重组阿达木单抗Fab片段在大肠杆菌中的制备方法[发明专利]

(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201410066863.9
(22)申请日 2014.02.26
C12N 15/70(2006.01)
C07K 16/24(2006.01)
C07K 1/16(2006.01)
(71)申请人上海美迪西生物医药有限公司
地址201299 上海市浦东新区川大路585号
(72)发明人吕立力 范丽君 汪俊 陈春麟
(74)专利代理机构上海瀚桥专利代理事务所
(普通合伙) 31261
代理人
曹芳玲 郑优丽
(54)发明名称
重组阿达木单抗Fab 片段在大肠杆菌中的制
备方法
(57)摘要
本发明涉及一种重组阿达木单抗Fab 片段在
大肠杆菌中的制备方法，包括：将由N 端分别带有
信号肽的Fab 片段的重链Fd 与轻链的氨基酸序
列反转化的基因克隆于带有双启动子的大肠杆菌
表达载体内构建重组表达载体；将所得的重组表
达载体转化至作为宿主细胞的大肠杆菌获得重组
菌，培养所述重组菌并在培养基中加入诱导剂诱
导双基因共分泌表达获得经诱导表达的菌体；通
过渗透压冲击法提取经诱导表达的菌体的周质蛋
白；对所得的周质蛋白进行色谱柱纯化，即可得
到阿达木单抗的Fab 片段。

本发明可制得较高纯
度的Fab 片段，且能与抗原TNF-α特异性结合，其
抑制效果与全抗分子相比无明显的差异，说明该
Fab 片段保留了原adalimumab 抗体具备的抗体性
质和特异性。

(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书7页序列表3页 附图4页
(10)申请公布号CN 104862328 A (43)申请公布日2015.08.26
C N 104862328
A
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1.一种重组阿达木单抗Fab 片段在大肠杆菌中的制备方法，其特征在于，包括：
（a ）将由N 端分别带有信号肽的Fab 片段的重链Fd 与轻链的氨基酸序列反转化的基因克隆于带有双启动子的大肠杆菌表达载体内构建重组表达载体；
（b ）将所得的重组表达载体转化至作为宿主细胞的大肠杆菌获得重组菌，培养所述重组菌并在培养基中加入诱导剂诱导双基因共分泌表达获得经诱导表达的菌体；
（c ）通过渗透压冲击法提取经诱导表达的菌体的周质蛋白；
（d ）对所得的周质蛋白进行色谱柱纯化，即可得到阿达木单抗的Fab 片段。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤（a ）中，Fab 片段的重链的N 端的信号肽为OmpA 氨基酸序列；Fab 片段的轻链的N 端的信号肽为PelB 氨基酸序列，或其他大肠杆菌来源的分泌信号肽序列。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在步骤（a ）中，Fab 片段的重链的C 端连接有蛋白酶TEV 酶切位点和组氨酸融合标签。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤（a ）中，所述重组表达载体包括：两个大肠杆菌启动子、复制子、抗生素筛选标记、多克隆酶切位点、两个核糖体识别位点、和两个终止子。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤（b ）中，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)Star 或其表达菌株。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤（b ）中，所述诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷，其在培养基中的终浓度为0.2mmol/L 。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤（c ）中，在所述大肠杆菌生长至对数生长期时提取其周质蛋白。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤（c ）中，所述渗透压冲击法包括：先将步骤（b ）所得的重组菌中加入20%的蔗糖高渗溶液再转移至5mmol/L 无机盐低渗溶液中。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述蔗糖高渗溶液含有50mmol/L Tris-HCl 和2.5mmol/L EDTA ；所述无机盐低渗溶液为5mmol/L 的MgCl 2溶液。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤（d ）中，所述色谱柱纯化依次包括：亲和柱层析、阳离子交换树脂层析、和分子筛介质层析；其中所述亲和柱层析的亲和层析介质为Ni-NTA ；所述阳离子交换树脂层析的阳离子交换介质为SP-FF ；所述分子筛介质层析的分子筛层析介质为Superdex 200。

权 利 要 求 书CN 104862328 A
重组阿达木单抗Fab片段在大肠杆菌中的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种全人源重组阿达木单抗（adalimumab）Fab片段在大肠杆菌中的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术
[0002] 类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性侵蚀性关节炎为特征的自身免疫炎性疾病，致残率较高。

