重组体的筛选与鉴定
何水林版基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
4. DEAE-葡萄糖转染法 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量
基因工程重组体克隆的筛选和鉴定
基因功能的正向遗传筛选技术
突变体库的构建
通过化学诱变、同源重组 等技术构建大规模突变体 库。
表型筛选
通过特定表型筛选出具有 特定功能的突变体。
突变基因的鉴定
通过测序等技术鉴定出突 变基因，并研究其功能。
05
克隆基因的应用前景
克隆基因在医学上的应用
疾病诊断与治疗
利用克隆技术获取特定基因，可用于疾病诊断、药物研发和个性化治疗。
基因敲入
将特定基因敲入生物体基因组，观察 生物体表型变化，以确定该基因的功 能。
基因表达干扰
通过转录因子或RNAi技术干扰特定 基因的表达，观察生物体表型变化， 以确定该基因的功能。
正向遗传筛选
通过突变体库筛选具有特定表型的突 变体，鉴定突变基因，以研究该基因 的功能。
基因敲除和敲入技术
基因敲除技术
基于测序的筛选
对转化子进行全基因组测序或目的基因片段测序，与已知序列进行比 对，判断是否含有目的基因。
蓝白筛选法
原理
步骤
利用载体上标记基因的表达产物对转化子 进行筛选，通过菌落颜色的变化判断是否 含有目的基因。
将转化子涂布在含有抗生素的培养基上， 培养后观察菌落颜色变化，蓝色菌落为阳 性克隆，白色菌落为阴性克隆。
基因表达的蛋白质印迹分析
原理
利用特异性抗体检测样品中特定蛋白质的表达情况，通过显 色反应或荧光信号对蛋白质进行定性或定量分析。
用等 方面的研究。
04
克隆基因的功能研究
基因功能研究的方法
基因敲除
通过基因工程技术将特定基因敲除， 观察生物体表型变化，以确定该基因 的功能。
Northern印迹杂交
原理
基于RNA的电泳分离和转移，将RNA 片段与标记的探针进行杂交，以检测 特异的RNA转录本。
基因工程第七章 重组子的筛选和鉴定
菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物 理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数 不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法 可用于检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分 破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙 签点在LB（+Amp）平板，记录号码。 在PCR管中加其他成分（最后加酶） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。
实验17-重组体筛选与鉴定
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
液。
6.感受态细胞分装成200μl的小份,暂且不用的贮存于-70℃可
保存半年。 取其中一份进行转化。
7. 向转化管中加入DNA（不超过10ul）,轻度摇晃混合后于冰上
放置30分钟。
8. 将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休克90秒
(不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰浴，冷却1－2分钟。
重组体筛选与鉴定
重组质粒的转化
转化（transformation)：
是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞 获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研 究领域的基本实验技术。
转化方法
1、化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl） 制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA 分子导入受体细胞；
不同抗生素基因筛选 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉 素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在 选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化 体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如 果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基 平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确 认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含 有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上 生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不 能确定哪个克隆含有插入片段。
受体菌：his外源基因：his+
重组dna的筛选和鉴定方法
重组dna的筛选和鉴定方法《重组DNA的筛选和鉴定：一场微观世界的“寻宝”之旅》嘿，你知道吗？重组DNA这玩意儿可太神奇了。
就像是在微观世界里搞一场超级特别的“拼接游戏”。
你把不同来源的DNA片段给组合到一块儿，就像搭积木一样，搭出一个全新的DNA组合。
可这搭完了，你怎么知道你搭得对不对呢？这就轮到筛选和鉴定方法上场啦。
我就有一次特别有趣的经历，和找东西有点像。
