重组体的筛选与鉴定
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•载体和一个或数个串联目的基因连接 •载体发生自连 •目的DNA分子发生自连 •未发生连接反应的载体和目的DNA片段(更
➢ 为什么对重组子要进行鉴定筛选?
因此,在成千上万个转化子中，真正含有期望的 重组DNA分子的比例很少，为了将含有外源DNA的宿 主细胞和不含外源DNA的宿主细胞分开，以及将含有 正确重组子的宿主细胞和含有其他外源DNA的宿主细 胞分开，就需要设计出最易于筛选重组子克隆的方 案并加以验证。
SalⅠ位点时，抗四环素基因失活（Tetr Tets ），重
组体转化子必定具有AmprTets表型。因此，将转化菌
先涂布在含有Amp的琼脂平板上，并将存活的Ampr菌
落原位影印到另一个含有Tet的琼脂平板上，凡是在
Amp平板上生长，而不在Tet平板上生长的菌落，就必
定是已经插入了外源DNA片段的重组质粒转化子克隆.
① 同源序列的分析： 阅读框架的分析：
一个ORF是一条能编码一条多肽链的DNA序列，具有 翻译起始信号和终止信号等。
②无任何同源性的新序列(进行基因功能性研究的方法) 将基因导入生物体进行基因失活或过量表达，根据
表型推测基因作用；
用噬菌体显现（phage diFra Baidu bibliotekplay）技术； 酵母双杂交系统进行蛋白质的功能分析。
3:空载体EcoRⅠ酶切;4-10:为不同”阳性克隆”质粒的EcoRⅠ酶切分 析;
此外，还有其他方法， 如：Western 杂交分析、 核酸序列分析、 免疫化学检测法等
③.Western 杂交分析： 用于蛋白质的分析。
⑶. 核酸序列测定： 测定克隆后的DNA片段核酸序列 。 采用Sanger（1977）发明的双脱氧核糖核酸
β-半乳 糖苷酶
β-半 乳糖苷 透过酶
β-半乳糖 苷乙酰基 转移酶
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法
2.β-半乳糖苷酶显色反应筛选法原理 有许多质粒载体具有β-半乳糖苷酶显色反应的检
测功能.
应用这些载体系列，当外源DNA插入到它的lacZ基 因上时，可造成β-半乳糖苷酶的失活效应，就可通过 大肠杆菌转化子菌落在添加X-gal-IPTG培养基中的颜 色变化鉴别出重组子和非重组子。
一、根据载体表型特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法
1.以pBR322质粒为例
（2）筛选重组体的原理
在Ampr和Tetr这两个基因内的任一插入作用， 都会导致Ampr基因或Tetr基因出现功能性失活， 于是，所形成的重组质粒都将具有AmpsTetr或 Amprtets的表型。
当外源DNA片段插入pBR322质粒DNA的BamHⅠ或
⑵. 核酸分子杂交： ①.Southern杂交分析：由英
国Southern（1975）发明，将琼 脂糖中DNA转移到尼龙膜进行 DNA分子杂交分析的方法。
筛选基因库得到阳性克隆 将限制性酶酶切与Southern杂交 结合绘制限制性酶图谱。
②.Northern杂交分析： 与Sorthern杂交的原理和 程序相同。
➢ 常用的重组子筛选和鉴定方法
直接 筛选
重组 子的 筛选
DNA 鉴定
• 重组子大小的鉴定(质粒DNA的快速提取鉴定) • 重组子酶切图谱鉴定(限制性核酸酶酶切片段
大小鉴定)
• DNA序列分析 • 同源性分析鉴定(原位杂交)
载体 筛选
• 质粒载体的抗性标记筛选 • 噬菌体包装容量的正性筛选 • 质粒载体的α互补筛选(蓝白色斑筛选法) • 标记补救筛选
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法
3.举例 pUC质粒：带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控
序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这 个编码区中插入了一个多种限制性核酸酶单一识别位 点的多克隆位点，但并没有破坏lacZ的阅读框架。
大肠杆菌菌株：带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的 编码信息。
二、根据插入基因遗传性状的筛选 (一)原理 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后,如果
插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 达,而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选.
