第六章,大肠杆菌表达体系
大肠杆菌表达体系的特点
大肠杆菌表达体系的特点
大肠杆菌表达体系是一种常用的重组蛋白表达方法，具有以下特点：
1. 简单易用：大肠杆菌是一种常见的细菌，易于培养和操作。
其表达体系基于质粒介导的转化和表达，具有操作简单、成本低廉的优点。
2. 高表达水平：大肠杆菌表达体系能够实现高表达水平，通常可以达到10-50%的总蛋白含量。
这一特点使其成为生物制药和科学研究领域中最受欢迎的表达体系之一。
3. 多种表达宿主：大肠杆菌表达体系有多种表达宿主，包括
BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、Origami(DE3)等。
这些表达宿主具有不同的特点，能够适应不同的表达需求。
4. 可定制化：大肠杆菌表达体系可以通过基因工程技术进行改造，实现蛋白质的定制化表达。
例如，可以通过融合表达标签、选择性培养、调控表达等方式来优化表达效果。
5. 可用于生物制药：大肠杆菌表达体系可以用于制备多种蛋白药物，如重组人胰岛素、干扰素、白介素等。
这些蛋白药物已经被广泛应用于临床治疗和研究领域。
总之，大肠杆菌表达体系是一种快速、高效、可定制化的表达系统，已经成为蛋白质表达和生物制药领域中最常用的表达系统之一。
- 1 -。
大肠杆菌表达系统
大肠杆菌表达系统总结随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。
表达系统是外源基因表达的核心，常用表达系统一般为模式生物，包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统，原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。
大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，也是最早进行研究的外源基因表达系统，其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高，相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性，是商业生产中应用最广泛的表达系统，取得了巨大的科研价值和经济效益。
大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品，包括：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。
据统计，1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。
与此同时，目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段，如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。
常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列、JM109系列、 W3110系列和K802系列等，其中大肠杆菌 BL21（ DE3）菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一，BL21（DE3）是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。
该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型，以保证外源蛋白在表达过程中不被降解，维持表达的稳定性。
大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值，但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键，包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。
宿主菌的选择是第一步，对表达活性和表达量影响很大，理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型，避免蛋白酶过多引起的产物不稳定，常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。
