动物细胞培养
动物细胞培养
理化环境可精确调控，生理条件相对恒定；
对于同一来源的组织样品，随着传代进行，细胞系逐渐趋于均一；
培养过程经济有效且可规模化；
可模拟细胞体内环境。
体外培养局限性：
对操作者的专业技术技能要求高；
能获得的细胞量较少（实验室：1-10g细胞/批，企业：100g细胞/批）；
培养过程中易出现细胞去分化和选择性培养的现象；
细胞质功能：
蛋白质和脂肪合成的重要场所，细胞内所有蛋白质合成的起始步骤都发生在细胞质基质的游离核糖体上；
细胞与环境、细胞质与细胞核以及细胞器之间的物质运输、能量交换、信息传递等都要通过细胞质基质来完成；
很多重要的中间代谢反应也发生在细胞质基中，糖酵解、磷酸戊糖途径、糖醛酸途径、糖原的合成与部分分解过程等；
线粒体
细胞中数量醉倒的细胞器（大约1700/cell），占细胞总体积的20%，人体内的细胞每天合成的数千克ATP大约95%由线粒体产生
超微结构：
线粒体是由两层单位膜套叠热诚的封闭的囊状结构。一般呈粒状或杆状
包括四个功能间隔：外膜、内膜、膜间隙、基质
线粒体的主要功能：
氧化磷酸化；合成ATP；为细胞的生命活动提供能量。
磷脂双层膜是一种非共价结合的聚合物，由磷脂组装而成，因此，可以自由活动：迅速地扩大、缩小、断裂、融合
细胞膜动态平衡：膜循环以维持平衡
小结——细胞膜
磷脂双分子层特性：磷脂双分子层是流动的，其流动性受温度、脂肪酸和胆固醇等因素影响；
磷脂双分子层由磷脂、糖脂、胆固醇和蛋白构成；
磷脂具四种类型结构，以甘油丝或丝氨酸为骨架；
细胞质面积：VSELs：6μm2，HSCs：35μm2
水：占尽80%；蛋白占10~20%。
动物细胞培养
动物细胞培养简介动物细胞培养是一种在体外控制环境下培养和繁殖动物细胞的技术，广泛应用于生物医学研究、药物筛选、疾病治疗等领域。
动物细胞培养是通过提供适当的养分和生长条件，使细胞可以在无体内环境的情况下生长和繁殖。
培养基选择动物细胞培养的首要任务是提供合适的培养基，以满足细胞的生长和繁殖需求。
培养基通常由基础培养液和补充物组成。
基础培养液提供细胞生长所需的基本营养物质，如糖、氨基酸、维生素等。
补充物则包括生长因子、激素、抗生素等，以促进细胞生长和抑制细菌的污染。
常用的培养基有DMEM（Dulbecco最小培养基）、RPMI （Roswell Park红斯威尔纸培养基）、MEM（最小必需培养基）等。
选择适合特定细胞类型和研究目的的培养基对细胞的生长和研究结果至关重要。
细胞分离和传代在动物细胞培养过程中，细胞通常需要经过分离和传代的步骤，以保持细胞的健康状态并扩散细胞数量。
细胞分离细胞分离是将细胞从组织中分离出来的过程。
常用的细胞分离方法包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法、机械剪切法等。
分离得到的细胞可以直接用于培养，也可以进行进一步的传代。
细胞传代细胞传代是将已培养细胞进行分离并移植到新的培养皿中的过程，以维持细胞的持续生长。
传代可以通过机械分离、胶原酶等酶处理或稀释离心等方法进行。
传代过程中需要注意的是细胞的密度和周期，以避免细胞过度生长或死亡。
培养条件在动物细胞培养过程中，提供适当的培养条件对细胞的生长和繁殖至关重要。
温度和湿度动物细胞通常在37℃下生长，因此培养箱和孵育器需要保持恒定的温度。
同时，湿度的控制也是必要的，以避免细胞脱水。
CO2和pH值大多数动物细胞需要CO2的存在来维持酸碱平衡。
因此，在培养过程中，需要添加适量的CO2到培养箱中，以维持合适的pH值。
一般来说，细胞培养需要在5% CO2下进行，pH范围为7.2-7.4。
搅拌和通气为了促进细胞的生长和分裂，培养基需要定期搅拌以保持养分的均匀分布。
生物-动物细胞培养
动物细胞培养[高中生物] 1.阐明动物细胞培养的条件和过程。
2.简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值。
一、动物细胞培养的条件和过程1．动物细胞工程常用技术(1)常用技术：动物细胞培养、动物细胞融合和动物细胞核移植等。
(2)基础：动物细胞培养。
2．动物细胞培养(1)概念：从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
(2)培养条件①营养a．合成培养基：将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基。
b．天然成分：血清。
c．培养液：即液体培养基。
②无菌、无毒的环境a．对培养液和所有培养用具进行灭菌处理。
b．在无菌环境下进行操作。
c．培养液需定期更换，以清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
③温度、pH和渗透压a．温度：以36.5 ℃±0.5 ℃为宜。
b．pH：以pH为7.2～7.4为宜。
c．适宜的渗透压。
④气体环境a．O2作用：细胞代谢所必需的。
b．CO2主要作用：维持培养液的pH。
c．气体组合：95%空气＋5%CO2。
(3)培养过程②过程(4)相关概念①细胞贴壁：悬液中分散的细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。
②接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖的现象。
③原代培养：指动物组织经处理后的初次培养。
④传代培养：分瓶后的细胞培养。