我有一个超级乱的抽屉，里面啥都有，小珠子、笔芯、还有各种小贴纸啥的。
我想在里面找一颗特定的珠子，那颗珠子是我朋友送我的，上面有个特别小的标记。
这就跟在一堆重组DNA里找我们想要的那个重组体差不多。
咱先说筛选方法哈。
有一种方法叫抗性筛选。
这就好比我在那堆抽屉杂物里，按照有没有某种特殊属性来挑东西。
在重组DNA的世界里呢，科学家会给载体加上抗性基因，就像给我们要找的那个特殊东西贴上一个特别的标签。
比如说，在含有氨苄青霉素的培养基里培养那些接受了重组DNA的细菌。
如果细菌能在这培养基里活下来，那就很有可能是我们想要的重组体啦。
为啥呢？因为这个重组体里带着抗性基因呢，就像那些带着特殊本领（能抵抗氨苄青霉素）的细菌，才能在这个“危险”的环境里生存。
还有一种筛选方法是蓝白斑筛选。
这就更有趣了。
想象一下啊，那些接受了重组DNA的细菌在培养皿里就像一群小居民。
正常情况下，有一种酶叫β - 半乳糖苷酶，它能让一种物质变色。
如果DNA重组成功了，这个酶的基因被破坏了，就不会变色。
就像我抽屉里有些东西，原本是亮闪闪的，要是被破坏了某个部分，就不再亮闪闪了。
在培养皿里，没重组成功的会变成蓝色的菌斑，而重组成功的就是白色的菌斑。
我当时在找那颗珠子的时候，也会根据一些类似的特征来区分东西。
比如说，我知道那颗珠子是不透明的，而其他一些珠子是透明的，我就可以根据这个来缩小寻找的范围。
那鉴定方法呢？PCR（聚合酶链式反应）就是个很厉害的鉴定手段。
这就像是拿着一个超级放大镜，去看那些特别特别小的细节。
第六章重组体的筛选与鉴定
一、根据载体表型特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。 DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应
1.以 1.以pBR322质粒为例 质粒为例
（1）pBR322质粒的一般特性 质粒的一般特性 在pBR322质粒上有两个抗生素基因，Ampr基因内有 pBR322质粒上有两个抗生素基因， 质粒上有两个抗生素基因 一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点， PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点 一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点，Tetr基 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 BamHⅠ 两种限制性核酸内切酶单一 位点。 位点。
如下图所示
一、根据载体表特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法
Ampr pBR322 Tetr AmprTetr
菌落原位影印
pBR322
+
pBR322
AmprTets
Amp琼脂平板 琼脂平板
Tet琼脂平板 琼脂平板
图 应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法 1.乳糖操纵子的结构 1.乳糖操纵子的结构
二、根据插入基因遗传性状的筛选 (一)原理 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后, DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后,如果 插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 达,而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选. 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选. 互补 (二)举例 当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时 当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时,将该基因 亮氨酸的基因 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用 能利用表达产物亮 少亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用表达产物亮 氨酸的细菌才能生长 因此,获得的转化子都是重组子 生长, 转化子都是重组子. 氨酸的细菌才能生长,因此,获得的转化子都是重组子.
8第八章重组体的筛选ppt课件
④结果 单抗blotting 结果
多克隆抗体 Blotting的 结果
五、DNaseⅠ足迹实验〔footprinting assay）
检测与特定蛋白质结合的DNA序列的 部位及特性
优点：可形象地展示出特殊的蛋白 质因子同特定DNA片段之间的结合区 域
1
10
(a)
32p
*
1 10
(b) *
(c)
1. 抗体与产物的结合方式 根据第一抗体〔一抗〕和第二抗体〔二抗〕 的性质可分为几种作用方式：
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗
125I标记的二抗
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
重组子的筛选直接筛选间接筛选dna鉴定载体筛选翻译产物转录产物其他方法报告基因等northernblottingwesternblotting标记补救筛选质粒载体的互补筛选蓝白色斑筛选法噬菌体包装容量的正性筛选质粒载体的抗性标记筛选同源性分析鉴定原位杂交dna序列分析重组子酶切图谱鉴定重组子大小鉴定一遗传学检测法1根据载体表型特征的筛选1抗药性标记插入失活筛选法第一节核酸分子的遗传学与物理检测法半乳糖苷酶显色反应筛选法蓝蓝白白落落蓝白菌落蓝白菌落筛选白色菌落2根据插入基因遗传性状的筛选重组体dna分子转化到大肠杆菌受体细胞之后如果插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表达而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变形成互补那么就可以利用营养突变株进行筛选