其次是外源基因，外源基因决定了是否可获得目的产物，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。
大肠杆菌表达
大肠杆菌表达引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于基因工程和蛋白质表达领域。
大肠杆菌表达系统具有高效、经济且易于操作的特点，因此被广泛用于重组蛋白的生产。
本文将介绍大肠杆菌表达系统的基本原理及其在蛋白质表达中的应用。
大肠杆菌表达系统的基本原理大肠杆菌表达系统采用重组DNA技术，将外源基因插入到大肠杆菌的表达载体中。
表达载体通常包含一个启动子、一个转录终止子、一个选择性抗生素抗性基因和一个参考基因。
启动子能够促使外源基因的转录，转录终止子能够终止转录过程，选择性抗生素抗性基因则能够确保只有带有外源基因的细菌存活下来。
参考基因用于对比表达水平，以评估外源基因的表达效果。
大肠杆菌表达系统的步骤大肠杆菌表达系统的基本步骤如下：1.选择适当的表达载体：根据需要选择合适的表达载体，包括质粒和噬菌体。
2.插入目标基因：将目标基因插入到表达载体中，通常使用限制酶切和连接酶法完成插入。
3.转化大肠杆菌：将重组载体导入大肠杆菌细胞中，通常使用热激转化或电转化的方法。
4.选择性培养：将转化后的菌液接种到选择性培养基上，以筛选含有外源基因的细菌。
5.表达蛋白质：使用适当的培养条件和诱导方法，促使含有外源基因的细菌表达目标蛋白质。
6.蛋白质纯化：利用亲和层析、离子交换层析等技术，对目标蛋白质进行纯化。
大肠杆菌表达系统的应用大肠杆菌表达系统在蛋白质表达领域具有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1.重组蛋白质的生产：大肠杆菌表达系统可用于大规模生产重组蛋白质，如重组人胰岛素等。
2.蛋白质结构和功能研究：通过大肠杆菌表达系统，可以表达和纯化具有特定结构和功能的蛋白质，用于研究其结构和功能。
3.抗原制备：大肠杆菌表达系统可以用于表达和纯化目标蛋白质，作为疫苗的抗原。
4.酶的生产：利用大肠杆菌表达系统表达酶，可以实现酶的大规模生产，用于工业生产和生物催化等领域。
总结大肠杆菌表达系统是一种高效、经济且易于操作的蛋白质表达系统。
最新【生物课件】第六章 真核基因在大肠杆菌中的表达讲学课件
通过蔗糖梯度离心将微细胞与 正常细胞分开，含有质粒载体的 微细胞是适于检测重组子质粒所 携带的外源基因表达状况的理想 体系。
Example:
ColE1的衍生质粒（缺失了106dal）,
在微细胞中不能合成出56 103dal、 42 103dal、30 103dal、 28 103dal四 种多肽。其中3种多肽是大肠杆菌E1的降解 产物。当一段含有EcoR1甲基化酶的DNA 片断插入到卡那霉素基因内部时，便能在 微细胞中合成EcoR1甲基化酶和另外2种其 它的多肽分子。
大肠杆菌格外偏爱使用终止子UAA， 尤其是在其后加上U形成UAAU四联 核苷酸的情况下，转译终止的效率 便会得到进一步的增强。
功能启动子的分离：
一般程序：
1. 选用一种适当的核酸内切酶，消化切 割大肠杆菌的染色体DNA，
2. 接着将切割产生的DNA限制片断群体， 同一种无启动子的质粒载体重组，按 实验设计要求使克隆的片断恰好插入 在紧邻报告基因的上游位置
巨细胞检测法
1. 经紫外线照射的大肠杆菌recA uvrA细 胞，DNA停止合成，而质粒载体则可以 继续合成，在紫外线照射后6小时，细 胞内质粒DNA的数量增加了10倍左右， 在紫外线照射后的几个小时内，加入经 放射性标记的氨基酸，此时合成的蛋白 质绝大部分是质粒基因所编码的。
2. 将含有外源基因的λ噬菌体重 组子，感染到事先经过紫外线严格 照射的大肠杆菌细胞上。由于细胞 经紫外线照射使DNA受到了损伤， 自身基因的表达受到了严重的抑制。 通过同λ噬菌体载体编码的蛋白质 种类作比较，就可以鉴定出克隆基 因编码的蛋白质产物。
3. 转译起始序列
5’-末端结构特征，决定mRNA的转 译起始效率。
在核糖体结合位点（RBS）的序列 结构中，增加腺嘌呤和胸腺嘧啶脱 氧核苷残基含量的比例，诱发碱基 发生定点突变；或使用转译偶联系 统进行克隆基因表达
大肠杆菌表达系统课件
THANKS
感谢观看
3
使用表达优化后的载体，提高表达效率
改进方案提出与实施效果评估
01
02
03
优化培养条件和诱导策 略
调整诱导剂浓度、诱导 时间和温度等参数
使用分阶段诱导策略， 降低蛋白表达速度，促
