸-丙氨酸重复序列(GGAGG),极具多态性,主要表现在大小、氨基酸序列和重复片段的数量上；过渡区是一段高度保守序列，含41个氨基酸残基[7].生物信息学分析，PE_PGRS33蛋白含有5个苏氨酸磷酸化位点和2个丝氨酸磷酸化位点，有27个B淋巴细胞抗原表位和4个T淋巴细胞抗原表位；结构预测显示蛋白的二级结构有85个a-螺旋、111个-折叠、52个-转角和250个无规则卷曲，结构较为松散间.
图1PE_PGRS33蛋白结构域示意图
Fig.l Schematic of PE_PGRS33protein domains
PE_PGRS33蛋白介导的典型毒力特征依赖于其结构的完整性，三者缺一不可.PE结构域的主要功能有二：一是将蛋白经由ESX分泌系统(EAST-6 secretion system,ESX)定向转位至细胞壁,使PGRS结构域暴露于细胞表面；二是提供T淋巴细胞识别表位，激发细胞免疫应答.PGRS结构域的作用多样而复杂，是发挥免疫调节作用的主要功能区，与致病和免疫逃逸密切相关.作为细胞表面暴露部分,PGRS结构域首先触发天然免疫应答，如刺激巨噬细胞释放细胞因子、诱导细胞凋亡；介导结核分枝杆菌侵入巨噬细胞，在细菌的持续性感染和致病中发挥作用；包含多个B细胞抗原表位，激发体液免疫应答.两个结构域之间连接区的确切功能尚不清楚，有研究显示可能与细菌进入细胞后PE_ PGRS33蛋白定位于宿主细胞线粒体有关.全长PE_PGRS33基因转染人横纹肌肉瘤细胞24h后,染色发现表达的蛋白定位于细胞线粒体。

进一步构建不同长度基因片段转染细胞发现，缺失PE和PGRS结构域之间41个氨基酸连接区后，蛋白不能在线粒体上定位，说明连接区是蛋白线粒体定位的关键结构，推测连接区可能包含某种特定定位信号或是引导蛋白正确移位和折叠的必须序列
2PE_PGRS33蛋白的分泌与定位
2.1分泌途径同大多数PE_PGRS家族成员缺乏典型分泌信号的特征一样，PE_PGRS33也无蛋白信号肽,然而在细胞质中合成的蛋白，最终却表达于细胞壁表面，说明结核分枝杆菌能另辟蹊径将胞内合成的PE_PGRS33蛋白转运至细胞表面.研究发现[910],与PE_PGRS蛋白分泌有关的是近年来新发现的一种新型分泌系统-哑型分泌系统(type VII secretion systems,T7SS)，也被称为ESX系统,在结核分枝杆菌中存在5种ESX,分别命名为ESX-1〜ESX5,参与胞内PE_PGRS蛋白分泌的主要是在进化上出现较晚的ESX-5,推测PE_PGRS蛋白可能是ESX-5的特异底物.将携带PE_PGRS33基因的质粒分别导入海分枝杆菌野生株E11和ESX-5突变株7CI中，结果发现ESX-5缺失的突变株不能将蛋白转运至细胞表面，从而证实PE_ PGRS33也是ESX-5的特异底物[7].但与结核分枝杆菌不同的是海分枝杆菌转运到胞壁的PE_ PGRS33蛋白分子量明显降低，推测在海分枝杆菌转运的过程中蛋白可能经过加工处理.Burggraaf 等研究海分枝杆菌质粒表达PE_PGRS蛋白的分泌中发现，C端具有天冬氨酸蛋白酶活性的PE_ PGRS蛋白(如PE_PGRS35),包含典型的DTG/ DSG序列，在运送过程中先被加工裂解，然后再表达在细胞表面.由于海分枝杆菌不天然表达PE_ PGRS33蛋白，可能在菌体内的运输处理过程与结核分枝杆菌存在差异.
2.2亚细胞定位完整表达的PE_PGRS33蛋白定位于结核分枝杆菌的细胞壁，PE区起锚定作用嵌埋在胞壁外膜上，PGRS结构域暴露于细胞表面，负责与宿主细胞相互作用，未发现分泌至胞外可溶形式存在的蛋白.只有PE结构域而无PGRS结构域的蛋白能在细胞壁上检测到但不能暴露于细胞外,反之只有PGRS结构域则只能在细胞质中检测到，进一步证实了PE结构域负责将胞质内合成的PE_ PGRS33蛋白转位至细胞壁的功能[7].侵入巨噬细胞内的结核分枝杆菌表达的PE_PGRS33蛋白可能经过MHC-I类和□类途径经过抗原提呈以MHC-肽段的形式表达于感染细胞表面，被T淋巴细胞和B淋巴细胞识别，在特异性细胞免疫和体液免疫中发挥作用[12]
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重组耻垢分枝杆菌表达不同长度PE_PGRS33蛋白的结果显示，PE结构域全部缺失菌株只能在胞质中检测到不完整PE_PGRS33蛋白，表达全长蛋白的菌株可在胞质和胞壁上同时检测到PE_ PGRS33蛋白，在细菌培养上清液中均检测不到PE _PGRS33蛋白，说明PE_PGRS33不是分泌型蛋白，属于细胞壁上的结合蛋白，蛋白的转运信号存在于PE结构域。