判断正误(1)动物细胞培养体现了动物细胞的全能性( )(2)培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞( )(3)悬浮培养的细胞直接用离心法收集，贴壁细胞需要用胰蛋白酶等处理后再用离心法收集( ) (4)动物细胞培养时，O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH( )答案 (1)× (2)× (3)√ (4)√探讨点 动物细胞培养1．动物细胞培养的原理是细胞增殖。
2．幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较，哪些细胞更易于培养？为什么？提示 幼龄动物的细胞和分化程度低的细胞更易培养，原因是这些细胞分裂能力强。
动物细胞培养
动物细胞培养
动物细胞培养是一种重要的生物技术手段，广泛应用于医药、生物学研究、食
品工业等领域。
通过细胞培养，可以获取大量同质的细胞群体，为疾病治疗、新药研发提供重要的支持。
动物细胞培养的原理
动物细胞培养是将动物组织或细胞在人工培养基中进行维持、增殖、传代等过程。
培养基通常包括营养物质、生长因子、激素等成分，提供细胞生长所需的营养和环境。
动物细胞培养的步骤
1.细胞来源：从动物体内收集组织样本，获得原代细胞。
2.细胞分离：通过消化酶等手段将组织分离成单个细胞。
3.传代培养：将分离的细胞在培养基中培养，定期传代以增殖细胞数
量。
4.检测与分析：对培养的细胞进行检测、分析，确保其健康状态。
动物细胞培养的应用
1.生物医学研究：细胞培养在癌症、遗传疾病等方面的研究中发挥重
要作用。
2.药物研发：通过细胞培养可以进行药物筛选、毒性测试等工作。
3.食品工业：利用细胞培养技术可以生产细胞培养肉等食品。
动物细胞培养的发展
随着生物技术的不断发展，动物细胞培养技术也在不断创新和提升。
新的培养
基配方、生长因子的发现以及工程技术的应用，使得动物细胞培养在医学和生物学领域有着广阔的应用前景。
动物细胞培养作为一种重要的生物技术手段，将继续在各个领域发挥重要作用，为人类健康和科学研究进步做出贡献。
动物细胞培养
玻璃：最常用，便于观察、易洗涤可反复使
用。 塑料：常用聚苯乙烯，具亲水性，常加工成 多孔板、培养皿等 金属：不锈钢和钛
动物细胞小规模培养
悬滴培养法
培养瓶培养法 旋转管培养法
灌注小室培养法
培养板培养法
悬滴培养法 ①将培养液滴于盖玻
3、游走型细胞 本型细胞在支持物上散在生长，一般不连
成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃 的游走或变形运动，速度快且不规则。此型 细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。 在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片 后，可呈类似多角型或成纤维细胞形态。 4、多形型细胞 形态上不规则，一般分胞体和胞突两部分， 其中胞突细长形，类似丝状伪足，胞体呈多 角形。
贴附型
培养细胞的 生长类型 悬浮型
游走型细胞 多形型细胞
贴附生长是大多数有机体细胞在体内生存和
生长发育的基本存在方式。贴附有两种含义： 一是细胞之间相互接触；二是细胞与细胞外 基质结合。 动物细胞培养中，大多数哺乳动物细胞是必 须附壁即附着在固体表面生长，当细胞布满 表面后即停止生长，这时若取走一片细胞， 存留在表面上的细胞就会沿着表面生长而重 新布满创面。
贴附型细胞 1、成纤维型细胞 本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而 得名，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生 长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出2-3厘米 个长短不同的突起，除真正的成纤维细胞外，凡由 中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。 2、上皮型细胞 细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细 胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动， 处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。 起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生 物、 消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。
..动物细胞培养技术
植物组织培养和动物细胞培养的比较
比较项目
植物组织培养 动物细胞培养
原理
细胞的全能性
细胞增殖
培养基性质
固体培养基
液体培养基
培养基特有成分
蔗糖
植物激素
葡萄糖、促生长 因子、 动物血清
培养结果
植物体
细胞株、细胞系
培养目的
快速繁殖、培育 获得细胞或细胞
无病毒植株
分泌蛋白
4、过程
动物胚胎或幼龄动
胰蛋白酶
加培养液
单个细胞
细胞
物的组织、器官 剪碎
制成 悬浮
液
原 代 培 养
细 胞 贴 壁
细胞
50代细胞 剥离、分瓶
10代 细胞
传代培养
5:动物细胞生长特性
接触抑制
■当贴壁细胞分裂生 长到表面相互接触时, 细胞就会停止分裂增 殖，这种现象称为细 胞的接触抑制。
细胞的接触抑制