进正确折叠
改进方案提出与实施效果评估
01
引入伴侣蛋白和辅助因子
02
共表达伴侣蛋白，促进蛋白正确折叠和组装
03
添加辅助因子，提高蛋白稳定性和溶解度
大肠杆菌表达系统实例分析
成功案例展示及经验分享
案例一：高效表达目 标蛋白
优化诱导条件和培养 参数
选择强启动子和合适 载体
成功案例展示及经验分享
目标蛋白表达量高，纯度高 案例二：实现复杂蛋白表达
利用伴侣蛋白和辅助因子
成功案例展示及经验分享
调整诱导时间和温度 成功表达具有生物活性的复杂蛋白
失败案例剖析及原因探讨
学Hale Waihona Puke 实践操作指点实验前准备指点学生熟悉实验器材、 试剂和操作方法，确保实 验顺利进行。
实践操作注意事项
强调实验过程中的安全、 卫生和规范操作，避免误 操作导致实验失败或影响 实验结果。
数据记录与分析
指点学生记录实验数据， 学会分析和解读实验结果 ，培养科学思维和实验技 能。
问题解答与互动讨论
实验原理解答
优化培养温度和时间
降低培养温度、延长培养时间有助于蛋白正确折叠。
改进纯化流程提高效率
选择合适纯化方法
根据蛋白性质选择亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方 法组合使用。
优化纯化条件
调整洗脱液成分、pH值及盐浓度等条件，提高纯化效果。
基因工程 第六章 真核基因在大肠杆菌中的表达
Ecoli DNA
2.无启动子的CAT质粒载体 CAT活性的检测： 氯霉素乙酰转移酶 可以催化氯霉素（2-或3-） 发 乙酰辅酶A
利用CAT基因 进行功能启动子 的分离和活性测定
薄层层析 放射自显影
3.使用tetr作报告基因分离功能启动子
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架
2. 是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的 寄主菌株和不同类型的载体； 3. 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现 有效、高水平的表达； 4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于 批量生产。
大肠杆菌表达体系
大肠杆菌中表达体系的不足 1. 真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。 2. 真核基因的转录信号同原核的不同。 细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含有 具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。 3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基 因mRNA稳定性。
筛选Apr、Tcs的转化子
3.核糖体结合位点
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转 录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起 始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分 子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数 百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序列 所决定，称为核糖体结合位点（RBS）
基地水平转录
阻遏蛋白
乳糖启动子Plac的可控性 野生型的Plac与 其控制区Olac偶联 在一起，在没有诱 导物存在时，整个 操纵子处于基底水 平表达；诱导物可 以使启动子Plac介 导的转录大幅提高 P
乳糖 异丙基β－ D硫代半乳糖苷 IPTG
O
诱导
高效转录
大肠杆菌表达系统
-35 区序列 TTTACA TTGACA TTGACA TAGACA TTGACA TTGATA
P tac = 3 P trp = 11 P lac
-10 区序列 TATAAT T TAA C T TATAAT TAAT G T GATACT TATAAT
启动子
Lac 表达系统
