工业发酵染菌防治

• 常见的设备、管道(guǎndào)“死角”
发酵罐的“死角”：不锈钢衬里破裂造成死角，发酵罐罐
底脓疱状积垢。
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• 管道(guǎndào)安装不当形成的死角
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• 4、设备渗漏引起的染菌及其防止
（1）发酵设备、管道、阀门长期使用，由于腐蚀、 摩擦和振动等原因(yuányīn)，造成渗漏。
三、不同(bù tónɡ)染菌时期对发酵的影响：
（1）种子培养期染菌：易染菌、应灭菌后除去，并对种子罐、管道 进行检查和彻底灭菌。
（2）发酵前期染菌：易染菌、应特别防止，可重新灭菌，补充 营养，重新接种发酵。
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（3）发酵中期染菌：
• 发酵中期染菌，挽救处理困难，危害性大；
• 抗生素发酵：
将另一罐发酵正常、单位(dānwèi)高的发酵液的一部分输入染菌罐中，以 抑制杂菌繁殖，同时采取低通风，低流加糖量等措施
染菌率与发酵的菌种、培养基、产品性质、 发酵周期、生产环境条件设备(shèbèi)和管理技术
水平等有关。
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（二）、染菌原因分析 （1）染菌原因分析就是总结染菌的教训，防
范于未然。 （2）主要染菌原因：种子带菌，无菌空气带
菌，设备(shèbèi)渗漏，灭菌不彻底，操作管理 不当。
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2、以上3种检查法的不足 • 以上3种检查法未发现染菌，还不能肯定
未被染菌； • 原因是以上检查(jiǎnchá)法只能检查(jiǎnchá)杂菌
浓度较大的染菌情况（>1个/ml）
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3、发酵过程的异常现象来判断染菌 （1）溶解氧水平异常(yìcháng)显示染菌（谷氨酸）
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2、发酵异常
（1）菌体生长差：种子质量的影响；导致代谢缓慢。 （2）pH不正常(zhèngcháng)：培养基质量、灭菌效果、补
糖等影响；是所有代谢反应的综合反映。 （3）溶解氧异常
染菌：染好氧菌，染厌氧菌
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（4）泡沫过多
泡沫的消长(xiāo zhǎng)不符合规律；培养基灭菌时温度过 高或时间过长，葡萄糖变成氨基糖会引起泡沫。
（5）菌体浓度过高或过低
罐温长时间偏高；溶氧不足；营养条件差；种子质量 差；菌体自溶。
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二、染菌的检查与判断 1、染菌的检查 （1）显微镜检查法（最简单、最直接、最经常） （2）平板划线培养或斜面培养检查法；
平板制好后，应先保温24小时(xiǎoshí)，确定无菌 （3）肉汤培养基检查法（酚红变色pH6.8-8.4）
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• 3、结论： 根据我在生产中碰到和解决的无菌问题来看，
靠罐阀的检修(jiǎnxiū)不到位造成的染菌站15％左右， 包括密封垫脱落、老化，阀头脱落，外漏，内漏等 等，作大生产，要不有钱买好设备，要没钱必须要 有好的制度和好的操作工。根据我的生产经验看， 买好设备要划算的多，染一罐少则损失几百元，多 则几十万。
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• （3）连续灭菌时，蒸汽压力波动大，培养基未达到灭 菌温度，导致灭菌不彻底。
• （4）设备和管道存在“死角”
死角：由于操作、设备结构、安装或人为造成的 屏障等原因(yuányīn)，引起蒸汽不能有效到达或不能充 分到达预定应该到达的局部灭菌部位，从而不能达到 彻底灭菌的要求。
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• 1、不同染菌时期(shíqī)对发酵有何影响。 • 2、试从染菌分析染菌的可能原因有哪几
种？
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内容(nèiróng)总结
工业发酵染菌的防治。青霉素：产青霉素酶的杂菌。（2）平板划 线培养或斜面培养检查法。（1）染菌原因分析就是总结染菌的教训 ，防范于未然。发酵罐的“死角”：不锈钢衬里破裂造成死角，发酵罐 罐底脓疱状积垢。（1）灭菌过程中严防(yánfáng)泡沫升顶，尽可能添加 消泡剂防止泡沫大量产生。②转换使用菌种或使用抗性菌株。1、不 同染菌时期对发酵有何影响。2、试从染菌分析染菌的可能原因有哪 几种
工业发酵(fā 染菌的防治 jiào)
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第一节 工业发酵(fā jiào)染菌的危害
• 纯种培养要求必须防止(fángzhǐ)杂菌污染 • 为防止染菌，采取了一系列措施：
密闭式发酵罐、无菌空气、无菌室、培养基和设备灭菌、无菌操作；
• 染菌无法彻底避免；据报道
• 国外抗生素发酵染菌率为2％~5%，国内抗生素发酵、青霉素发酵的染菌率 为2％，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率为5%，谷氨酸噬菌体感染率为 1％～2％
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（3）染菌的杂菌种类分析： • 杂菌是耐热的芽孢杆菌（灭菌、死角） • 杂菌是不耐热菌（种子带菌、空气带菌，
设备渗漏，管理操作(cāozuò)等） • 杂菌是真菌
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（4）染菌的规模分析
• 大批量发酵罐染菌：种子、空气；
前期：种子带菌，灭菌问题；
中后期：空气带菌；
• 部分发酵罐染菌： • 个别发酵罐连续(liánxù)染菌：设备渗漏
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（5）染菌的时间分析 • 种子培养阶段：种子，灭菌，操作； • 发酵前期：种子，灭菌，操作； • 发酵后期(hòuqī)：空气，补料，设备渗漏，泡