进一步研究发现，缺失PE结构域最初30个氨基酸的菌株，蛋白同样定位于胞质中，在胞壁上仅有极少量蛋白表达，提示转位信号存在于蛋白最前端的30个氨基酸中，下游氨基酸维持结构的稳定性目前尚未获得PE_PGRS33蛋白PE 结构域的确切构象，研究最为清楚的PE结构域来源于该家族的独特成员PE25(仅有PE结构域，与其后的PPE41形成异源二聚体)，考虑到PE结构域的高度保守性，推测PE_PGRS33蛋白应该具有相似的结构特点。

PE25的PE结构域有两个a-螺旋，分别位于8~37位氨基酸和45~84位氨基酸之间，由38~44之间一段成环状的氨基酸连接［3］结合PE_PGRS33蛋白缺失N端最初30个氨基酸不能转位到细胞壁上的事实，推测第1个a-螺旋直接参与将蛋白输送至ESX-5分泌系统并最终将其锚定在细胞壁上，第2个a-螺旋和环状连接区维持完整蛋白的构象稳定性。

在天然表达PE_PGRS33蛋白的卡介苗(Bacil­lus Calmette-Guerin Vaccine,BCG)和结核分枝杆菌的研究中同样发现，缺失PE结构域的菌株蛋白主要存在于胞质中，但表达完整PE_PGRS33的结核分枝杆菌，只能在胞壁上检测到蛋白，不同于耻垢分枝杆菌，说明在野生型菌株胞质中合成的蛋白全部转位至细胞壁，不会在胞质中积聚。

据此推测，在结核分枝杆菌复合群可能存在PE_PGRS33蛋白合成的负反馈调节机制，不会合成过量的PE_ PGRS33蛋白使其积聚，这也可能是细菌在不同生长环境和生长阶段差异性表达该蛋白的原因之一。

3PE_PGRS33蛋白的表达与调控
PE_PGRS33蛋白组成性表达于结核分枝杆菌复合群，不具有家族其他成员还能表达于海分枝杆菌的特性，是结核分枝杆菌在进化过程中获得的一组Rv1818c基因编码的毒力因子，暴露于细胞表面，在不同生长状态下差异性表达，与结核分枝杆菌的致病性密切相关，影响着疾病的发生与转归15］。

实验室菌株H37Rv、减毒株BCG、临床菌株CDC1551和临床分离株中表达的PE_PGRS33存在明显多样性，主要表现为PGRS结构域重复序列的数量、氨基酸种类和序列差异，如H37Rv、BCG、CDC1551分别有21.26.32个GGAGG重复序列.
PE_PGRS33蛋白的表达在转录水平上受Sig­ma因子调控，参与调控的主要有Sigma A、Sigma B 和SigmaDE］PE_PGRS33起始密码为ATG,终止密码为TAG,5'-RACE分析显示，转录起始点位于PE结构域上游5'端距ATG75个核苷酸处，转录起始位点上游7个核苷酸位置有典型的-10区序列(TACGCT),未发现35区序列，在假定的-35区附近出现一个多聚A拉伸(poly-A stretch)。