4、直接凝胶电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
基因工程-第8章-重组子的筛选与鉴定
2、根据插入序列的表型特征选择重
组体分子的直接选择法
转化进来的外源DNA编码的基因，能够 对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变体发 生体内抑制或互补效应，从而使被转化 的寄主细胞表现出外源基因编码的表型 特征。
Example:
λ gt.λ B噬菌体（由于C片断的缺失而造成重 组缺陷的λ red－噬菌体），在大肠杆菌lig ts菌株上生长不能形成噬菌斑，在有连接酶功 能的大肠杆菌lig＋菌株上形成噬菌斑。 将具有连接酶基因的重组体噬菌体λ gt. λ B，涂布在大肠杆菌lig ts菌株上时，通过 寄主细胞的互补作用，能够形成噬菌斑。根据 形成噬菌斑这种表型特征，直接选择具野生功 能的重组体噬菌体。
缺点： 不单要求克隆的DNA片断必须大到足 以包含一个完整的基因，而且还要求所 编码的基因能够在大肠杆菌中实现功能 表达。 （对于真核基因很难达到要求）
二、物理检测法
1、凝胶电泳检测法 从宿主细胞中提取重组子分子，利用凝胶 电泳的方法，鉴定外源片断是否插入及其 长度。 优点：简便、快速。 缺点：只能提供克隆片段大小的信息。
抗药性标记插入失活
Amp r
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入
Tc
有DNA插入
Amp r
Tcr
转化
Amp r Tc s
外源DNA
Amp r பைடு நூலகம்cr
无菌落 筛选重组子 阳性菌落
Amp r Tc s
提取DNA 电泳
筛 选 重 组 子 的 示 意 图
Amp r Tc s
重组DNA
（2）β-半乳糖苷酶显色反应选择法
外源DNA 有DNA插入
Apr
转化
Ap r
Ap r
筛选重组子 白色菌落
重组体的筛选和鉴定
二、利用插入序列提供的表型特征筛选
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。 一、原理： 1.弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。 受体菌： his外源基因： his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
GFP 老鼠
GFP- Kac的狗
GFP Alba 發青綠光 芒的 兔子
①新霉素磷酸转移酶基因（NPTⅡ）抗新霉素、卡 那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选动 植物转化子的选择标记基因。 ②潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）赋予转化子能抗 潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物 转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。 ③氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）也被用于筛选动 植物转化子的标记基因。
PstI酶切
外源DNA 黏性末端 连接酶 PstI酶切
pBR322 4363
重组子(ampstetr) 空载体(amprtetr) 插入子(ampstets)
导 入
黏性末端
重组子转化子(ampstetr) 空载体转化子(amprtetr)
影印在含Ap的平板上
涂布在含Tc的平板上
野生型的E.coli (ampstets)
缺点：需要电镜！
2. Northern blotting
用DNA（或RNA） 探针检测RNA样 品。 主要检测插入片 断是否被转录。 从宿主细胞中提 取RNA，再用探 针杂交。
Northern Blotting
Western Blotting
Southern和Western印迹法
32P-labled
重组体的筛选和鉴定
1975年，英国Southern创建
针对DNA的杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探 针进行检测的方法。
原理：将重组菌的基因组或质粒DNA提取出来，经合适的限制
性内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分离，把定位在凝胶 中的DNA碱变性处理，使其双链DNA分开，再将凝胶中变性的 DNA转移到硝酸纤维素膜上，用制备的标记探针与其充分混合， 进行同源性DNA杂交。
为Tcr表型．而质粒为Tcs表型。
转化菌涂在Tc平板上，只有含有外源DNA插入片段
的阳性重组子的转化菌能生长成菌落。
16
（3）显色反应筛选：蓝白斑筛选
乳糖 -半乳糖苷酶 X-gal 半乳糖 + 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝 α-互补 深蓝色 （酶活）
半乳糖
β—半乳 糖苷酶
α链（lacZα） ：四聚体装配
A
T T
表型筛选加酶切筛选
T A A T
38
二、目的克隆的鉴定
（一）核酸分子杂交(nucleic acid hybridization) 原理
具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温 度和离子强度)可按碱基互补的原则退火形成双链.