在RA患者的滑膜液中TNF-α水平升高，其在病理性炎症和关节破坏方面起重要作用，因此TNF-α抑制剂可以用于治疗RA。

由于抗体的高度特异性，抗TNF-α中和性单抗(mAb)作为二者之间的拮抗剂而成为研究的热点。

当前单克隆抗体药物或抗体偶联药物已成为制药行业中增长最快、获利最大的市场之一。

随着临床治疗用单抗大量上市，未来临床治疗用单抗制造的需求也相当可观，抗体临床治疗成功的病例也屡见不鲜。

阿达木单抗（adalimumab）由Abbott/CAT公司开发（US6090382），是首个利用噬菌体展示技术获得的全人源抗TNF-α的抗体。

可特异性地与TNF-α结合，阻断其与p55和p75细胞表面TNF-α受体的相互作用。

用于缓解抗风湿性药物治疗无效的结构性损伤的中至重度RA成年患者的体征与症状。

[0003] 治疗性抗体是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的药物，其在感染、心血管疾病、自身免疫性疾病、肿瘤治疗中有巨大的潜力与应用前景。

治疗性抗体药物研发已成为生物技术药物领域的热点，而抗体药物作用靶点的选择性、抗体药物的人源化、小型化和高效化也是今后研究的重点。

[0004] 由于高度确定的结构完整性和功能多样性，治疗性抗体结合抗原就可以实现疗效，抗原结合片段Fab分子成为IgG抗体的生产和定向改造首选的分子形式。

抗体Fab片段由重链Fd段和完整的轻链组成，是完整抗体分子的三分之一，属于小分子抗体，穿透力强，半衰期短。

Fab片段的重链Fd和完整轻链通过一个链间二硫键连接，形成异二聚体（图1）。

在B细胞的粗面内质网中，可变区立体折叠，链内二硫键形成，从而轻链和重链可变区两个分子间相互作用，形成正确的立体构象。

Fab片段的主要优势之一是其适合在大肠杆菌中表达，IgG全抗体因其分子量大及其CH2区需要糖基化修饰而主要用哺乳动物细胞来表达。

大肠杆菌原核表达系统不仅成本低周期短，有利于DNA重组技术高效率的引入突变，短时间内提高Fab的表达量、稳定性、溶解度，而且与相应的单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)相比具有更高的抗体亲和力和稳定性。

发明内容
[0005] 面对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种在大肠杆菌中高效地获得高质量重组阿达木单抗Fab片段的制备方法。

本发明人经研究发现，通过对宿主细胞、表达载体、表达条件和纯化条件等进行改造与优化，将有可能获得基因工程抗体的高效表达。

[0006] 在此，本发明提供一种重组阿达木单抗Fab片段在大肠杆菌中的制备方法，包括：（a）将由N端分别带有信号肽的Fab片段的重链Fd与轻链的氨基酸序列反转化的基因
克隆于带有双启动子的大肠杆菌表达载体内构建重组表达载体；
（b）将所得的重组表达载体转化至作为宿主细胞的大肠杆菌获得重组菌，培养所述重组菌并在培养基中加入诱导剂诱导双基因共分泌表达获得经诱导表达的菌体；
（c）通过渗透压冲击法提取经诱导表达的菌体的周质蛋白；以及
（d）对所得的周质蛋白进行色谱柱纯化，即可得到阿达木单抗的Fab片段。

[0007] 本发明运用基因工程等技术手段，将全人源抗TNF-α抗体的Fab抗体片段重链Fd 与轻链基因连接信号肽并克隆于带有双启动子的大肠杆菌表达载体内，在大肠杆菌中原核表达，提取经表达大肠杆菌周质蛋白再进行纯化，得到有活性的人源阿达木单抗的Fab可溶性表达产物。

经本发明方法获得的全人源单克隆抗体阿达木单抗的Fab片段的活性分析结果显示可制得较高纯度的Fab片段，且能与抗原TNF-α特异性结合，其抑制效果与全抗分子相比无明显的差异，说明该Fab片段保留了原adalimumab抗体具备的抗体性质和特异性；而该Fab片段分子量低，容易到达靶部位，另外该Fab片段可以在大肠杆菌中大规模表达生产，效率高且成本相对较低。

