【CN109880850A】一种双转基因斑马鱼生物传感器及其构建方法和应用【专利】
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(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910162596.8
(22)申请日 2019.03.05
(71)申请人 北京大学深圳研究生院
地址 518000 广东省深圳市南山区西丽街
道深圳大学城北大园区H栋208室
(72)发明人 李松 秦伟
(74)专利代理机构 广州三环专利商标代理有限
公司 44202
代理人 肖宇扬 付静
(51)Int.Cl.
C12N 15/85(2006.01)
A01K 67/027(2006.01)
G01N 21/64(2006.01)
(54)发明名称
一种双转基因斑马鱼生物传感器及其构建
方法和应用
(57)摘要
本发明公开一种双转基因斑马鱼生物传感
器：包括水环境系统和生活在所述水环境系统中
的双转基因斑马鱼，双转基因斑马鱼同时携带
BAC vtg1-cre -rfp和l -fabp -loxP -STOP -loxP -
gfp基因。
本发明提供的双转基因斑马鱼生物传
感器，能够用于监测环境中的多种不同内分泌干
扰物，具有较高的灵敏度；其监测结果不仅能够
用于判断水体是否发生污染，并且能够揭示水体
污染发生的时期。
权利要求书2页 说明书16页序列表2页 附图1页CN 109880850 A 2019.06.14
C N 109880850
A
权 利 要 求 书1/2页CN 109880850 A
1.一种双转基因斑马鱼生物传感器，其特征在于：包括水环境系统和生活在所述水环境系统中的双转基因斑马鱼，所述双转基因斑马鱼同时携带BACvtg1-cre-rfp和l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp基因。
2.如权利要求1所述双转基因斑马鱼生物传感器，其特征在于：所述水环境系统中含有浓度为5×10-5-3×10-4mol/L的1-苯基-2-硫脲。
3.一种如权利要求1所述双转基因斑马鱼生物传感器的构建方法，其特征在于：以携带l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp基因的转基因斑马鱼和携带BACvtg1-cre-rfp基因的转基因斑马鱼互为亲本杂交育种得到所述双转基因斑马鱼。
4.如权利要求3所述双转基因斑马鱼生物传感器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用cre序列、vtg1序列、pRFP序列和含有ere的序列构建ere-vtg1:rfp/cre质粒，将所述ere-vtg1:rfp/cre质粒线性化后显微注射到斑马鱼胚胎细胞中，孵育，得到Tg(ere-vtg1:cre/rfp)转基因斑马鱼；
(2)利用l-fabp序列、loxP-STOP-loxP序列和pGFP序列构建Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)质粒，将所述l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp质粒线性化后显微注射到斑马鱼胚胎细胞中，孵育，得到Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)转基因斑马鱼；
(3)分别筛选出携带BAC vtg1-cre-rfp纯合子基因的所述Tg(ere-vtg1:cre/rfp)转基因斑马鱼和携带l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp纯合子基因的所述Tg(l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp)转基因斑马鱼后，使其进行杂交，得到所述双转基因斑马鱼；
(4)使所述双转基因斑马鱼进行繁殖传代，直至筛选出同时携带所述BACvtg1-cre-rfp 纯合子基因和所述l-fabp-loxP-STOP-loxP-gfp纯合子基因的双转基因斑马鱼。
5.如权利要求4所述双转基因斑马鱼生物传感器的构建方法，其特征在于，利用以下引物扩增所述cre序列：
上游引物，5’-GCTGCAAGCTTAATAGCCGACCAGTGCTTGTGAT-3’；
下游引物，5’-CTCGGATCAGCTCAAGGACCCCACTTT-3’。
6.如权利要求4所述双转基因斑马鱼生物传感器的构建方法，其特征在于，利用以下引物扩增所述vtg1序列：
上游引物，5’-CGATCACCTCTCAGTGAGGTGACTGGACGTA-3’；
下游引物，5’-CTGAAGGCAAGGCGCATCGACACCGGTATCG-3’。
7.如权利要求4所述双转基因斑马鱼生物传感器的构建方法，其特征在于，利用以下引物扩增所述l-fabp序列：
上游引物，5’-TATAGCCGTACGTACGTGCAAT-3’；
下游引物，5’-CAGTCAGTCGTCGATCGGTCA-3’。
8.如权利要求4所述双转基因斑马鱼生物传感器的构建方法，其特征在于，利用以下引物扩增所述loxP-STOP-loxP序列：
上游引物，5’-CGATCACCTCTCAGTGAGGTGACTGGACGTA-3’；
下游引物，5’-CTGAAGGCAAGGCGCATCGACACCGGTATCG-3’。
9.如权利要求4所述双转基因斑马鱼生物传感器的构建方法，其特征在于，利用以下引物扩增所述含有ere的序列：正链，5’-TAACTTTGATCAGGTCACTGTGACCTGACTTTGGACAGT-3’；反
2。