（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）
2、营养
葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、促生长因 子、微量元素（合成培养基）+动物血清等
3、温度和PH 温度36.5+0.5度，pH7.2～7.4
保证细胞顺利的 生长增殖
4、气体环境
能否用胃蛋白酶
O2和CO2（95%空气和5% CO2 ） 代替胰蛋白酶？
阅读课本 观察图片， 简述动物 细胞培养 的基本过 程
如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细 胞系？
细胞 悬浮 液
细胞株
细胞系 遗传物质改变
10代 细胞
50代 细胞
无限传 代
原代培养
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ传代培养
烧伤病人图片
动物细胞培养
221动物细胞培养和核移植技术第1课时【学习目标】1 、简述动物细胞培养的过程、条件及应用。
2、比较动物细胞培养与植物组织培养区别。
【学习重点】1、动物细胞培养的过程、条件。
【自主学习】一、动物细胞工程常用的技术手段1、动物细胞工程常用的技术手段有哪几种？2、 ______________ 是动物细胞工程技术的基础。
二、动物细胞培养1、 动物细胞培养的概念（1） 动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，它分散成 _______________ ，后放在 _______________ 中，让这些细胞 ________________ 和 _______________ 。
（2） 动物细胞培养的原理是： __________________ 。
2、 动物细胞培养的过程 （1）基本概念① 什么是细胞贴壁？② 什么是接触抑制？③ 什么是原代培养？什么是传代培养?说明：分瓶之前，称原代培养；出现接触抑制用胰蛋白酶处理，再分瓶培养为传代培养。
（2）过程胰虫白酶，细胞悬液一细胞株或细胞系幼龄动物组织或胚胎剪碎胰蛋白酶*单个细胞---- 细胞悬液原代培养・细胞贴壁生长【思考探究】①为什么选用幼龄的动物组织或胚胎?②如何使组织分散为单个细胞？这说明细胞间的物质是什么？能不能用胃蛋白酶？③制成细胞悬液的主要目的是什么？④培养细胞的培养瓶或培养皿应具备什么条件？⑤贴满瓶壁的细胞要如何处理才能继续培养？⑥目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常为10代以内的，为什么？10〜50代,50 代以后细胞有什么变化？【例1】下列有关动物细胞培养的叙述中正确的是（）A、动物细胞培育的目的是获得大量的细胞分泌蛋白B、动物细胞培养前要用胰蛋白酶使细胞分散C细胞的癌变发生于原代培养向传代培养的过渡过程中D培养至50代后的传代细胞称为细胞株3、动物细胞培养的条件①无菌、无毒的环境采取什么措施保证无菌、无毒的环境？②营养什么是合成培养基？培养动物细胞时为什么要加入血清、血浆？③温度和PH适宜的温度一般为________________ ;适宜的PH—般为 ____________________④气体环境细胞培养所需气体主要为Q和CQ,它们分别有什么作用？4、动物细胞培养技术的应用①生产生物制品：疫苗、干扰素、单克隆抗体等；②作为基因工程中的受体细胞；③检测有毒物质及毒性；④科研方面：筛选抗癌药物、治疗和预防疾病等。
动物细胞培养
概念动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
细胞培养是指细胞在体外条件下的生长，动物细胞在单独细胞培养的过程中不再形成个体。
2简介动物细胞培养液的成分体外细胞培养所需营养物质与体内基本相同，例如，需要糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素等。
将细胞所需的上述物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。
由于动物细胞生活的内环境还有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入动物血清以提供一个类似生物体内的环境，因此在使用合成培养基时，通常需加入血清、血浆等一些天然成分。
[1]动物细胞培养液的特点液体培养基、通常含动物血清。
动物细胞培养的条件1.无菌、无毒的环境：对培养液和所有培养用具进行无菌处理，通常还要在培养液中加入一定量的的抗生素，以防被污染。
此外应定期更换培养液，以便清除代谢产物防止细胞代谢产物累积对细胞自身产生危害。
2.营养物质：无机物（无机盐、微量元素等），有机物（糖、氨基酸、促生长因子等）3.血清和血浆(提供细胞生长必须的营养成份)4.温度和pH（36.5±0.5℃，7.2~7.4）5.气体环境（95%的空气+5%CO动物细胞培养2的混合气体）其中5%CO2气体是为保持培养液的pH稳定基本过程取动物胚胎或幼龄动物器官、组织。
将材料剪碎，并用胰蛋白酶（或用胶原蛋白酶）处理（消化），形成分散的单个细胞，将处理后的细胞移入培养基中配成一定浓度的细胞悬浮液。
悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，成为细胞贴壁。
当贴壁细胞分裂生长到互相接触时，细胞就会停止分裂增殖，出现接触抑制。
此时需要将出现接触抑制的细胞重新使用胰蛋白酶处理。
再配成一定浓度的细胞悬浮液。