[0008] 本发明中，选用双启动子表达载体共分泌表达，易于构建，可大量表达。

[0009] 本发明中，以大肠杆菌为宿主菌，大肠杆菌周质腔有类似于内质网的环境，将重链Fd和轻链的5’端连接细菌蛋白的前导肽（信号肽），在其引导作用下表达的蛋白可以分泌到周质腔，前导肽被前导肽酶特异切割，生成的N末端为天然蛋白的重链Fd和轻链在周质腔内完成折叠、形成正确的链内和链间二硫键，成为有生物学活性的Fab片段。

而且，大肠杆菌原核表达载体，生产快速且便于纯化，降低生产成本，增加产品竞争力。

[0010] 本发明中，利用渗透压冲击法提取经诱导表达的菌体周质蛋白，只破坏大肠杆菌外膜而不损害内膜。

此外，通过渗透压冲击法提取周质蛋白后的蛋白悬液，去除了50%以上宿主菌蛋白和蛋白聚合物，利于后续的纯化。

同时还可以保证抗体片段重链Fd和轻链稳定的结合。

[0011] 较佳地，在步骤（a）中，Fab片段的重链Fd的N端的信号肽为OmpA氨基酸序列；Fab片段的轻链的N端的信号肽为PelB氨基酸序列，或其他大肠杆菌来源的分泌信号肽序列。

在PelB和OmpA前导序列和轻链、重链Fd不同排列组合中，采用PelB+轻链-OmpA+重链Fd的构建形式Fab分泌表达产量最高。

[0012] 较佳地，在步骤（a）中，Fab片段的重链Fd的C端连接有蛋白酶TEV酶切位点和组氨酸融合标签。

这样，可以有利于后续的蛋白检测及纯化。

[0013] 较佳地，在步骤（a）中，所述重组表达载体包括：两个大肠杆菌启动子、复制子、抗生素筛选标记、多克隆酶切位点、两个核糖体识别位点、和两个终止子。

[0014] 较佳地，在步骤（b）中，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)Star或其表达菌株。

[0015] 较佳地，在步骤（b）中，所述诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷，其在培养基中的终浓度为0.2mmol/L。