转录分析发现，Sigma A识别PE_PGRS33蛋白的启动子，促进基因表达。

在启动子区还存在一个操纵序列，能被诱导阻遏蛋白识别，在应激条件下参与蛋白的表达调节，如当结核分枝杆菌进入巨噬细胞内或暴露于营养匮乏及低氧等不利环境时，阻遏蛋白通过某种途径被诱导表达，下调PE_PGRS33的转录水平。

Sigma B促进基因表达，在Sigma B过表达菌株，PE_PGRS33表达显著增加。

Sigma D可能通过直接或间接驱动诱导性阻遏蛋白表达，从而抑制PE_PGRS33表达，在Sigma D突变株PE_PGRS33表达明显上调。

SigmaD在稳定生长期和营养缺乏时表达上调，PE_PGRS33与之正好相反。

但低氧环境时，二者均表达下调，说明在结核分枝杆菌中还存在其他的调控机制，需要进一步深入探讨。

4PE_PGRS33蛋白的变异
PE_PGRS33蛋白在基因水平存在广泛变异,是结核分枝杆菌抗原变异的重要原因。

以碱基的插入、删除和单核苷酸多态性(single nucleotide poly­morphism,SNP)为主，突变主要集中于PGRS结构域，所有插入序列均位于PGRS结构域，影响到1至多个重复序列，移码突变只有1个，余者均为非移码突变”皿，说明在菌体内存在选择压力来维持基因开放读码框的稳定性，据此可以推测PE_PGRS33蛋白在结核分枝杆菌生存中发挥着至关重要的作用。

突变集中于PGRS结构域的原因可能是在重复序列的复制和重组过程中，发生滑链错配(repl-cationslippage)。

Camassa等［"］研究135株临床菌株发现，PE_PGRS33基因变异的dN/dS为0.64,属于纯化突变，进一步证实PE_PGRS33的基因多态性可能损害结核分枝杆菌的重要功能，因此菌体内存在负向选择压力，对抗有害突变。

插入碱基范围9〜270bp,均为非移码突变；删除碱基大小在1〜363bp之间，唯一发生的移码突变是在1014bp处
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删除1bp(-1bp)，删除后基因继续编码36个氨基酸后提早出现终止密码，丢失后续C端的160个氨基酸，其中包含12个重复序列。

发生1bp突变的菌株毒力明显降低，可能与C末端258bp保守序列丢失有关。

突变频率最高的位点是717bp处发生TC 的同义突变；其次是1240bp处插入9bp,增加1个甘氨酸-丙氨酸重复序列，二者同时突变占25.4%[9。

移码突变和大片段的非移码突变损害结核分枝杆菌侵入人类巨噬细胞能力，但不影响细菌在胞内的生存繁殖和蛋白的免疫调节作用，可能是结核分枝杆菌持续性感染阶段发生组织损伤和成人肺结核缺乏空洞的主要原因。

值得注意的是，在儿童和肺外结核病中，PE_PGRS33基因的多态性不影响结核分枝杆菌毒性，但能限制细菌的高效传播[18].
临床菌株PE结构域基因突变以SNP为主，同义和非同义突变各占50%,在131〜133bp处发现1个删除突变[19]o结构域的功能研究中发现[],PE 结构域N端的2、3位氨基酸发生SF—AA(丝氨酸苯丙氨酸一丙氨酸丙氨酸)变异和8、9氨基酸发生PE-AA(脯氨酸谷氨酸-丙氨酸丙氨酸)变异后,不影响PE_PGRS33蛋白表型，但蛋白在细胞壁表达的稳定性明显降低。

推测可能的原因有二：一是这两个部位的氨基酸参与PE结构域的锚定功能,变异后锚定不牢固致使胞壁蛋白不稳定；二是变异后可能改变了PE_PGRS33蛋白的二级结构或空间构象，进而影响了蛋白的稳定性。