杂交分子可在DNA和DNA、DNA和RNA、RNA和RNA以及人工合
18
19
20
pUC18/19
5’
lacZ’
EcoRI SacI
EcoRI SacI
KpnI SmalI BamHI XbaI SalI
pUC18
PstI
SphI Hind III
ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTG
重组体的筛选方法
重组体的筛选方法1、重组体的基本筛选概念重组体（recombinant）指从不同生物系统中获取的非天然表达载体，以用于表达特定蛋白质或DNA片段，通常为了检测某种生物活性，以改良生物机理或更改特定特性。
重组体的筛选是对重组体表达的非天然蛋白质进行筛选的过程，可以用来鉴定新的蛋白质、表达具有特定生物活性的蛋白质，或确定新的重组体表达载体。
表达系统筛选通常包括利用基因工程技术在指定载体上表达特定基因编码片段，然后使用分子生物学、免疫学和生物化学方法进行在细胞水平或分子水平上进行分析和筛选，以鉴定具有特定生物活性的重组体表达系统。
2、方法（1）载体筛选。
在大多数重组体表达系统中，筛选的首要任务是识别具有最佳表达能力的载体，其中也可能涉及到大量的载体类型。
可以分别从细胞系、染色体、质粒、全基因组、融合蛋白等不同类型的载体中选择重组体。
有些载体可能会更有效地表达特定基因，而有些可能会产生低产蛋白，因此需要进行大量的筛选才能有效地识别最佳的表达系统载体。
（2）表达率筛选。
在细胞中表达的蛋白质必须具有最大的表达量才能产生最佳的活性，因此对重组蛋白质的表达量非常重要。
在大多数情况下，使用多种不同的表达系统技术来评估重组体表达质量，例如利用Western和Northern blotting、Immunoprecipitation、活性测定和流式细胞术等技术。
（3）特异性筛选。
在获得足够数量的蛋白质之后，必须进一步确定表达体的特异性，特异性不仅取决于重组蛋白质可以被正确表达和结构功能完整，而且应该是特异性，以使其产生预期的生物活性。
因而，重组体的筛选过程还必须包括一项评估表达蛋白质的特异性的步骤，释放的生物活性水平是最重要的特征，在此筛选步骤中，可以使用酶抑制试验、衍生物筛选、细胞学剂量响应性试验或免疫学、化学、物理学方法来评估重组表达体的活性。
3、结论重组体表达是一种实用技术，它旨在确定特定生物学活性的最佳表达系统，以获得有价值的蛋白质或未知活性的分子。
重组体的筛选方法
重组体的筛选方法重组体是指通过DNA技术将来自不同来源的DNA片段重组而构建的新的DNA 分子。
重组体技术被广泛应用于基因工程、遗传学研究和生产实践中。
重组体的筛选是确保所需目标DNA片段被正确重组的关键步骤。
以下是几种常用的重组体筛选方法。
1. 纤维素酶切筛选法纤维素酶切筛选法是一种原理简单、操作方便的筛选方法。
通过将重组体与纤维素酶一起处理，纤维素酶能够选择性地降解未重组的DNA片段，而保留重组体。
重组体可通过琼脂糖凝胶电泳分离，然后使用DNA杂交技术来确认重组体的存在。
2. 改性PCR筛选法PCR（聚合酶链式反应）是一种能够在体外扩增特定DNA片段的技术。
在重组体筛选中，可以通过设计特定引物，使得PCR只能扩增包含目标DNA片段的重组体，而无法扩增未重组的DNA片段。
PCR扩增后，可以使用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，确认是否存在所需目标DNA片段。
3. 限制性内切酶和DNA连接酶筛选法限制性内切酶是能够识别特定DNA序列并在特定位置切割DNA链的酶。
在重组体筛选中，如果所需目标DNA片段被正确重组，限制性内切酶将无法切割形成的DNA链，而能够切割未重组的DNA片段。
通过对重组体和未重组DNA使用相应的限制性内切酶进行酶切反应，可以通过琼脂糖凝胶电泳分离并观察DNA片段的断裂情况，确定重组体的存在。
4. 荧光标记筛选法荧光标记筛选法利用荧光染料标记目标DNA片段，通过荧光检测的方式进行筛选。
一种常用的方法是将重组体的目标DNA片段与荧光基团结合，形成荧光标记的重组体。
然后，通过荧光检测技术，如荧光凝胶电泳、荧光显微镜观察等，可以检测到荧光信号，确认重组体的存在。
此外，还有其他一些筛选方法，如互补性DNA杂交、DNA测序、南方印迹、北方印迹等，可以根据具体实验需要选择合适的方法进行重组体的筛选。
总结起来，重组体的筛选方法多种多样，可以根据实验的目的和具体条件选择适合的方法。