[0016] 较佳地，在步骤（c）中，在所述大肠杆菌生长至对数生长期时提取其周质蛋白。

这样，能够获得更多蛋白。

[0017] 较佳地，在步骤（c）中，中，所述渗透压冲击法包括：先将步骤（b）所得的重组菌中加入20%的蔗糖高渗溶液在转移至5mmol/L无机盐低渗溶液中。

较佳地，所述蔗糖高渗溶液含有50mmol/L Tris-HCl和2.5mmol/L EDTA；所述无机盐低渗溶液为5mmol/L的MgCl
2
溶液。

这样，能够获得更多蛋白并且污染少。

[0018] 较佳地，在步骤（d）中，所述色谱柱纯化依次包括：亲和柱层析、阳离子交换树脂层析、和分子筛介质层析。

通过这样的纯化，能够快速获得纯度大于98%的抗体蛋白，是一种操作简单方便，低成本、高产出的纯化制备方法。

[0019] 较佳地，在步骤（d）中，所述亲和柱层析的亲和层析介质为Ni-NTA。

[0020] 较佳地，在步骤（d）中，所述阳离子交换树脂层析的阳离子交换介质为SP-FF。

[0021] 较佳地，在步骤（d）中，所述分子筛介质层析的分子筛层析介质为Superdex200。

[0022] 本发明的制备方法稳定性好、操作简单、耗时短、所获得的Fab片段纯度高，为获得高质量的单克隆抗体Fab片段提供了有力的基础。

[0023] 由上述制备方法所制备的全人源单克隆抗体阿达木单抗的Fab片段可用于制备用于治疗与TNF-α水平升高有关的疾病的药物。

所述疾病包括类风湿性关节炎和癌症。

[0024] 根据本发明的制备方法制备的Fab片段分子量小，因此在到达肿瘤靶部位的过程中穿透力大。

Fab片段保留了全抗体对TNF-α的高特异性和高亲和力，并且其半衰期较同类药物长，可以减少药物的使用次数。

附图说明
[0025] 图1为Adalimumab Fab抗体片段结构示意图；
图2为Adalimumab Fab抗体片段重组表达载体结构示意图；
图3为示出Western Blot检测Adalimumab Fab抗体重链Fd在大肠杆菌中的分泌表达的图，其中的图A为在还原条件下电泳所得结果，图B为非还原条件下电泳所得结果；测试表明在大肠杆菌周质腔中存在较多分泌表达的Adalimumab Fab抗体重链Fd；
图4为示出Western Blot检测Adalimumab Fab抗体轻链VL在大肠杆菌中的分泌表达的图，其中的图A为在还原条件下电泳所得结果，图B为非还原条件下电泳所得结果；测试表明在大肠杆菌周质腔中存在较多分泌表达的Adalimumab Fab抗体轻链，且与重链Fd 形成二硫键结合的异二聚体；
图5为IMAC亲和纯化后的Fab SDS-PAGE电泳图；其中的图A为在还原条件下电泳所得结果，图B为非还原条件下电泳所得结果；Fab为IgG1抗原结合区重链Fd和轻链二聚体，还原条件下为两条电泳条带，非还原条件下在46kDa处有单一电泳条带；
图6为阳离子交换树脂纯化后的Fab SDS-PAGE电泳图，其中的图A为在还原条件下电泳所得结果，图B为非还原条件下电泳所得结果；
图7为分子筛层析纯化后的Fab SDS-PAGE电泳图，其中的图A为在还原条件下电泳所得结果，图B为非还原条件下电泳所得结果，表明获得的Fab抗体片段具有较高纯度；
图8为示出ELISA测定纯化的adalimumab Fab抗体片段与抗原TNF-α特异性结合能力及抗体活性的图。

具体实施方式
[0026] 以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图及下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

[0027] Fab片段由重链Fd和完整轻链组成，两者通过一个链间二硫键连接，形成异二聚
体（如图1所示）。

在B细胞的粗面内质网中，可变区立体折叠，链内二硫键形成，从而轻链和重链可变区两个分子间相互作用，形成正确的立体构象。

而大肠杆菌周质腔有类似于内质网的环境，将重链和轻链5’端分别连接细菌蛋白的前导肽，在其引导作用下表达的蛋白可以分泌到周质腔，前导肽被前导肽酶特异切割，生成的N末端为天然蛋白的Fd段和轻链在周质腔内完成折叠、形成正确的链内和链间二硫键，成为有生物学活性的Fab片段。

基于上述发现，本发明得以完成。

[0028] 具体地，作为示例，本发明的制备方法可以包括以下步骤。

[0029] （1）重组表达载体的构建
分别合成带有信号肽的Fab片段的重链与轻链的基因，克隆于带有双启动子的大肠杆菌表达载体（例如pETDuet-1载体）内，构建Adalimumab Fab抗体片段重组表达载体（Fab inpETDuet1）。

[0030] 优选地，在轻链和重链Fd的N端各加上一个独立的来自革兰氏阴性菌周质前导肽（信号肽）序列。

[0031] 在一个示例中，轻链之前添加PelB氨基酸序列：KYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA（SEQ ID NO.3），形成具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的前导肽-adalimumab Fab轻链（PelB-VL-CL）。

根据大肠杆菌原核表达系统进行密码子优化之后合成基因，克隆于带有双启动子的pETDuet-1载体内。

优选地，利用5’Ndel和3’Xhol插入于第一个启动子之后。

[0032] 在另一个示例中，在重链Fd段之前添加OmpA氨基酸序列：KKTAIAIAVALAGFATVAQA （SEQ ID NO.4）。

更优选地，为了利于后续的检测以及纯化，还可以在重链Fd段的C端设计组氨酸融合标签HHHHHH和蛋白酶TEV酶切位点ENLYFQS，形成具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的前导肽-adalimumab Fab重链-蛋白酶TEV酶切位点-His标签（OmpA-VH-CH1-TEV-His）。

根据大肠杆菌原核表达系统进行密码子优化之后合成基因，克隆于带有双启动子的pETDuet-1载体内。

优选地，利用5’端Ncol和3’端HindⅢ酶切位点插入于第二个启动子之后。

[0033] 所构建的Adalimumab Fab抗体片段重组表达载体的结构示意图如图2所示。

由图2可知，该重组表达载体包括：两个大肠杆菌启动子、复制子、抗生素筛选标记、多克隆酶切位点、两个核糖体识别位点、和两个终止子。

[0034] （2）Fab片段在大肠杆菌中的表达
Fab分子在大肠杆菌细胞质或细胞周质中表达时考虑到两个因素，一是避免被宿主本身表达的蛋白酶降解，二是促进二硫键形成。