另外，原代培养就是从机体取出后立即进行的细胞、组织培养。
当细胞从动植物中生长迁移出来，形成生长晕并增大以后，科学家接着进行传代培养，即将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增殖。
动物细胞培养
能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？
不能，因为动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0） 没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。
动物组织块
动
用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
物 分散成单个细胞
细 胞
制成细胞悬液
原代培养：细胞或组织离开机体后的首次培养
培
养
原代培养
的
过
程
体外培养的细胞表现为哪些特点？ 细胞贴壁：在培养瓶 悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上。
培养皿
培养瓶
培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于贴附。 所有的动物细胞都会贴壁生长吗？
接触抑制 解除方法 分瓶培养 贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。
p H ： 多数细胞生存的适宜pH在7.2-7.4
气体环境 O2: 细胞代谢所必需的 （95%空气和 CO2：维持培养液的pH 5% CO2 ）
CO2 培养箱
动物细胞培养的过程 选择什么样的细胞进行细胞培养？
幼龄动物的细胞和分化程度低的细胞更容易培养，原因是这些细胞分裂 能力强。
动物细胞以组织的形式存在，取材后对其进行怎样的处理？
水、无机盐、糖类、氨基酸、无机盐、维生素、生长因子等
合成培养基 根据细胞生存所需的物质种类和含量严格配置而成的培养基
天然培养基 主要来自动物体液或动物组织分离提取液，成分复杂，来源受限 实际培养时，在合成培养基中添加一定比例的动物血清
动物血清：含有多种未知的促细胞生长因子及其 他活性物质，可以补充合成培养基中缺乏的物质
动物细胞培养
动物细胞培养细胞培养是指细胞在体外条件下的生长，动物细胞在培养的过程中不再形成组织。
1.概念动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
2.动物细胞培养的简介1.动物细胞培养液的成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。
动物细胞培养成功的关键在于培养液中是否含有动物血清，因为由于动物细胞生活的内环境还有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入动物血清以提供一个类似生物体内的环境，此外动物血清中也包含了一些动物的激素和酶，可以促进细胞的发育。
2.动物细胞培养液的特点：液体培养基、含动物血清。
3.动物细胞培养的条件：①无菌、无毒的环境：对培养液和所有培养用具进行无菌处理，通常还要在培养液中加入一定量的的抗生素，以防被污染。
此外应定期更换培养液，以便清除代谢产物防止细胞代谢产物累积对细胞自身产生危害。
②营养物质：无机物（无机盐、微量元素等），有机物（糖、氨基酸、促生长因子、血清、血浆等）③温度和pH（36.5±0.5℃，7.2~7.4）④气体环境（95%的空气+5%CO动物细胞培养2的混合气体）3.基本过程取动物胚胎或幼龄动物器官、组织。
将材料剪碎，并用胰蛋白酶（或用胶原蛋白酶）处理（消化），处理形成单个细胞，将单个的细胞放入培养基中配成一定浓度的细胞悬浮液。
悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，成为细胞贴壁。
当贴壁细胞分裂生长到互相接触时，细胞就会停止分裂增殖，出现接触抑制。
此时需要将出现接触抑制的细胞重新使用胰蛋白酶处理。
再配成一定浓度的细胞悬浮液。
另外，原代培养就是从机体取出后立即进行的细胞、组织培养。
当细胞从动植物中生长迁移出来，形成生长晕并增大以后，科学家接着进行传代培养，即将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增殖。
通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞称为细胞株。
动物细胞培养技术
还含有一些供贴附型细胞在培养皿表面贴附和铺展的生长基质成份，
如纤粘连蛋白、层粘连蛋白等；
种类：牛、人、马、兔、猪、羊血清，最常用的是胎牛血清与新生牛
血清；
血清的使用浓度一般为5％～20％，常用浓度为10％；
使用前必须经过鉴定，只有无菌、无支原体、无内毒素、无溶血或低
HEPES 对细胞无毒性，能防止pH迅速变动，其最大优点是在进行活细胞
观察时能维持较恒定的pH。
4、 气体
❖ 气体：需要O2、CO2
O2
（95%空气、5% CO2）
：参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增
殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。
❖低于大气压的氧压适于细胞株生长；
❖高氧压（高达95%）适于器官培养，但对于胚胎
从原代培养的细胞继续转接培养称继代培养.