以大肠杆菌 lac 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统 转录调控机理
Trp 表达系统
去除 色氨酸
加入 IAA
RNA
聚合P酶trp
Otrp
基底水平转录
RNA 聚合酶
Ptrp
RNA 聚合酶
Ptrp
高效转录
Otrp
mRNA Otrp
高效转录
mRNA
启动子
PL 和 PR 表达系统
以 l 噬菌体早期转录启动子 PL 、 PR 为核心构建的表达系统
在野生型 l 噬菌体中， PL 、 PR 启动子转录与否决定了 l 噬菌体进入
lacO
lacZ lacY lacA
Lac 表达系统
lac UV5 突变体 Plac UV5 突变体能够在没有 CAP 存在的情形下非常有效的起始 转录，受它控制的基因在转录水平上只受 lacI 的调控，因此用它 构建的表达载体在使用时比野生型 Plac 更易操作。
Lac 表达系统
负调节因子 lac I 在无诱导物情形下， lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动 子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。
因此 PL 、 PR 表达系统都选用温度敏感突变体 cI 857(ts) 的基因产物 来调控 PL 、 PR 启动子的转录。
在较低温度（30℃）时以活性形式存在 在较高温度（42℃）时失活脱落
大肠杆菌表达系统详细表格课件
整合载体
整合载体的特点
整合载体可将外源基因整合到宿 主细胞的染色体上，实现稳定遗
传。
应用范围
整合载体适用于基因治疗、基因 组编辑等领域，可提高外源基因
在宿主细胞内的稳定性。
注意事项
整合载体的构建需谨慎选择整合 位点，以避免对宿主细胞基因组
造成不良影响。
噬菌体载体
噬菌体载体的特点
噬菌体载体利用噬菌体感染宿主细胞，将外源基 因表达于噬菌体表面。
宿主菌的基因改造与优化
01
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基因敲除
去除不必要或有害的基因，提 高表达效率和稳定性。
基因定点突变
通过改变基因序列以改良宿主 菌的某些特性，如提高蛋白表
达量。
基因融会与串联
将多个基因串联或融会，以实 现多蛋白表达或增加蛋白表达
量。
质粒优化
改进质粒复制、拷贝数和稳定 性，提高重组蛋白的表达水平
感谢观看
。
2023
PART 04
大肠杆菌表达系统的载体 选择与构建
REPORTING
质粒载体
质粒载体的特点
注意事项
质粒载体是大肠杆菌表达系统中常用 的载体类型，具有自我复制能力强、 拷贝数高等特点。
质粒载体的构建需考虑选择合适的复 制子、挑选标记以及多克隆位点等要 素。
应用范围
质粒载体适用于克隆中到大型基因以 及基因簇，并能在宿主细胞内进行高 拷贝复制。
REPORTING
定义与特点
定义
大肠杆菌表达系统是一种利用大肠杆 菌作为宿主细胞，通过基因工程技术 将外源基因在宿主细胞内进行表达的 生物反应体系。
特点
大肠杆菌表达系统具有生长速度快、 培养成本低、易于工业化生产等优点 ，广泛应用于基因工程药物、酶制剂 、生物材料等的研发和生产。
大肠杆菌表达系统
大肠杆菌表达系统本文主要介绍了大肠杆菌蛋白表达原理、具体操作步骤、大肠杆菌表达系统及其与其他系统的比较等。
诱导原理：Lac阻遏物是一种具有4个相同亚基的四级结构蛋白，都有一个与诱导剂结合的位点。
在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态，Lac阻遏物能与操纵基因O结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。
而当有诱导剂与阻遏蛋白结合后，其蛋白构象就发生变化，导致阻遏物从操纵基因O上解离下来，RNA聚合酶不再受阻碍，发生转录。
大肠杆菌表达系统步骤不包括基因构建等上游操作和蛋白纯化部分。
基因构建参考密码子优化，蛋白纯化参考蛋白纯化专题。
