牛血清白蛋白的提取与鉴定演示教学

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牛血清白蛋白的提取与鉴定

一、实验目的

1. 掌握牛血清白蛋白的提取与鉴定方法

2.掌握盐析法、透析法及电泳法

二、实验原理

牛血清白蛋白是牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。应用相同浓度硫酸铵盐析法将血清中白蛋白与其它球蛋白分离，最后用透析法除盐，即可提取白蛋白。再利用电泳过程中带电粒子的移动速度与粒子荷电量、电场强度、粒子重量与半径及介质的黏稠度等有关，对牛血清白蛋白进行分离与鉴定。

三、操作步骤

（一）盐析取离心管一支加入牛血清2mL、加入等量PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）稀释血清，摇匀后，逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2mL，边加边摇，充分混匀，然后静止放臵10分钟，再离心（2000r/min）10min，将上清液倾入试管中。

（二）透析（1 ）取干净的比色板，在各孔内滴加一滴纳氏试剂

（2）透析袋未放入水中时，立即取水中液体检查有无NH4+

(3)取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙），用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯内，使透析袋下半部侵入水中，对蛋白液进行透析，常用玻璃棒搅拌袋外（烧杯中）液体，以缩短透析时间。

(4)每隔2分钟检查一次，更换蒸馏水多次，用纳氏试剂检查袋外液体的NH4+，观察颜色变化并记录，直至袋内盐分透析完毕。

(5)将袋内液体倾入试管，即得牛血清白蛋白溶液。

（三）电泳（1）点样取一张膜条，将薄膜无光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透，取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，以薄膜的无光泽面距一端1.5㎝处作点样线，将牛血清样品与待测的牛血清白蛋白溶液分别用点样器在同一张薄膜的点样线处不同位置点样。标准液点一次，待测液点三次。

（2）电泳将点样后的膜条臵于电泳槽架上，放臵时膜条无光泽面向下，点样端臵于阴极，待平衡5min后，打开电源，调节电泳仪的电压为160伏，通电60min，关闭电源后用镊子将膜条取出。

（3）染色将膜条直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染2分钟取出，立即浸于漂洗液中，分别在漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各漂洗5min，直至背景漂洗干净为止，用滤纸吸干薄膜。（4）鉴定比较样品与待测液中白蛋白在薄膜上的电泳结果，看位置是否一致。

四、仪器和试剂

仪器：离心管、离心机、试管、玻璃纸、烧杯、比色板、滴管、玻璃棒、电泳仪、醋酸纤维素薄膜、天平

试剂：牛血清待测液、牛血清样品、PBS（磷酸盐缓冲生理盐水，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）配制的0.9%NaCl溶液）、pH7.2饱和硫酸铵溶液、纳氏试剂、巴比妥缓冲液、氨基黑10B染色液、漂洗液

五、预测结果位置一致，实验成功。若在待测液的电泳结果中出现其他球蛋白的黑带区域，则说明提取不够纯。

六、参考文献[1]陆红玲.生物化学与分子生物学实验教程.西安:第四军医大学出版社,2010

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