4、细胞系(cell line)：由原代细胞培养后经初步纯化，
获得的以一种细胞为主、能在体外长期生存的不均一
的细胞群体，一般为有限细胞系。
5、细胞株(cell strain)：细胞系经过克隆或其他方法
获得、由单细胞形成的单一类型的细胞群体。
有限细胞系(infinited cell line)：不能连续培养的
溶血、蛋白质及必需营养素达到一定标准以上的血清才能使用。
➢
水解乳蛋白和胶原
➢ 另外两种较好的天然培养基成分；
➢ 水解乳蛋白：乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产
物，呈淡黄色粉末状，富含氨基酸；
➢ 胶原：从动物真皮中提取的，具改善细胞表面特
性促使其附着生长的作用。
❖人工合成培养基
➢ 平衡盐溶液（Balanced salt solution，BSS）：
动物细胞培养
第二章
细胞工程
第一节动物细胞培养
什么叫细胞工程？
细胞工程是指应用细胞生物学和分子 生物学的原理和方法，通过细胞水平或细 胞器水平上的操作，按照人们的意愿来改 变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一 门综合科学技术。
1.1细胞培养的概念
是细胞工程中最基础的技术， 它是把机体的某一组织或器官取 出，分散为单个细胞，使其在人 工培养条件下继续生存、生长、 甚至增殖的过程。
原理：细胞增殖
1.2动物细胞培养的条件：
1.无菌、无毒的环境: 培养液和所有培养用具进行无菌处理 措施：培养液中加抗生素，定期更换培养液 2.营养: 糖、氨基酸、无机盐、微量元素、促生长因
4．动物细胞工程常用的技术手段中，最基础的是 （ ） A.动物细胞培养 B.动物细胞融合 C.单克隆杭体 D.胚胎、核移植 5．在动物细胞培养中有部分细胞可能在培养条件下无 限制地传代下去，这种传代细胞称之为: A．原代培养 B．传代培养 C．细胞株 D．细胞系 6．卫生部2005年4月6日发布了《苏丹红危险性报告评 估》，报道中提到苏丹红一号是一种人工色素(工业染 料)，它在人体内代谢生成相应的胺类。科研人员欲采用 一定的技术手段探究苏丹红是否对人体有危害，你认为 采取下列哪种技术手段最合适： A．动物细胞融合 B．动物细胞培养 C．胚胎移植 D．核移植
5、在动物细胞培养的有关叙述中，正确的是（B ）
A．动物细胞培养的目的就是为了获得大量的细胞分 泌蛋白 B．动物细胞培养前要用胰蛋白酶处理使细胞分散 C．细胞遗传物质的改变发生于原代培养过程中 D．培养至50代后继续传代的细胞是细胞株 6、在动物细胞培养中有部分细胞可能在培养条件下无 限制地传代下去，这种传代细胞称之为（ D ） A．原代培养 B．传代培养
动物细胞培养
典型过程培养
动物细胞培养
低温下CO2溶解度增加，引起 溶解度增加，引起pH 温度 低温下 变化。 变化。 黏度 培养基的黏度主要受血清含量 的影响。 的影响。在搅拌条件下黏度大则细胞受 损伤小。 损伤小。加入羧甲基纤维素或聚己烯基 吡咯烷增加培养基黏度
典型过程培养
动物细胞培养
细胞培养基的基本组成 1、水 、 细胞培养用的各种液体都要用水来配置， 细胞培养用的各种液体都要用水来配置，对水 的纯度要求很高。 的纯度要求很高。通常细胞培养用水的污染物 标准可参考医药上注射用水标准， 标准可参考医药上注射用水标准，单原则上应 高于注射用水标准。 高于注射用水标准。 2、能源和碳源 、 主要是糖和糖酵解的产物和谷氨酰胺。 主要是糖和糖酵解的产物和谷氨酰胺。细胞能 用的糖主要是六碳糖，特别是葡萄糖。 用的糖主要是六碳糖，特别是葡萄糖。葡萄糖 很容易被大多数细胞转化为乳酸。 很容易被大多数细胞转化为乳酸。昆虫细胞更 偏爱蔗糖。 偏爱蔗糖。在多数培养基中谷氨酰胺作为主要 的能源和碳源。 的能源和碳源。使用谷氨酰胺最大的问题是它 的自发降解，降解量与时间、温度、 的自发降解，降解量与时间、温度、血清和磷 酸浓度有关，降解产物为氨，对细胞有毒性。 酸浓度有关，降解产物为氨，对细胞有毒性。
典型过程培养
动物细胞培养