(二)举例
当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时,将该基因 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 少亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用表达产物亮 氨酸的细菌才能生长,因此,获得的转化子都是重组子.
终止法测定核酸序列。
在Sanger双脱氧法中，可用荧光标记来代替放射性标记：
⑷. 核酸序列分析： 测定的核酸序列是否为
基因、有什么功能，需用计 算机软件或生物学实验进一 步分析。 ①.同源序列的分析： 同源性比较：
将待测序列在核酸和蛋白质两个水平上比较基因间的 同源性，将序列发送到Blast等DNA Data数据库进行比 较。
从图中可看出:4、5泳道为不含插入片段的空载体；6、9泳道虽然含 有外源DNA片段，但因为插入片段的大小和酶切图谱与目的片段不同，所 以为假阳性；7、8、10泳道和2泳道的电泳图谱相同（除空载体对应的条 带外），所以是阳性克隆。
Mr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
酶
切
鉴
定
克
隆
图
Mr:DNA分子Marker;1:目的DNA片段;2:目的DNA片段EcoRⅠ酶切;
用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水 平，检测mRNA的存在。
第三节 物理检测法 重组质粒的快速提取与酶切鉴定
经过遗传筛选得到的阳性克隆还必须进一步进行 鉴定，酶切鉴定是最常用的方法之一。
通过提取“阳性克隆”的质粒，酶切分析“阳性 克隆”中质粒的大小和酶切图谱，通过这种方法鉴定 载体中是否含有外源DNA片段，载体中是否含有正确的 目的DNA片段。这种方法判断的标准是目的DNA分子和 载体的分子大小及酶切图谱。
在各自独立的情况下，pUC质粒和大肠杆菌编码的 β-半乳糖苷酶片段都没有活性。
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法
3. 举例 当质粒转化大肠杆菌后,可形成具有酶活性的蛋白
质,它在生色底物X-gal的存在下被IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷）诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入 到pUC质粒的多克隆位点上后，则会导致读码框架改 变，表达蛋白失活，因此，在同样条件下含重组质粒 的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。因 此，根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，可将重组质 粒与自身环化的载体DNA分开。
一、根据载体表型特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。
1.以pBR322质粒为例
（1）pBR322质粒的一般特性 在pBR322质粒上有两个抗生素基因，Ampr基因内有
一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点，Tetr基 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 位点。
pBR322
AmprTetr
AmprTets
菌落原位影印
Amp琼脂平板
Tet琼脂平板
图 应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体
一、根据载体表特征的筛选
（二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法
1.乳糖操纵子的结构
RNA聚 合酶
PI lacI PZYA lacO lacZ lacY lacA
mRNA
mRNA
阻遏蛋白
同样,在pBR322质粒的Ampr基因序列中,利用PstⅠ 限制性核酸内切酶识别位点,插入外源DNA片段,也 能应用插入失活作用检测重组质粒,当然,所挑选 的菌落就应该是具有AmpsTetr的表型
如下图所示
一、根据载体表特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法
Ampr pBR322 Tetr
pBR322 +
第六章 重组体的筛选与鉴定
将目的基因与载体连接形成重组子,然后通过各种 方法将重组子导入宿主细胞,得到所需要的带有重组 DNA的转化子是基因工程的目的所在.
➢ 何谓转化子?
所谓转化子就是导入外源DNA后获得了新的遗传标 志的细菌细胞或其他受体细胞.
➢ 为什么对重组子要进行鉴定筛选?