需要注意的是，在筛选过程中，实验者需要仔细操作，严格控制实验条件，以确保筛选结果的准确性和可靠性。
重组体的筛选方法
重组体的筛选方法重组体是指通过基因工程技术将不同的DNA片段重新组合形成的新的DNA分子。
重组体的筛选方法是指通过一系列的实验步骤，筛选出具有所需特性的重组体，以便进一步应用于基因工程、生物技术等领域。
下面将介绍几种常见的重组体筛选方法。
首先，常用的重组体筛选方法之一是抗生素筛选法。
在进行重组体构建时，通常会将目标基因与抗生素抗性基因连接在一起，形成重组质粒。
然后将重组质粒导入宿主细胞中，通过培养含有相应抗生素的培养基，只有携带了重组质粒的细胞才能在含有抗生素的培养基中存活下来，从而实现对重组体的筛选。
其次，还有一种常见的重组体筛选方法是色素筛选法。
这种方法通常用于真核细胞中重组体的筛选。
通过将目标基因与荧光蛋白等标记基因连接在一起，形成重组质粒。
然后将重组质粒导入宿主细胞中，通过观察细胞的荧光表达情况，来筛选出携带了重组质粒的细胞，从而实现对重组体的筛选。
另外，还有一种常见的重组体筛选方法是筛选标记法。
这种方法通常用于原核细胞中重组体的筛选。
通过在重组质粒中引入特定的筛选标记基因，例如β-半乳糖苷酶等，在含有相应底物的培养基中，只有携带了重组质粒的细胞才能表达出特定的酶活性，从而实现对重组体的筛选。
最后，还有一种常见的重组体筛选方法是PCR筛选法。
通过设计特定的引物，可以在PCR扩增反应中筛选出含有目标基因的重组体。
这种方法通常用于对大量重组体进行快速筛选，可以高效地筛选出所需的重组体。
总之，重组体的筛选方法多种多样，可以根据具体的实验要求选择合适的筛选方法。
通过合理地设计实验方案，可以高效地筛选出具有所需特性的重组体，为基因工程技术的应用提供有力支持。
重组体筛选的方法
重组体筛选的方法
重组体筛选是一种用于寻找具有特定性质或功能的重组分子的方法。
下面列举了一些常用的重组体筛选方法：
1. 亲和筛选（Affinity screening）：利用目标蛋白与重组体之间的亲和力进行筛选。
可以通过将目标蛋白固定在固相材料上，然后将重组体溶液注入固相材料中，通过洗脱和分离来筛选出与目标蛋白相互作用的重组体。
2. 循环进化（Directed evolution）：采用类似于自然进化的方法，通过连续的基因突变和筛选来改进重组体的性能。
通常使用基因库构建、突变（例如误配PCR、DNA shuffling等）和活性筛选（例如细胞表面显示、酶活性测定等）等方法。
3. 细胞表面显示（Cell surface display）：利用细菌或酵母等微生物表面展示重组体，并通过流式细胞术（FACS）等方法筛选出具有目标性质的重组体。
4. 体外显示（In vitro display）：重组体通过与其DNA或RNA编码的蛋白质、磷酸盐结合或共价耦合，以形成重组体-核酸复合物。
然后通过结合亲和柱或筛选酶活性等方法对重组体进行筛选。
5. 亲和柱筛选（Column chromatography screening）：利用亲和柱固定目标蛋白，然后通过洗脱和分离来筛选具有亲和性的重组体。
6. 生物传感器筛选（Biosensor screening）：利用生物传感器的敏感性和选择性来筛选具有目标性质的重组体。
常见的生物传感器包括表面等离子体共振（SPR）传感器和电化学传感器等。
上述方法可能结合使用，根据具体的研究目标和条件来选择最合适的筛选方法。
重组体的筛选方法
重组体的筛选方法重组体是一种重要的生物技术手段，它可以用于改良微生物、植物和动物的基因组，从而实现对目标基因的精准编辑和调控。
在进行重组体的筛选过程中，选择合适的筛选方法对于提高筛选效率和准确性具有重要意义。
本文将介绍几种常见的重组体筛选方法，帮助读者更好地理解和应用这一技术。
1. 抗生素筛选法。
抗生素筛选法是重组体筛选中最常用的方法之一。
通过将目标基因与抗生素抗性基因连接在一起，然后转化至宿主细胞中，能够通过对抗生素的耐受性来筛选出含有目标基因的重组体细胞。
这种方法简单易行，且操作方便，适用于微生物和植物等生物体的筛选。
2. 标记基因筛选法。
标记基因筛选法是利用标记基因与目标基因共转化至宿主细胞中，通过标记基因的表达情况来筛选出含有目标基因的重组体细胞。
常用的标记基因包括荧光标记基因、抗性标记基因等，通过检测标记基因的表达情况，可以快速准确地筛选出目标基因的重组体细胞。
3. PCR筛选法。
PCR筛选法是利用聚合酶链式反应（PCR）技术来筛选重组体。
通过设计特定的引物，可以扩增出含有目标基因的DNA片段，从而实现对重组体的筛选。