分析上述PE_PGRS33蛋白的变异特征不难发现，在多种类型的变异中对结核分枝杆菌影响最大的是1014bp处发生的移码突变，其次是1240bp 处的插入突变，虽然不同程度影响了结核分枝杆菌的毒力和入侵宿主细胞的能力，但对细菌生存能力影响甚微，结合dN/dS小于1(0.64)的研究结果，证实在结核分枝杆菌内存在负向选择压力，迫使其发生纯化突变，印证了PE_PGRS33蛋白对于维持结核分枝杆菌功能的重要价值。

进一步需要深入探讨的是临床分离菌株PE_PGRS33基因发生不同变异后，对细菌与巨噬细胞的相互作用及逃避宿主免疫防御能力的影响，明确基因多态性与临床表型的关系，作为今后研究其在临床菌株中功能差异的基础.
5PE_PGRS33蛋白的致病机制
PE_PGRS33蛋白的致病机制主要是通过调节宿主免疫反应逃避杀伤，为细菌生存赢得空间和时间、加重组织细胞损伤、促进细菌扩散。

PE_PGRS33蛋白发挥作用的关键是依赖PGRS结构域直接与巨噬细胞表面的Toll样受体2(Toll-like re­ceptors2,TLR-2)结合，通过TLR-2诱导细菌入侵细胞、活化核转录因子k B(nuclear transcription factor,NF-k B)转录释放多种炎性细胞介质，并能定位宿主细胞线粒体诱导细胞凋亡(图2).细菌侵入细胞后,PE_PGRS33蛋白能抑制吞噬溶酶体形成、提升结核分枝杆菌的胞内存活能力，与结核病的持续性感染有关.
图2PE_PGRS33蛋白致病机制示意图Fig.2Schematic of PE_PGRS33protein pathogenesis
5.1介导结核分枝杆菌侵入巨噬细胞非致病的耻垢分枝杆菌重组表达PE_PGRS33后表现出结核分枝杆菌的典型毒力特征，能侵入巨噬细胞，在巨噬细胞和宿主组织中的存活能力明显增强。

Rv1818c 基因发生转座子Tn5367插入突变的菌株，在液体培养基失去聚集生长的能力呈分散生长，侵入巨噬细胞和胞内存活能力下降，回补完整Rv1818c基因后回复野生型的毒力特征。

PE_PGRS33基因缺失株(Mtb-丄彳)和只表达PE结构域的菌株，进入巨噬细胞的能力显著下降，主要存在于细胞外，但侵入上皮细胞的能力不受影响「18]。

进一步研究发现, TLR-2缺失小鼠用表达PE_PGRS33的耻垢分枝杆菌感染后，细菌亦不能进入巨噬细胞，肿瘤坏死因子a(tumor necrosis factors a,TNF-a)的释放水平极低，由此说明暴露于结核分枝杆菌表面的PE_ PGRS33蛋白主要借助PGRS结构域与巨噬细胞表面的TLR-2特异结合[20'21].推测PE_PGRS33介导细菌侵入巨噬细胞可能的机制有两个：一是PE_ PGRS33蛋白可能类似于病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMP),能被巨噬细胞的模式识别受体(patern recognition receptor,PRR)TLR识另」，促进内化；二是结核分枝
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杆菌表面成分复杂，有脂阿拉伯甘露聚糖、脂甘露聚糖及其他非蛋白成分，PE_PGRS33蛋白与这些表面成分相互作用，形成适合细菌黏附的空间构象，增强结核分枝杆菌的黏附能力，促进细菌侵入。

另外, TIR-2介导的细菌内吞与Ca2浓度亦密切相关, PE_PGRS家族普遍存在钙结合基序蛋白，与Ca2高亲和，当Ca2浓度耗尽时，PE_PGRS与TIR-2亲和力显著降低［23。

5.2诱导细胞凋亡细胞死亡的形式有3种：凋亡、自噬和坏死。

PE_PGRS家族不同成员诱导细胞死亡的方式不同，同一种死亡方式诱导途径亦不相同.PE_PGRS33诱导的细胞死亡以凋亡为主，主要途径是TIR-2依赖的刺激TNFa释放。