在转化反应中,并非所有的细胞中都转入重组DNA 分子,即使所有的受体细胞都变为转化体,所获得的转 化子仍是多种类型的DNA分子,原因是在连接反应中会 有以下几种情况发生:
在实际操作中,最典型的方法是使用抗药性标记的插 入失活作用,或是β-半乳糖苷酶基因的显色反应,将重 组体DNA分子的转化子同非重组的载体转化子区别开来. 而对于λ噬菌体的置换型载体来说,λ噬菌体头部外壳蛋 白容纳DNA的能力是有一定限度的。其包装能力应控 制在野生型λDNA长度的75%-105%之间（36-51kb），这 样才能形成噬菌斑。因此，包装限制这一特性，保证了 体外重组所形成的有活性的λ重组体分子，一般都应带 有外源DNA的插入片段，噬菌斑的形成本身就是λ重组体 的一种筛选特征。由于这些方法都是直接从平板上筛选， 所以又称为平板筛选法。
间接 筛选
• 翻译产物(Western blot) • 转录产物(Norther blot) • 其他方法(报告基因)
第一节 遗传学检测法 一、根据载体表型特征的筛选
根据载体分子所提供的表型特征,选择重组体DNA 分子的遗传选择法,可适用于大量群体的筛选,因此是 一种比较简单而又十分有效的方法。在基因工程中使 用的所有载体分子,都至少含有一个选择标记。质粒常 有抗生素抗性基因,如氨苄青霉素抗性基因（Ampr）、 四环素抗性基因（Tetr）、卡那霉素抗性基因（Kanr） 根据载体分子所提供的选择性标记进行筛选,是获得重 组体DNA分子必不可少的条件之一。
第二节 核酸分子杂交检测法 一、菌落印迹原位杂交
将噬菌体感染形成的噬菌斑 影印在硝酸纤维膜上变性 带 有目的基因的放射性DNA或cDNA 作探针进行杂交放射性自显 影 杂交信号（黑点）对应的 噬菌斑即为阳性克隆。
菌落印迹原位杂交的优点是：适于高密度菌落的 筛选,对于噬菌斑平板,它可以连续影印几张同样的硝 酸纤维滤膜,获得数张同样的DNA印迹。因此，能够进 行重复筛选，效率高，可靠性强，而且可以连续使用 两种或数种探针筛选同一套重组体DNA，是一种最常规 的检测手段。
➢ 为什么对重组子要进行鉴定筛选?
因此,在成千上万个转化子中，真正含有期望的 重组DNA分子的比例很少，为了将含有外源DNA的宿 主细胞和不含外源DNA的宿主细胞分开，以及将含有 正确重组子的宿主细胞和含有其他外源DNA的宿主细 胞分开，就需要设计出最易于筛选重组子克隆的方 案并加以验证。
SalⅠ位点时，抗四环素基因失活（Tetr Tets ），重
组体转化子必定具有AmprTets表型。因此，将转化菌
先涂布在含有Amp的琼脂平板上，并将存活的Ampr菌
落原位影印到另一个含有Tet的琼脂平板上，凡是在
Amp平板上生长，而不在Tet平板上生长的菌落，就必
定是已经插入了外源DNA片段的重组质粒转化子克隆.
① 同源序列的分析： 阅读框架的分析：
一个ORF是一条能编码一条多肽链的DNA序列，具有 翻译起始信号和终止信号等。
②无任何同源性的新序列(进行基因功能性研究的方法) 将基因导入生物体进行基因失活或过量表达，根据
表型推测基因作用；
用噬菌体显现（phage diFra Baidu bibliotekplay）技术； 酵母双杂交系统进行蛋白质的功能分析。
3:空载体EcoRⅠ酶切;4-10:为不同”阳性克隆”质粒的EcoRⅠ酶切分 析;
此外，还有其他方法， 如：Western 杂交分析、 核酸序列分析、 免疫化学检测法等
③.Western 杂交分析： 用于蛋白质的分析。
⑶. 核酸序列测定： 测定克隆后的DNA片段核酸序列 。 采用Sanger（1977）发明的双脱氧核糖核酸
β-半乳 糖苷酶
β-半 乳糖苷 透过酶
β-半乳糖 苷乙酰基 转移酶
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法
2.β-半乳糖苷酶显色反应筛选法原理 有许多质粒载体具有β-半乳糖苷酶显色反应的检
测功能.