以下内容主要包括蛋白表达鉴定：1.表达鉴定第一天的任务，常用抗性选择根据感受态细胞选择•拿到质粒，离心（3000r/min；2min）•在质粒中加入TE（使质粒最终加入到110μL感受态细胞中的量为80-100ng，据此确定加入TE的量），一般为（1μg质粒加20μLTE；2μg质粒加50μLTE；5μg质粒加100μL TE）•将质粒与TE混匀，加入2μL混液于感受态细胞中•将感受态细胞放入冰箱（4℃）中，30min•取出后立即放入水浴锅中（42℃），热激90s,•再次放入冰箱（4℃）中，3min•拿出后取200μL的LB液体培养基加入到已转入质粒的感受态细胞中•放入摇床（37℃; 195r）中, 30nim至60min; （最佳45min）•取出离心（3000r/min；2min）•去掉200μL的上清，留100μL左右上清悬浮沉淀，吸取50μL 悬液涂平板，（先将对应抗性的平板放入培养箱（37℃）中预热20min）•把平板放入培养箱（37℃），过夜（12h至16h）2. 表达鉴定第二天的任务,注意Pcold的表达温度•每个平板挑取单菌落至4支对应抗性的L（4ml）试管中，编号为“0”“1”“2”“3”•将试管放入摇床（37℃；195r）中，（单抗3h左右；双抗4左右；刚开始用可见分光光度计测OD值；熟练后可目测（背光下，以试管中的枪头为例，刚刚看不见枪头即可）），测OD值（0.6至0.8）•从“0”号管中取700μL悬液加入到100μL（C=80%）的保种甘油中，震匀，放入冰箱（-20℃）冻存•在每组菌的“1”“2”“3”号试管中分别加入2μL的IPTG（终浓度0.5mM最适）•视不同的载体选择适合的表达环境（PET/PGEX：15℃表达过夜；25℃表达6h；37℃表达3h至4h（4支试管，“0”“1”号试管15℃表达过夜；“2”“3”试管37℃表达3h至4h）。
大肠杆菌表达系统
调控方式为控制 T7 RNA 聚合 酶的启动子调控类型
ColE1 ori
AmpR
T7 启动子
目的基因
热诱导
T7 RNA 聚合酶
PL 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
cI857
p15A ori
KanR
T7 表达系统存在的问题
T7 表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的，但 也不可避免出现在相对较高的本底转录，如果目的基因产物对大肠杆 菌宿主有毒性，会影响细胞的生长。
因此 PL 、 PR 表达系统都选用温度敏感突变体 cI 857(ts) 的基因产物 来调控 PL 、 PR 启动子的转录。
在较低温度（30℃）时以活性形式存在 在较高温度（42℃）时失活脱落
PL 和 PR 表达系统
宿主菌中没有 cI 基因产物，PL、PR 启动子的高强度直接转录，带有PL
或 PR 启动子的表达载体在普通大肠杆菌中相当不稳定。
其他表达系统
pH调控型 采用大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因 cadA 启动子构建表达载体。
cadA 启动子受培养基中 H+ 浓度，即 pH 值调控。（在pH﹥8 时抑 制，pH ﹤ 6时激活，pH = 6时转录活力最高）。
用噬菌体 DE3 的溶源菌作为表 达载体的宿主菌，调控方式为 化学诱导型，类似于 Lac 表达 系统。
E.Coli （DE3）
T7 启动子
目的基因
IPTG 诱导
T7 RNA 聚合酶
lac 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
T7 表达系统
转录调控的机理 温度诱导型 PL 启动子控制 T7 RNA 聚合 酶基因，通过热诱导方式激发 T7 噬菌体启动子的转录。
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T4噬菌体的Pin基因产物是大肠杆菌蛋白酶的抑制剂
，可以将pin克隆到质粒中，转化大肠杆菌，保护
外源蛋白。如干扰素的生产
胰岛素的结构及其生物合成
胰岛素是治疗糖尿病的特效药，在临床上具有 十分重要的作用。天然的胰岛素通常是从猪或牛 的胰脏组织中提取的，由于来源少，含量低，因
此价格十分昂贵，限制了实际用途
待测启动子序列与上述序列的相似程 度越高，其表达能力越强
n
lacUV5启动子，是由lac启动子衍生而来，部分序 列有些改变。野生型的lac启动子要启动转录必须
具备两个条件：活化蛋白和cAMP等正调控因子，
和乳糖或IPTG等解除负调控的物质同时存在。而
lacUV5比野生型lac启动子更强，且对分解产物抑
Mitochondria Debrin Colocalization
Apoptosis 12 (7): 1155-1171, 2007
目的蛋白的回收
黄嘌呤核苷（Ion）是大肠杆菌合成蛋白酶的主要底 物，Ion-营养缺陷型宿主菌不能合成黄嘌呤核苷， 从而不能合成蛋白酶，保护外源蛋白