PCR筛选法具有高灵敏度和高特异性的优点，能够准确地检测出目标基因的存在，是一种常用的重组体筛选方法。
4. 免疫筛选法。
免疫筛选法是利用抗体对目标蛋白的特异性识别来筛选重组体。
通过将目标蛋白与标记蛋白连接在一起，然后转化至宿主细胞中，利用抗体对标记蛋白的特异性识别来筛选出含有目标蛋白的重组体细胞。
这种方法对于筛选蛋白重组体具有重要意义，能够快速准确地筛选出目标蛋白的重组体细胞。
5. 酶标记筛选法。
酶标记筛选法是利用酶标记技术来筛选重组体。
通过将目标基因与酶标记基因连接在一起，然后转化至宿主细胞中，利用酶标记基因的表达情况来筛选出含有目标基因的重组体细胞。
这种方法操作简便，能够快速准确地筛选出目标基因的重组体细胞。
总结。
重组体的筛选方法多种多样，每种方法都有其特点和适用范围。
重组体分子的选择与鉴定方法及鉴定
电泳后的图谱
挑三个菌落 鉴定，图显 示的是三个 菌落中的质 粒双酶切的 结果
依赖于重组子结构特征分析的筛选方法三 PCR方法筛选鉴定重组子
• 基本原理： • 在载体DNA分子中，外源DNA插入位点两侧的序列多为 已知，通过与插入位点两侧已知序列互补的引物，从单 克隆中提取少量质粒DNA作为模板进行PCR扩增，琼脂 糖凝胶电泳分析确定是否为重组子。
抗药性标记法示意图
b类插入失活筛选
• 从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内 的位点后, 使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活 (insertional inactivation) 。插入失活法是从不同的重组 DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子 （筛选）的主要方法。
常用的抗药性选择标记
抗药性 氨苄青霉素 （Amp） 溶解剂 虑过 除菌 是 贮存温度 贮存浓度 终浓度
水
-20℃
50mg/ml
50~100µ g/ml
氯霉素（Cm） 卡那霉素 （Ka或Kan）
四环素（Tet 或Tc） 链霉素（Sm 或Str）
乙醇
否
-20℃
34mg/ml
20~17交液中，在60℃下放置6h；把同 位素标记的DNA探针于100℃变性后加入杂交溶液中，然 后放入滤膜，60℃杂交16－24h。探针的用量一般为105 －106cpm/ml。用2×SSC洗脱3次，每次30min。 • 7 放射自显影：将洗好的滤膜用吸水纸吸干，夹于两层保 鲜膜中，在暗室内放进暗盒，放好X线片，并于X线片上 作好标记，置于－70℃冰箱暴光48－72h。 • 8 洗片：在暗室内取出X线片，进行显影和定影，分析杂 交结果。
RNA水平
蛋白质水平
免疫化学检测法（放射性抗体检测法、 免疫沉淀检测法） Westhern印迹杂交法
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第二节 核酸分子杂交检测法 一、菌落印迹原位杂交
将噬菌体感染形成的噬菌斑 影印在硝酸纤维膜上变性 带 有目的基因的放射性DNA或cDNA 作探针进行杂交放射性自显 影 杂交信号（黑点）对应的 噬菌斑即为阳性克隆。
菌落印迹原位杂交的优点是：适于高密度菌落的 筛选,对于噬菌斑平板,它可以连续影印几张同样的硝 酸纤维滤膜,获得数张同样的DNA印迹。因此，能够进 行重复筛选，效率高，可靠性强，而且可以连续使用 两种或数种探针筛选同一套重组体DNA，是一种最常规 的检测手段。
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法
3.举例 pUC质粒：带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控
序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这 个编码区中插入了一个多种限制性核酸酶单一识别位 点的多克隆位点，但并没有破坏lacZ的阅读框架。
大肠杆菌菌株：带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的 编码信息。
SalⅠ位点时，抗四环素基因失活（Tetr Tets ），重
组体转化子必定具有AmprTets表型。因此，将转化菌
先涂布在含有Amp的琼脂的琼脂平板上，凡是在
Amp平板上生长，而不在Tet平板上生长的菌落，就必
定是已经插入了外源DNA片段的重组质粒转化子克隆.