转化细胞由于有无限寿命， 转化细胞由于有无限寿命，在培养中更 易生长，被广泛用于生成生物制品， 易生长，被广泛用于生成生物制品，如 重组蛋白药物、病毒疫苗等。但是， 重组蛋白药物、病毒疫苗等。但是，人 们对她们的安全性仍然非常关心， 们对她们的安全性仍然非常关心，对可 能造成的生物危害性进行严格的检测和 控制。 控制。
典型过程培养
动物细胞培养
一、动物细胞培养的特性 动物细胞培养是指在合适的培养条件下， 动物细胞培养是指在合适的培养条件下， 动物细胞离体生长和增殖， 动物细胞离体生长和增殖，并保持其特性 和功能的技术，这些细胞不再形成组织。 和功能的技术，这些细胞不再形成组织。
动物细胞培养
（2）消化分离法
组织消化法是在把组织剪切成较小体积的基础上，应用 生化和化学手段进一步分散组织的方法。 1）胰蛋白酶（Trypsin ）消化法 胰蛋白酶适于消化细胞间质较小的软组织，如胚胎组织、 羊膜、上皮组织、肝、肾等软组织，对传代细胞也非常好。 2）胶原酶（Collagenase）消化法： 胶原酶是一种由细菌中提取出的酶，对胶原有很强的消化 作用，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等。上皮 细胞本身对胶原酶有一定耐性，但胶原酶对细胞间质有好的 消化作用，可使上皮细胞与胶原成分脱离而不受伤害，效果 甚好。
移液器
离心机
酶标仪
微孔板震荡器
液氮罐
（二）动物细胞的体外培养一般条件
1、恒定的温度: 37 ℃
2、pH：最适为7.2～7.4
3、气体：需要O2、CO2 （95%空气、5% CO2） 4、营养：要求高，需要氨基酸、维生素、辅酶、核酸、嘌 呤、嘧啶、激素和生长因子等。
（1）血清：
主要为牛（胎牛、新生牛、小牛）、马、鸡、兔、羊、
每代细胞（群体）要经过四个生长阶段：
1、潜伏期（latent phase）： 接种——悬浮——贴附——不马上分裂（潜伏）。 潜伏期特点：长短与细胞接种密度、种类、使用培养基 性质有关。 2、对数生长期（logarthmic growth phase）： 分裂旺盛、分裂相增多（其数量标志分裂的旺盛 程度）。 细胞分裂指数（mitotic index, MI）: MI=(分裂相个数∕1000个细胞) ×100% 。
动物细胞体外培养
Animal cells cultured in vitro
一、基本概念
动物体内取出组织，分离出单细胞，在体外 模拟机体内的生理条件，建立无菌、适温和一 定的营养条件，使之生长和生存，并维持其结 构和功能的技术，称动物细胞体外培养。 是动物细胞工程的重要技术基础：细胞融合、 组织工程、胚胎工程、干细胞工程、动物克隆、
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早期重组胚胎
b
另一头绵羊的子宫 妊娠、出生 克隆羊多利
3.多利面部毛色 是：白色
黑面绵羊去 核卵母细胞
白面绵羊乳 腺细胞核
根据遗传学原理 说明判断依据： 多利全部的核基因 都来自白面绵羊
4.若黑面绵羊的基因 型为AA，白面绵羊的 基因型为aa，则克隆 羊的基因型为：aa
a
重组细胞 电脉冲刺激
早期重组胚胎
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官 胰蛋白酶处理 原代培养特点：细 单个细胞 加培养液稀释 原代
胞贴壁、接触抑制
配置细胞悬液
转入培养瓶 分瓶
培养
遗传物质 未改变
细胞株 遗传物 质已改 变 细胞系
10代细胞 50代细胞 无限传代
传代 培养
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官 胰蛋白酶处理 传代10代以内， 单个细胞 加培养液稀释 遗传物质不改
5.动物细胞培养技术的应用
1.蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体 2.应用于基因工程 主要用于作为受体细胞 3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性 4.培养正常或各种病变的细胞，用于细 胞的生理、药理、病理研究 如用于筛选抗癌药物
植物组织培养和动物细胞培养的比较