制不敏感，不需要活化蛋白和cAMP。在仅有乳糖
或IPTG存在时就能启动转录
双质粒表达系统
用trp启动子驱 动编码cI阻遏 蛋白的基因， 然后将他们置 于一个低拷贝 的质粒上；将 需要表达的基 因置于PL启动 子的下游，使 其表达受PL启 动子的调控
采用这种双质粒系统，细胞可以用很便宜的含糖浆
(2)滤膜结合法分离 双链DNA不能与硝酸纤维素薄膜有效结合，而 DNA-蛋白质复合物却能在一定条件下结合在膜上 将待检测DNA片段与RNA聚合酶保温，并转移至 膜上，温和漂洗薄膜，除去末结合RNA聚合酶的双 链DNA片段，再用高盐溶液将结合在薄膜上的DNA 片段洗下 DNA片段在膜上的滞留程度与其同RNA聚合酶的 亲和性(即启动子的强弱)成比例 这种强弱难以量化，需要将之克隆在探针质粒上 进行检测
哺乳动物细胞等
大肠杆菌表达系统具有明显的优越性
大肠杆菌高效表达真核基因,涉及到三方面
强化蛋白质的生物合成
主要为外源基因剂量（拷贝数）、基因转录水
平、mRNA翻译速率的时序性控制，这种控制是
在重组分子构建过程中通过相应表达调控元件的
精确组装来实现
抑制蛋白产物降解
维持或恢复蛋白质特异空间构象
6 外源基因在大肠杆菌中的表达
人的胰岛素的编码基因位于第11号染色体上，
只有一个拷贝。胰岛素本身不是基因的直接产物
，而是经过多次加工间接形成的
基因的直接产物为前胰岛素原－胰岛素原－胰
岛素分子
（molasses）及酪蛋白水解物的培养基进行培养
，这种培养基只含有少量游离的色氨酸。在进行
诱导时，向培养基中加入蛋白胨，它含有足够的
色氨酸
包涵体蛋白的变性与复性操作
1、收获与洗涤：包括细菌的收获、洗涤、破碎和离心收集适
当的组分。一般在5000-10000g离心分离包涵体 洗涤液可用1%以下的中性去垢剂如Tween、Triton、 NP40等，并在其中加入EDTA和二硫苏糖醇（DTT）、巯 基乙醇等还原剂，盐浓度保持在50mmol/L水平。也可以用
第六章 大肠杆菌中表 达系统
基因工程的重要目标之一,是制备大量的纯化蛋白
质产物。为此就需要有一种能够高水平表达异源真
核蛋白质或重组蛋白质的表达系统
良好的表达系统应包括多方面的因素，如寄主细
胞的生长特性、蛋白质产物转移后的修饰与生物活
性，以及异源蛋白质的表达水平及分泌方式等
目前这种表达系统有细菌、酵母、昆虫、植物和
用两种受体菌功能多肽编码序列将目的基因与绿色荧光蛋白基因（GFP）融合，通 过绿色荧光蛋白的荧光效应以对目的蛋白进行细胞 或亚细胞定位
限制性内切酶位点 目的蛋白基因 启动子 P Target 终止子
Linker (poly-G) P EGFP Target
Actin
endoG-YFP (apoptotic endonuclease)
优化表达调控元件，应考虑以下方面 1· 转录启动子和终止子的特点 2· 核糖体结合位点的强弱 3· 基因拷贝数及其是存在于质粒中，还是整合 到寄主基因组中 4· 合成的外源蛋白在细胞中的定位 5· 寄主的翻译效率 6· 所表达的蛋白在寄主中的自身稳定性
启动子
最佳启动子应具备的条件 1、强启动子 能使克隆基因的表达蛋白占细胞蛋白总量的 10％～30％以上 2、能呈现低限的基础转录水平 在表达毒性蛋白质或有损于寄主生长的蛋白 质时，使用高度抑制型的启动子 3、诱导型启动子 能通过简单的方式，或廉价的诱导物得以诱 导。如大批量制备蛋白质时，热和化学诱导
启动子
启动子的分离
1、将目标原核细胞的染色体DNA用某一种限制性 内切酶切成小的DNA片段 2、将这些DNA片段分别插入到一个缺乏自身启动 子的报告基因的上游 3、通过抗性筛选表达强度高的克隆 4、对报告基因前的插入DNA片段进行分析，即可 得到活性启动子
采用galK为报告基因的pKO1载体系统优点 1、可以根据转化子细胞中半乳糖激酶的产量的 多少，鉴定启动子的强弱 2、根据在麦氏培养基中的菌落颜色特征，分离 功能启动子
低浓度盐酸胍或尿素与中性去垢剂、EDTA等还原剂共同组
成洗涤剂。其目的是去除吸附在包含体表面的不溶性杂蛋白 ，加入的洗涤液可通过柱层析等方法去除
2、
融合蛋白中的大肠杆菌蛋白或多肽部分除了具备高 效表达的基本条件外，还同时具会下列特性中的一种 或多种
维持整个融合蛋白分子的理想空间构象，以增加其水溶性 促进融合蛋白定位于细胞周质或外膜，以实现其可分泌性 提供融合蛋白一个用于亲和层析分离的靶多肽序列以简化 异源蛋白的纯化程序 有时为了使融合蛋白分子同时具备上述多重特性，也可选