沫
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四、染菌途径(tújìng)及预防
1、种子带菌的防止 （1）培养基及用具灭菌要彻底，应防止假压； （2）菌种在转接过程中受污染：操作不当，管理不严；（缓冲间）
（3）菌种在培养或保存过程中受污染（试管塞，查看的时候要注意）
2、无菌空气带菌及其防止：
流程设计，介质灭菌
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3、培养基和设备灭菌不彻底导致染菌及防治
• （1）原料性状：淀粉质原料，升温过快或混合不 均匀，易结块，团块中包埋的活菌不易杀灭；可升 温前搅拌和加淀粉酶。
• （2）实罐灭菌时未充分排除罐内空气：造成(zào chénɡ) 假压，升温时，应打开排气等阀门放气。
④罐内灭噬菌体的方法
⑤添加噬菌体抑制剂的方法
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五、染菌的挽救与处理
1、种子培养期染菌的处理 灭菌、重新制种、倒种
2、发酵前期染菌的处理
3、发酵中后期染菌的处理 废液应加热至120℃，保持30min才能放罐
4、染菌后对设备(shèbèi)的处理 重新使用前，应彻底清洗，空罐灭菌
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作业 ： (zuòyè)
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• 柠檬酸发酵：
污染细菌(xìjūn)：加大通风量，加速产酸，降低pH，抑制细菌(xìjūn) 生长；
污染酵母 ：加0.025-0.035g/L硫酸铜； 污染黄曲霉；加入另一罐将近成熟的醪液，使pH下降，黄曲 霉自溶 污染青霉：青霉能在低pH环境下生长，可考虑提前放罐。
（4）发酵后期染菌
（2）微小渗漏的检查：加入碱性水，用浸湿酚酞 指示剂 的白布擦，有渗漏则白布显红色。
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5、操作失误导致(dǎozhì)染菌及其防治
（1）灭菌过程中严防泡沫升顶，尽可能添加 消泡剂防止泡沫大量产生；
（2）传感器探头用化学试剂浸泡法灭菌可能 导致灭菌不彻底。
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抗生素染菌实例(shílì)分析
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6、噬菌体污染和防治 （1）、噬菌体污染的预防
① 严格活菌体排放(pái fànɡ)，切断噬菌体的粮源 ②做好环境卫生，消灭噬菌体与杂菌
③ 严防噬菌体与杂菌进入种子罐或发酵罐内
④抑制罐内噬菌体的生长
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（2）、污染(wūrǎn)噬菌体后的处理方法
①并罐法 ②转换使用菌种或使用抗性菌株 ③放罐重消法
• 染菌影响产率、质量、三废治理都有很大的影响。
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一、 染菌对各种发酵的影响： • 青霉素：产青霉素酶的杂菌
• 疫苗：全部废弃
• 柠檬酸：主要防止(fángzhǐ)前期染菌 • 谷氨酸：噬菌体危害大
• 肌苷、肌苷酸：易染菌
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二、染杂菌种类对发酵的影响
青霉素发酵污染细短产气杆菌比污染粗大杆菌危害大，链霉素发酵 污染细短杆菌和假单孢杆菌和产气杆菌比污染粗大杆菌危害大，四环 素怕污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌
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（2）排气中CO2异常显示染菌 • CO2的含量变化是有规律的； • 染菌引起糖的消耗(xiāohào)变化，染好氧性杂
菌，糖耗加快， CO2含量增加；染噬菌体， 糖耗减慢， CO2含量减少。
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三、发酵(fā jiào)染菌率和染菌原因分析 （一）、发酵的染菌率
总染菌率 ＝ 发酵(fā jiào)染菌批数×100％ 总投料批数
• 1、现象： 一级种子罐连续染菌，菌型一致，均为芽孢杆菌，
接种后24小时就当班片子种发现，量相当大。5批染3 －4批。罐内无搅拌(jiǎobàn)，夹套降温，罐内无结垢，可 以说无死角。
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• 2、分析：母瓶无菌斜面正常，不接种的白料无菌试验罐也染菌 （种子原因排除），消后无菌斜面正常，接种后12小时左右的斜 面能镜检出杂菌（操作原因基本排除）。罐体内只有一取样管和 一空气管，较干净，蒸汽压力和仪表温度对应良好，消毒工都有 十几年的工作(gōngzuò)经验，操作问题不大（为了排除操作问题， 我和技术员和消毒工共同消了几个罐，无菌仍不正常）。判断有 罐体内可能有料垢和死角。
可考虑提前放罐。
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四、染菌程度对发酵的影响
• 染菌程度越大，即进入发酵罐的杂菌数目越多， 对发酵的危害越大。
• 染少量杂菌，有时可以容忍； • 前期和中期染菌，应结合染菌程度综合考虑。
五、染菌对产物(chǎnwù)提取和产品质量的影响
菌体自溶，发酵液发粘、发臭，过滤困难
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第二节 染菌的检查ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱjiǎnchá)、分析和防 治
一、种子培养和发酵的异常现象 1、种子培养异常
（1）菌体生长缓慢：原料质量、菌体老化、供氧不足、温度、 酸碱度，种子冷藏时间长或接种量过低。
（2）菌丝结团：菌丝团中央结实，内部菌丝的营养吸收和呼吸受到 影响，不能正常生长。原因多而且复杂。
（3）代谢(dàixiè)不正常：接种物质量和培养基质量、培养环境查， 接种量小、杂菌污染等有关