因此，选择蛋白酶缺失或促二硫键形成的宿主有利于Fab的表达，尤其是可溶蛋白和分泌表达。

在一个优选的示例中，选用BL21(DE3) Star作为蛋白表达宿主菌，其以T7RNA聚合酶为表达系统可高效表达外源基因。

[0035] 将所得的重组表达载体转化至作为宿主细胞的大肠杆菌，并进行培养。

培养至一
）=0.6）时，加入诱导剂诱导重组表达载体的表达。

从而，所述重定程度（例如光密度（OD
600
组表达载体表达带有前导肽的L链和Fd段，引导至大肠杆菌周质空间的轻链和重链在酶的作用下特异性切割信号肽（PelB和OmpA），重链和轻链形成N末端是天然氨基酸序列的蛋白，两条链在周质腔的氧化环境中，通过二硫键的配对和形成，最终形成一个具有生物活性的蛋白分子。

[0036] 所述诱导剂包括但不限于异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）。

诱导优选为在低温例如
16℃进行。

诱导剂的加入量可以是使其在培养基中的终浓度为0.2mmol/L。

加入诱导剂后，可以在16℃，以180r/min振摇培养16小时生产Fab片段。

优选地，在所述大肠杆菌生长至对数生长期时收集菌体，进行下述的其周质蛋白的提取。

[0037] （3）大肠杆菌周质蛋白的提取
优选地，选用“渗透压冲击法”对所收集的菌体进行大肠杆菌周质蛋白的提取。

在进行提取之前，还可以对所收集的菌体的进行洗涤，例如用NaCl溶液充分洗涤。

在一个示例中，渗透压冲击法中的高渗溶液是含有50mmol/L Tris-HCl、2.5mmol/L EDTA的20%蔗糖高渗
低渗溶液。

溶液。

在另一个示例中，渗透压冲击法中的低渗溶液是5mmol/L的MgCl
2
[0038] 经过周质提取后的蛋白悬液，去除了50%以上宿主菌蛋白和蛋白聚合物，利于下面的纯化。

[0039] （4）Fab片段的纯化
将所提取的蛋白溶液进行色谱柱纯化，即可获得高纯度的Fab片段。

优选地，依次通过亲和柱层析、阳离子交换树脂层析、和分子筛介质层析进行纯化。

在一个示例中，亲和柱层析的亲和层析介质为Ni-NTA。

在另一个示例中，离子交换树脂层析的阳离子交换介质为SP-FF。

在又一个示例中，分子筛介质层析的分子筛层析介质为Superdex200。

在纯化过中，可以使用SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。

又，可以使用Milipore超滤系统浓缩蛋白。

[0040] （分析与检测）
可以使用Western Blot分析目的蛋白Fab片段。

图3、4分别示出Western Blot检测
在大肠杆菌中的分泌表达，其中图3和图4中的图A Adalimumab Fab抗体重链Fd、轻链V
L
为还原条件，图3和图4中的图B为非还原条件。