一、根据载体表型特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。
1.以pBR322质粒为例
（1）pBR322质粒的一般特性 在pBR322质粒上有两个抗生素基因，Ampr基因内有
一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点，Tetr基 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 位点。
在各自独立的情况下，pUC质粒和大肠杆菌编码的 β-半乳糖苷酶片段都没有活性。
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法
3. 举例 当质粒转化大肠杆菌后,可形成具有酶活性的蛋白
质,它在生色底物X-gal的存在下被IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷）诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入 到pUC质粒的多克隆位点上后，则会导致读码框架改 变，表达蛋白失活，因此，在同样条件下含重组质粒 的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。因 此，根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，可将重组质 粒与自身环化的载体DNA分开。
① 同源序列的分析： 阅读框架的分析：
一个ORF是一条能编码一条多肽链的DNA序列，具有 翻译起始信号和终止信号等。
②无任何同源性的新序列(进行基因功能性研究的方法) 将基因导入生物体进行基因失活或过量表达，根据
表型推测基因作用；
用噬菌体显现（phage display）技术； 酵母双杂交系统进行蛋白质的功能分析。
•载体和一个或数个串联目的基因连接 •载体发生自连 •目的DNA分子发生自连 •未发生连接反应的载体和目的DNA片段(更
➢ 为什么对重组子要进行鉴定筛选?
因此,在成千上万个转化子中，真正含有期望的 重组DNA分子的比例很少，为了将含有外源DNA的宿 主细胞和不含外源DNA的宿主细胞分开，以及将含有 正确重组子的宿主细胞和含有其他外源DNA的宿主细 胞分开，就需要设计出最易于筛选重组子克隆的方 案并加以验证。
➢ 常用的重组子筛选和鉴定方法
直接 筛选
重组 子的 筛选
DNA 鉴定
• 重组子大小的鉴定(质粒DNA的快速提取鉴定) • 重组子酶切图谱鉴定(限制性核酸酶酶切片段
大小鉴定)
• DNA序列分析 • 同源性分析鉴定(原位杂交)
载体 筛选
• 质粒载体的抗性标记筛选 • 噬菌体包装容量的正性筛选 • 质粒载体的α互补筛选(蓝白色斑筛选法) • 标记补救筛选
β-半乳 糖苷酶
β-半 乳糖苷 透过酶
β-半乳糖 苷乙酰基 转移酶
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法
2.β-半乳糖苷酶显色反应筛选法原理 有许多质粒载体具有β-半乳糖苷酶显色反应的检
测功能.
应用这些载体系列，当外源DNA插入到它的lacZ基 因上时，可造成β-半乳糖苷酶的失活效应，就可通过 大肠杆菌转化子菌落在添加X-gal-IPTG培养基中的颜 色变化鉴别出重组子和非重组子。
在实际操作中,最典型的方法是使用抗药性标记的插 入失活作用,或是β-半乳糖苷酶基因的显色反应,将重 组体DNA分子的转化子同非重组的载体转化子区别开来. 而对于λ噬菌体的置换型载体来说,λ噬菌体头部外壳蛋 白容纳DNA的能力是有一定限度的。其包装能力应控 制在野生型λDNA长度的75%-105%之间（36-51kb），这 样才能形成噬菌斑。因此，包装限制这一特性，保证了 体外重组所形成的有活性的λ重组体分子，一般都应带 有外源DNA的插入片段，噬菌斑的形成本身就是λ重组体 的一种筛选特征。由于这些方法都是直接从平板上筛选， 所以又称为平板筛选法。
一、根据载体表型特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法
1.以pBR322质粒为例
（2）筛选重组体的原理
在Ampr和Tetr这两个基因内的任一插入作用， 都会导致Ampr基因或Tetr基因出现功能性失活， 于是，所形成的重组质粒都将具有AmpsTetr或 Amprtets的表型。
当外源DNA片段插入pBR322质粒DNA的BamHⅠ或
从图中可看出:4、5泳道为不含插入片段的空载体；6、9泳道虽然含 有外源DNA片段，但因为插入片段的大小和酶切图谱与目的片段不同，所 以为假阳性；7、8、10泳道和2泳道的电泳图谱相同（除空载体对应的条 带外），所以是阳性克隆。
Mr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
酶
切
鉴
定
克
隆
图
Mr:DNA分子Marker;1:目的DNA片段;2:目的DNA片段EcoRⅠ酶切;
第六章 重组体的筛选与鉴定
将目的基因与载体连接形成重组子,然后通过各种 方法将重组子导入宿主细胞,得到所需要的带有重组 DNA的转化子是基因工程的目的所在.