应用这些载体系列，当外源DNA插入到它的lacZ基 因上时，可造成β-半乳糖苷酶的失活效应，就可通过 大肠杆菌转化子菌落在添加X-gal-IPTG培养基中的颜 色变化鉴别出重组子和非重组子。
一、根据载体表型特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法
1.以pBR322质粒为例
（2）筛选重组体的原理
在Ampr和Tetr这两个基因内的任一插入作用， 都会导致Ampr基因或Tetr基因出现功能性失活， 于是，所形成的重组质粒都将具有AmpsTetr或 Amprtets的表型。
当外源DNA片段插入pBR322质粒DNA的BamHⅠ或
⑵. 核酸分子杂交： ①.Southern杂交分析：由英
国Southern（1975）发明，将琼 脂糖中DNA转移到尼龙膜进行 DNA分子杂交分析的方法。
筛选基因库得到阳性克隆 将限制性酶酶切与Southern杂交 结合绘制限制性酶图谱。
②.Northern杂交分析： 与Sorthern杂交的原理和 程序相同。
➢ 常用的重组子筛选和鉴定方法
直接 筛选
重组 子的 筛选
DNA 鉴定
• 重组子大小的鉴定(质粒DNA的快速提取鉴定) • 重组子酶切图谱鉴定(限制性核酸酶酶切片段
大小鉴定)
• DNA序列分析 • 同源性分析鉴定(原位杂交)
载体 筛选
• 质粒载体的抗性标记筛选 • 噬菌体包装容量的正性筛选 • 质粒载体的α互补筛选(蓝白色斑筛选法) • 标记补救筛选
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法
3.举例 pUC质粒：带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控
序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这 个编码区中插入了一个多种限制性核酸酶单一识别位 点的多克隆位点，但并没有破坏lacZ的阅读框架。
大肠杆菌菌株：带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的 编码信息。
二、根据插入基因遗传性状的筛选 (一)原理 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后,如果
插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 达,而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选.
(二)举例
当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时,将该基因 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 少亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用表达产物亮 氨酸的细菌才能生长,因此,获得的转化子都是重组子.
终止法测定核酸序列。
在Sanger双脱氧法中，可用荧光标记来代替放射性标记：
⑷. 核酸序列分析： 测定的核酸序列是否为
基因、有什么功能，需用计 算机软件或生物学实验进一 步分析。 ①.同源序列的分析： 同源性比较：
将待测序列在核酸和蛋白质两个水平上比较基因间的 同源性，将序列发送到Blast等DNA Data数据库进行比 较。
从图中可看出:4、5泳道为不含插入片段的空载体；6、9泳道虽然含 有外源DNA片段，但因为插入片段的大小和酶切图谱与目的片段不同，所 以为假阳性；7、8、10泳道和2泳道的电泳图谱相同（除空载体对应的条 带外），所以是阳性克隆。
Mr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
酶
切
鉴
定
克
隆
图
Mr:DNA分子Marker;1:目的DNA片段;2:目的DNA片段EcoRⅠ酶切;
用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水 平，检测mRNA的存在。
第三节 物理检测法 重组质粒的快速提取与酶切鉴定
经过遗传筛选得到的阳性克隆还必须进一步进行 鉴定，酶切鉴定是最常用的方法之一。
通过提取“阳性克隆”的质粒，酶切分析“阳性 克隆”中质粒的大小和酶切图谱，通过这种方法鉴定 载体中是否含有外源DNA片段，载体中是否含有正确的 目的DNA片段。这种方法判断的标准是目的DNA分子和 载体的分子大小及酶切图谱。
在各自独立的情况下，pUC质粒和大肠杆菌编码的 β-半乳糖苷酶片段都没有活性。
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法