由图3可知，在大肠杆菌周质腔中存在较多分泌表达的Adalimumab Fab抗体重链Fd。

由图4可知，在大肠杆菌周质腔中存在较多分泌表达的Adalimumab Fab抗体轻链，且与重链Fd形成二硫键结合的异二聚体。

[0041] 图5、6、7分别示出经亲和柱层析、阳离子交换树脂层析、分子筛介质层析所获得的蛋白的SDS-PAGE电泳图，用以表征蛋白的纯度。

该三幅图中的图A均为还原条件，图B 均为非还原条件。

由图5可知，Fab为IgG1抗原结合区重链Fd和轻链二聚体，还原条件下为两条电泳条带，非还原条件下在46kDa处有单一电泳条带。

由图7可知，分子筛层析纯化后的Fab抗体片段的纯度大于98%。

[0042] 可以使用ELISA测定纯化的adalimumab Fab抗体片段与抗原TNF-α特异性结合能力及抗体活性。

图8示出该测试结果。

由图8可知，adalimumab Fab抗体片段能与抗原TNF-α特异性结合，说明该Fab片段保留了原adalimumab抗体具备的抗体性质和特异性。

因此，根据本发明的制备方法所制备的Fab片段可应用于制备治疗与TNF-α水平升高有关的疾病（例如类风湿性关节炎、癌症等）的药物。

[0043] 本发明与现有技术相比具有的优点：
（1）本发明所制备的Fab片段分子量小，因此在到达肿瘤靶部位的过程中穿透力大；
（2）本发明所制备的Fab片段保留了全抗体对TNF-α的高特异性和高亲和力，并且其半衰期较同类药物长，可以减少药物的使用次数；
（3）选用双启动子表达载体pETDuet-1共分泌表达，易于构建，可大量表达；
（4）大肠杆菌原核表达载体，生产快速且便于纯化，降低生产成本，增加产品竞争力；
（5）稳定性好、操作简单、耗时短、纯度高。

周质提取液使用渗透压冲击法，可有效去除
宿主菌杂蛋白成分，同时保证抗体片段重链Fd和轻链稳定的结合；
（6）纯化过程中，使用亲和层析-阳离子交换-分子筛层析法纯化获得纯度大于98%的抗体蛋白，是一种操作简单方便，低成本，高产出的抗体片段纯化制备方法；
（7）本发明提供了一种既具有抗体特异性又具备较好亲和力的抗TNFalpha全人源单克隆抗体adalimumab Fab抗体片段的制备方法，为获得高质量的单克隆抗体Fab片段提供了有力的基础。

[0044] 下面进一步例举实施例以详细说明本发明。

同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0045] （1）重组质粒的构建
选用具有两个独立T7启动子的pETDuet-1作为表达载体进行双基因共表达，在轻链和重链Fd的N端各加上一个独立的来自革兰氏阴性菌周质引导肽序列。

轻链之前添加PelB 氨基酸序列：KYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA，根据大肠杆菌原核表达系统进行密码子优化之后通过固相亚磷酰胺三酯法合成短片段DNA链，再利用PCR的方法连接形成长链合成基因，利用5’Ndel和3’Xhol插入于第一个启动子之后；在重链Fd段之前添加OmpA氨基酸序列:KKTAIAIAVALAGFATVAQA，同时C端设计组氨酸融合标签HHHHHH和蛋白酶TEV酶切位点ENLYFQS,以利于后续的检测以及纯化，利用5’端Ncol和3’端HindⅢ酶切位点插入于第二个启动子之后，构建质粒Fab in pETDuet1（图2）。

[0046] （2）抗体的抗原结合片段在大肠杆菌中的表达
重组质粒转化至BL21(DE3)Star，挑取单菌落接种于含有氨苄霉素的LB液体培养基中，250r/min振摇培养过夜；次日将种子液按1%扩培于LB液体培养基中，37℃，180r/min
=0.6）时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG，16℃，180r/min 振摇培养，培养至光密度（OD
600
振摇培养过夜，5000r/min离心5min收菌。

[0047] （3）大肠杆菌周质蛋白的提取
选用“渗透压冲击法”提取大肠杆菌周质蛋白。

细菌培养离心后收集菌体，NaCl充分洗涤，第一阶段在收集的菌体中加入含有50mmol/L Tris-HCl、2.5mmol/L EDTA的20％蔗糖高渗溶液充分悬浮重新离心收集菌体，第二阶段把蔗糖处理过的细胞迅速转移到5mmol/低渗溶液中冰浴悬浮，离心，最终获得周质蛋白。

Western Blot分析提取结果，恒
L的MgCl
2
压下进行SDS-PAGE，结束后将胶卸下进行转膜，45min结束后将膜从电转槽中取出，浸没于封闭液中缓慢摇荡1h用含一抗的封闭液室温下轻摇孵育1h，一抗孵育结束后，用PBST漂洗膜后再浸洗3次，每次5～10min。

再结合二抗，室温轻摇1h，漂洗之后使用ECL法显色（图3，图4）。

结果表明在大肠杆菌周质腔中存在较多分泌表达的Adalimumab Fab抗体重链Fd 和轻链，且轻链与重链形成二硫键结合的异二聚体。

[0048] （4）色谱柱纯化
第一步NTA亲和层析
1）色谱柱：XK26/20，层析介质：Ni-NTA Agrose，美国Qiagen；。