➢ 何谓转化子?
所谓转化子就是导入外源DNA后获得了新的遗传标 志的细菌细胞或其他受体细胞.
➢ 为什么对重组子要进行鉴定筛选?
在转化反应中,并非所有的细胞中都转入重组DNA 分子,即使所有的受体细胞都变为转化体,所获得的转 化子仍是多种类型的DNA分子,原因是在连接反应中会 有以下几种情况发生:
pBR322
AmprTetr
AmprTets
菌落原位影印
Amp琼脂平板
Tet琼脂平板
图 应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体
一、根据载体表特征的筛选
（二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法
1.乳糖操纵子的结构
RNA聚 合酶
PI lacI PZYA lacO lacZ lacY lacA
mRNA
mRNA
阻遏蛋白
用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水 平，检测mRNA的存在。
第三节 物理检测法 重组质粒的快速提取与酶切鉴定
经过遗传筛选得到的阳性克隆还必须进一步进行 鉴定，酶切鉴定是最常用的方法之一。
通过提取“阳性克隆”的质粒，酶切分析“阳性 克隆”中质粒的大小和酶切图谱，通过这种方法鉴定 载体中是否含有外源DNA片段，载体中是否含有正确的 目的DNA片段。这种方法判断的标准是目的DNA分子和 载体的分子大小及酶切图谱。
同样,在pBR322质粒的Ampr基因序列中,利用PstⅠ 限制性核酸内切酶识别位点,插入外源DNA片段,也 能应用插入失活作用检测重组质粒,当然,所挑选 的菌落就应该是具有AmpsTetr的表型
如下图所示
一、根据载体表特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法
Ampr pBR322 Tetr
pBR322 +
3:空载体EcoRⅠ酶切;4-10:为不同”阳性克隆”质粒的EcoRⅠ酶切分 析;
此外，还有其他方法， 如：Western 杂交分析、 核酸序列分析、 免疫化学检测法等
③.Western 杂交分析： 用于蛋白质的分析。
⑶. 核酸序列测定： 测定克隆后的DNA片段核酸序列 。 采用Sanger（1977）发明的双脱氧核糖核酸
终止法测定核酸序列。
在Sanger双脱氧法中，可用荧光标记来代替放射性标记：
⑷. 核酸序列分析： 测定的核酸序列是否为
基因、有什么功能，需用计 算机软件或生物学实验进一 步分析。 ①.同源序列的分析： 同源性比较：
将待测序列在核酸和蛋白质两个水平上比较基因间的 同源性，将序列发送到Blast等DNA Data数据库进行比 较。
二、根据插入基因遗传性状的筛选 (一)原理 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后,如果
插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 达,而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选.
(二)举例
当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时,将该基因 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 少亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用表达产物亮 氨酸的细菌才能生长,因此,获得的转化子都是重组子.
间接 筛选
• 翻译产物(Western blot) • 转录产物(Norther blot) • 其他方法(报告基因)
第一节 遗传学检测法 一、根据载体表型特征的筛选
根据载体分子所提供的表型特征,选择重组体DNA 分子的遗传选择法,可适用于大量群体的筛选,因此是 一种比较简单而又十分有效的方法。在基因工程中使 用的所有载体分子,都至少含有一个选择标记。质粒常 有抗生素抗性基因,如氨苄青霉素抗性基因（Ampr）、 四环素抗性基因（Tetr）、卡那霉素抗性基因（Kanr） 根据载体分子所提供的选择性标记进行筛选,是获得重 组体DNA分子必不可少的条件之一。
⑵. 核酸分子杂交： ①.Southern杂交分析：由英
国Southern（1975）发明，将琼 脂糖中DNA转移到尼龙膜进行 DNA分子杂交分析的方法。