至于能否诱导细胞坏死目前尚存分歧，有待深入研究。

可溶性的纯化PE_PGRS33和表达于细胞壁表面的PE_PGRS33可同样诱导巨噬细胞凋亡。

刺激TNFa分泌是PE_PGRS33诱导细胞凋亡的关键，如事先用TNFa抗体处理细胞，则细胞不发生凋亡。

PE_PGRS33介导结核分枝杆菌侵入巨噬细胞和刺激细胞释放TNFa的能力均依赖TIR-2［J5。

PGRS结构域与TIR-2特异结合，在转录水平调节TNFa基因表达，刺激TNFa分泌，同时诱导细胞表达肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor re­ceptor1,TNFR1),TNFa与TNFR1结合触发死亡信号级联反应。

删除PGRS结构域后，不能刺激TNFa释放。

通过构建PGRS结构域不同基因片段缺失变异体回补Mt.b-A33发现，介导结核分枝杆菌侵入巨噬细胞的关键序列位于N端140〜260个氨基酸之间，该片段的许多疏水区存在短的亲水片段插入，可能是TIR-2的结合位点。

诱导TNF-a释放的信号通路为TIR-2依赖的凋亡信号调节激酶1(apotosis signal-regulating kinase1,ASK1)/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein ki­nase,MAPK)通路。

TIR-2与PE_PGRS33的PGRS结构域结合后，激活下游MAP3K家族的ASK1,活化的ASK1继而激活MAPK家族的p38蛋白和c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK),通过一系列磷酸化反应促使NF kb活化，最终触发包括TNFa在内的多种细胞因子和趋化因子转录、释放。

在此过程中，ASK1是p38蛋白和JNK活化的关键。

细胞外调节蛋白激酶1/2(extra­cellular regulated protein kinases,ERK1/2)信号抑制剂不能影响TNFa释放，p38蛋白和JNK抑制剂均能显著降低TNFa的释放，证实PE_PGRS33刺激TNFa释放依赖于p38蛋白和JNK信号通路。

小鼠和人类巨噬细胞对PE_PGRS33蛋白的反应有所不同，可能与TIR-2可变区在小鼠和人类存在多态性有关。

结核分枝杆菌表达的PE_PGRS33蛋白具有定位线粒体的能力，侵入细胞后通过线粒体途径诱导细胞凋亡。

目前研究未发现PE_PGRS33蛋白有线粒体靶向序列(mitochondrial targeting se­quence,MTS),蛋白主要依赖连接区将PGRS结构域定位于线粒体。

与PE_PGRS33蛋白有55%同源性的PE_PGRS1不能定位线粒体，提示PE_ PGRS33的PGRS结构域结合线粒体是特异的，但还不清楚结核分枝杆菌将蛋白转位到线粒体上的确切路径以及信号传导的具体机制，推测可能通过吞噬逃逸进入胞质或通过某个分泌系统与线粒体相互作用的结果，也可能与TIR-2介导的内吞有关［门。

PE_PGRS33定位于转染或感染的哺乳动物真核细胞线粒体后，检测发现细胞存活率明显下降，凋亡和坏死细胞显著增高，其中以凋亡为主。

RT-PCR检测发现，PE_PGRS33诱导后细胞Fas相关死亡结构域(fas-associated death domain,FADD)蛋白和半胱氨酸蛋白酶(caspase)表达上调，提示线粒体可能通过死亡受体途径或caspase8、9、3的依次活化,释放凋亡信号诱导凋亡［］。

广谱caspase抑制剂ZVAD-FMK、caspase8抑制剂均能阻断PE_PGRS 33诱导的细胞凋亡。

值得注意的是，缺失PE结构域或替换成家族其他蛋白的PE结构域，虽然在线粒体上也能检测到蛋白表达，但不能诱导明显的细胞坏死，说明PE结构域在线粒体介导的细胞坏死中发挥重要作用。

另有研究显示［4,PE_PGRS33蛋白定位人巨噬细胞线粒体后诱导线粒体融合，但不影响钙离子吸收、活性氧释放和线粒体膜电位。

作为线粒体融合蛋白，PE_PGRS33应该正调控机体的天然抗菌免疫，但上述实验结果说明PE_ PGRS33可能通过调控某种信号通路抑制宿主的天然免疫应答，具体机制有待研究。