比较项目 原理 培养基性质 培养基特有成分 培养结果 培养目的 植物组织培养 动物细胞培养 细胞的全能性 细胞增殖 固体培养基 液体培养基 蔗糖 植物激素 葡萄糖 动物血清 植物体 细胞株、细胞系 快速繁殖、培育 获得细胞或细胞 无病毒植株 分泌蛋白 植物幼嫩部分或 胚胎或幼龄动物 花药 的器官或组织 无菌无毒，适宜 无菌无毒，适宜 条件 条件
5.体细胞核移植技术的应用前景
1.在畜牧业中可 以加速家畜遗传 改良的进程。
2.保护濒危物种。
3.医药卫生领域：克 隆动物作为生物反应 器，生产医用蛋白； 治疗人类疾病，作为 组织器官移植的供体。
治疗人类疾病，作为组织器官移植的供体 主要的优 点是？
不发生免疫 排斥反应
◆研究克隆动物和克隆细胞更了解 胚胎发育及细胞衰老过程；克隆动 物做疾病模型，更好追踪研究疾病 的发展过程和治疗疾病。
等；通常还需加血浆、血清等天然成分。 适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度 3）温度和pH：
为36.5±0.5℃ 适宜的酸碱度：PH：7.2-7.4
“95％空气+5％CO2”的混合气体培养箱。 4）气体环境： 氧气是细胞代谢必须的； CO 维持培 2
养液的pH。
动物细胞培养液的主要成分是什么？ 较植物组培培养基有何独特之处？
D
动物细胞培养要经过脱分化？为什么？
一般而言，动物细胞培养不需经过 脱分化过程。因高度分化的动物细 胞发育潜能变窄，失去了发育成完 整个体的能力，所以，动物细胞也 就没有类似植物组织或细胞培养时 的脱分化过程了。要想使培养的动 物细胞定向分化，通常采用定向诱 导动物干细胞，使其分化成所需要 的组织或器官。
◆受体细胞为什么 选用卵母细胞？
卵母细胞体积 大，易操作； 含有促使细胞 核表达全能性 的物质和营养 条件。
◆为什么必须先去 掉卵母细胞的核?
◆为使核移植动物 减数第二次分裂中期的卵母 的遗传物质全部来 ◆为什么使用去 细胞才具有受精的能力，其 核的减数第二次 自有利用价值的动 内含有生物生长发育的全部 分裂中期细胞 物提供的细胞。 信息及营养，且有助于动物
细胞核移植
卵裂 早期胚胎 C母绵羊子宫 妊娠 分娩 多莉羊
胚胎移植
1.写出a b所代 表细胞工程名称： a表示： 核移植
b表示： 胚胎移植
黑面绵羊去 核卵母细胞
白面绵羊乳 腺细胞核
a
重组细胞 电脉冲刺激
2.实施细胞工程时， 所需受体细胞大多采 用卵母细胞的原因： 体积大，易操作。含有 促使细胞核表达全能性 的物质和营养条件。
怎样才能使动物体细胞表现出全能性呢？
利用动物体细胞核移植技术
二、动物体细胞核移植技术和克隆动物
1.定义： 动物核移植是将动物的一个细胞的 细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细 用核移植的方法得到的 胞中。使其重组并发育成一个新的胚胎，这 动物称为克隆动物 个新的胚胎最终发育为动物个体。
2.原理： 动物细胞核具有全能性
■当贴壁细胞分裂 生长到表面相互接 触时，细胞就会停 止分裂增殖，这种 现象称为细胞的接 触抑制。
胚胎或幼龄动物的器官组织 定义：人们通 取出组织 常将动物组织 剪碎组织 消化后的初次 胰蛋白酶或胶原 培养称为原代 蛋白酶处理 培养 单个细胞
加培养液
制成细胞悬液
转入培养瓶内培养 （细胞贴壁；接触抑制）
目前使用的或冷冻保存的正常 细胞通常在10代以内，为什么？ 10代以内的细胞遗传物质不 改变，保持正常二倍体核型。
4.动物细胞培养的条件
对培养液和所有培养用具无菌处理；培养液 1）无菌、 中添加抗生素防止培养过程中污染；定期更 换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞 无毒的环境： 造成危害。
液体合成培养基：（葡萄糖、氨基酸）、 2）营养： 促生长因子、（水、无机盐、微量元素）
主要成分：葡萄糖、氨基酸、水、无机 盐、维生素和动物血清等。
独特之处有：1.液体培养基 2.成分中有动物血清等
加入动物血清原因：提供一个类似 生物体内的环境；含营养物质（如 生长因子）促进细胞发育。