3. 举例 当质粒转化大肠杆菌后,可形成具有酶活性的蛋白
质,它在生色底物X-gal的存在下被IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷）诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入 到pUC质粒的多克隆位点上后，则会导致读码框架改 变，表达蛋白失活，因此，在同样条件下含重组质粒 的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。因 此，根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，可将重组质 粒与自身环化的载体DNA分开。
一、根据载体表型特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。
1.以pBR322质粒为例
（1）pBR322质粒的一般特性 在pBR322质粒上有两个抗生素基因，Ampr基因内有
一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点，Tetr基 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 位点。
pBR322
AmprTetr
AmprTets
菌落原位影印
Amp琼脂平板
Tet琼脂平板
图 应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体
一、根据载体表特征的筛选
（二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法
1.乳糖操纵子的结构
RNA聚 合酶
PI lacI PZYA lacO lacZ lacY lacA
mRNA
mRNA
阻遏蛋白
同样,在pBR322质粒的Ampr基因序列中,利用PstⅠ 限制性核酸内切酶识别位点,插入外源DNA片段,也 能应用插入失活作用检测重组质粒,当然,所挑选 的菌落就应该是具有AmpsTetr的表型
如下图所示
一、根据载体表特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法
Ampr pBR322 Tetr
pBR322 +
第六章 重组体的筛选与鉴定
将目的基因与载体连接形成重组子,然后通过各种 方法将重组子导入宿主细胞,得到所需要的带有重组 DNA的转化子是基因工程的目的所在.
➢ 何谓转化子?
所谓转化子就是导入外源DNA后获得了新的遗传标 志的细菌细胞或其他受体细胞.
➢ 为什么对重组子要进行鉴定筛选?
在转化反应中,并非所有的细胞中都转入重组DNA 分子,即使所有的受体细胞都变为转化体,所获得的转 化子仍是多种类型的DNA分子,原因是在连接反应中会 有以下几种情况发生:
在实际操作中,最典型的方法是使用抗药性标记的插 入失活作用,或是β-半乳糖苷酶基因的显色反应,将重 组体DNA分子的转化子同非重组的载体转化子区别开来. 而对于λ噬菌体的置换型载体来说,λ噬菌体头部外壳蛋 白容纳DNA的能力是有一定限度的。其包装能力应控 制在野生型λDNA长度的75%-105%之间（36-51kb），这 样才能形成噬菌斑。因此，包装限制这一特性，保证了 体外重组所形成的有活性的λ重组体分子，一般都应带 有外源DNA的插入片段，噬菌斑的形成本身就是λ重组体 的一种筛选特征。由于这些方法都是直接从平板上筛选， 所以又称为平板筛选法。
间接 筛选
• 翻译产物(Western blot) • 转录产物(Norther blot) • 其他方法(报告基因)
第一节 遗传学检测法 一、根据载体表型特征的筛选
根据载体分子所提供的表型特征,选择重组体DNA 分子的遗传选择法,可适用于大量群体的筛选,因此是 一种比较简单而又十分有效的方法。在基因工程中使 用的所有载体分子,都至少含有一个选择标记。质粒常 有抗生素抗性基因,如氨苄青霉素抗性基因（Ampr）、 四环素抗性基因（Tetr）、卡那霉素抗性基因（Kanr） 根据载体分子所提供的选择性标记进行筛选,是获得重 组体DNA分子必不可少的条件之一。
第二节 核酸分子杂交检测法 一、菌落印迹原位杂交
将噬菌体感染形成的噬菌斑 影印在硝酸纤维膜上变性 带 有目的基因的放射性DNA或cDNA 作探针进行杂交放射性自显 影 杂交信号（黑点）对应的 噬菌斑即为阳性克隆。
菌落印迹原位杂交的优点是：适于高密度菌落的 筛选,对于噬菌斑平板,它可以连续影印几张同样的硝 酸纤维滤膜,获得数张同样的DNA印迹。因此，能够进 行重复筛选，效率高，可靠性强，而且可以连续使用 两种或数种探针筛选同一套重组体DNA，是一种最常规 的检测手段。