5.3抑制细胞免疫应答结核分枝杆菌属于胞内寄生菌，主要保护作用来源于细胞免疫，PE_ PGRS33蛋白的T淋巴细胞抗原表位主要存在于PE结构域，刺激细胞免疫应答。

PGRS结构域的重复序列与EB病毒(Epstern Barr virus,EBV)富含甘氨酸和丙氨酸序列的核抗原1(EBV nuclear anti­gen EBNA-1)具有明显同源性，推测可能有类似于EBNA-1的作用，阻止PE结构域的抗原加工提呈,通过抑制细胞免疫应答逃避宿主的免疫杀伤，提升
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细菌胞内存活能力，在结核分枝杆菌的潜伏感染(latent tuberculosis infected,LTBI)中发挥作用。

此外，有研究显示PE_PGRS蛋白家族存在无序结构区和无序蛋白，在与宿主的相互作用中发生从无序到有序的结构改变，从而影响宿主的免疫应答［28］。

PE_PGRS33蛋白是否也具有此种特性尚不清楚，需深入探讨。

6PE_PGRS33蛋白的应用
PE_PGRS33的PGRS结构域是介导结核分枝杆菌与宿主细胞相互作用的主要区域，在结核的发病中发挥关键作用，拮抗该结构域的功能可能是抗结核病治疗的新方向。

PE结构域具有靶向转位胞内蛋白的功能，是构建重组DNA疫苗的理想载体。

用重组纯化的PE_PGRS33蛋白免疫小鼠后,可在血清中检测到特异性抗体IgG,与其他结核分枝杆菌蛋白无交叉反应，再次感染时可中和PE_ PGRS33的促炎活性、抑制细菌侵入巨噬细胞。

因此，通过检测PE_PGRS33蛋白特异的IgG抗体可用于结核病的快速诊断；利用特异性抗PE_ PGRS33抗体可拮抗细菌与巨噬细胞相互作用的特性，可通过重组纯化蛋白制备特异性抗体用于结核病的免疫学治疗［29］。

此外，基于PE结构域能将C 端蛋白靶向转位至细胞壁的特点，可将PE结构域作为转运工具，在其C末端融合保护性抗原MPT64,构建重组BCG疫苗(rBCG)。

rBCG通过PE将MPT64输送至细胞表面，使其成为表面暴露抗原［30］。

与BCG相比，接受rBCG免疫的小鼠感染结核分枝杆菌后，肺和脾中细菌数量明显减少(P <0.05),特异性CD,,T细胞和CD T细胞及释放IFN-7水平均明显增加。

由此可见，PE_PGRS33可作为对抗结核分枝杆菌感染的体液免疫的中和靶点或血清学检测的良好指标，亦可作为理想的候选疫苗加以研发。

7问题与展望
PE_PGRS33蛋白由于其复杂的生物学功能及强大的免疫调节作用，近年来成为结核分枝杆菌研究领域广为关注的热点。

PE结构域靶向转位胞内蛋白的特性为开发高效疫苗提供了新方向，PGRS 结构域的毒性和特异体液免疫特性为结核分枝杆菌的治疗和诊断提供了新靶点。

然而，关于PE_ PGRS33蛋白诱导细胞凋亡的信号通路、基因表达的调控及与其他蛋白相互作用的关系网络至今尚未阐明，能高效诱导免疫保护作用的抗原表位有待明确，蛋白的二级结构和三级结构目前是生物信息学分析结果，真正的空间构象尚未阐明。

寻找PE_ PGRS33蛋白的保护性和特异性抗原表位、明确决定其毒力的关键序列，是开发疫苗和开展免疫学治疗对抗结核分枝杆菌耐药性的重要手段，也是未来需重点关注的研究方向。

利益冲突：无
引用本文格式：鞠晓红，王月华，方芳.结核分枝杆菌PE_PGRS33蛋白的研究进展中国人兽共患病学报,2020,36(11):949955.DOI：10.3969/ j.issn.1002-2694.2020.00.155
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