用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间物 质主要成分是什么？用胃蛋白酶行吗 ？ 在进行动物细胞培养时，用胰蛋 白酶分散细胞，说明细胞间的物质 主要是蛋白质。 动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4， 此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性， 而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。
b
另一头绵羊的子宫 妊娠、出生 克隆羊多利
黑面绵ห้องสมุดไป่ตู้去 核卵母细胞
白面绵羊乳 腺细胞核
5.多莉羊的成功 证明了什么？ 细胞核具有全能性；
细胞质具有调控细胞 核发育的作用。
a
重组细胞 电脉冲刺激
早期重组胚胎
b
另一头绵羊的子宫 妊娠、出生 克隆羊多利
胚胎移植技术
试管动物（婴儿）培养过程
卵细胞
精子
体外受精
细胞 培养 去 核 体细胞
受精 卵
重组 细胞
注入
去核卵 母细胞
细胞
融合
卵巢卵母细 胞（MⅡ中期： 供质）
生出与供体奶 牛遗传物质基 本相同的犊牛
代孕 母体
胚胎 移植
构建重 组胚胎
共分成两大阶段：核移植和胚胎移植
B母绵羊
A母绵羊 乳腺细胞
多 莉 羊 的 培 育 过 程
卵细胞
细胞质
细胞核 融合后的卵细胞
6.体细胞核移植技术存在的问题
（1）成功率仍然非常低，产下的活 克隆动物比率平均不到10%。 （2）绝大多数克隆动物还存在健康 问题，许多克隆动物表现出遗传和生 理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发 育困难，免疫失调等。
（3）对克隆动物食品的安全性问题 也存有争议。
用于动物细胞培养的组织和 细胞大都取自胚胎或出生不久 的幼龄动物的器官或组织，其 主要原因是这样的组织细胞 A.容易产生各种变异 B.具有更强的全能性 C.取材十分方便 D.分裂增殖的能力强
细胞核全能性的表达。
（MⅡ中期）？
因为在这个时候去核的话对 卵细胞损伤最小，距离很近， 便于去核。
◆为什么不是取供体 细胞核进行核移植操 作，而是直接将供体 细胞整个注入去核卵 母细胞中？
保证供核不被破坏， 使所得个体的性状 更符合供体。
◆激活 方法： ◆激活 目的：
◆促融方法： 电刺激 构建重组胚胎
动物细胞培 养的原理： 变，保持正常 细胞增殖 二倍体核型。
配置细胞悬液
转入培养瓶 分瓶
继续传代培养少部 分细胞获得不死性， 10代细胞 细胞突变，遗传物 40-50代细胞 质已经改变，等同 于癌细胞。 无限传代
原 代 培 养
传 代 培 养
遗细 传胞 物株 质： 未一 改般 变说 已遗细 改传胞 变物系 质：
A
知识结构
动物细 胞培养 和核移 植技术
动物细胞培养 动物体 细胞核 移植技 术和克 隆动物
核移植技术和克隆动物的概念 体细胞核移植技术的过程 体细胞核移植技术的应用前景 体细胞核移植技术存在的问题
胚胎细胞分化程 度低，恢复其全 能性相对容易 动物体细胞分化 程度高，恢复其 全能性十分困难
胚胎细胞核移植、体细胞核移植 3.分类：
4.体细胞核移植的过程
供体：优质高产奶牛
◆为何取供体细 胞传代培养10代 以内的细胞？
10代以内的细胞 一般保持正常二 倍体的核型，未 发生突变。
受体：普通奶牛（卵母细胞采集与培养）
原代 培养
动物组织块 幼龄动物的器官组织；动物胚胎
胰蛋白酶处理分散成单个细胞
加入培养液
细胞悬液
适宜条件
原代培养（细胞贴壁；接触抑制）
用胰蛋白酶等处理贴壁细胞； 分瓶继续培养。
传代培养
传代培养
当原代培养的细胞处 于接触抑制后，用胰蛋白酶处理，使 细胞从瓶壁上脱离下来，然后加入新 的培养液，将细胞分离稀释，并从原 培养瓶内转接到新的培养瓶内，这个 过程称传代培养（分瓶培养的过程）。
1、在动物细胞培养过程中遗传 物质发生改变的细胞是 A．细胞系 B．细胞株 C．原代细胞 D．传代细胞
A
2、动物细胞工程技术的基础是 A.动物细胞融合 B.单克隆抗体 C.胚胎移植 D.动物细胞培养
D
4.动物细胞培养与植物细胞培养 的重要区别在于 A.培养基不同； B.动物细胞培养不需要在无菌条 件下进行； C.动物细胞可以传代培养，而植 物细胞不能； D.动物细胞能够大量培养，而植 物细胞只能培养成植株。
其它动物细胞工程的基础
动物 细胞 工程 常用 技术
动物细胞培养