3实验三细菌革兰氏染色

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细菌涂片的制备及革兰氏染色实验报告

细菌涂片的制备及革兰氏染色实验报告

实验三细菌涂片的制备及革兰氏染色[实验目的]1、掌握细菌涂片的制备方法及革兰氏染色。

2、学习无菌操作,树立无菌观念。

[实验原理]细菌细胞微小,无色而半透明,在普通光学显微镜下不易识别,必须借助染色使菌体着色(由于毛细管、渗透、吸附和吸收等物理作用以及离子交换、酸碱亲和等化学作用,染料能使细菌着色,并且因细菌细胞的结构和化学成分不同而有不同的染色反应)后,使其与背景形成明显的色差,从而能较清楚的观察到细菌的基本形态和结构。

根据不同的染色反应,可作为鉴别细菌的一种依据。

微生物染料是一种带苯环的有机化合物,其分子上具有发色基团和助色基团。

前者给化合物以特有的颜色,但不能与细菌结合;后者使化合物具成盐的性质,能和菌体结合。

分为碱性染料、酸性染料和中性染料三类。

根据细菌个体形态观察的不同要求,可将染色分为三种方法即简单染色、鉴别染色和特殊染色。

革兰氏染色:1884年由丹麦病理学家C.Gram创立。

此法可将所有细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类。

是细菌学上最常用的鉴别染色法,有着重要的理论和实践意义。

其染色过程是先用草酸铵结晶紫进行初染,再加媒染剂-革兰氏碘液,以增加染料和细胞的亲和力,使结晶紫和碘在细胞膜上形成相对分子量较大的复合物,然后用脱色剂-乙醇脱色,最后用沙黄液复染。

凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色(紫色)者即为G+菌,反之,脱色后染上复染剂颜色(红色)者即为G-菌。

其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同,通过染色加以鉴别。

革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚,交联而成的肽聚糖网状结构致密,且类脂质含量少,经乙醇处理发生脱水作用后反而使其孔径缩小,通透性降低,结晶紫-碘形成的复合物保留在细胞内而不被脱色,结果细胞呈现紫色。

而革兰氏阴性菌的的肽聚糖层薄,网状结构交联少,而且类脂质含量较高,经乙醇处理后,细胞壁孔径变大,通透性增加,结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁,结果细菌被脱色,再经沙黄复染后呈现红色。

实验三细菌的革兰氏染色(Gram stain)

实验三细菌的革兰氏染色(Gram stain)

肽聚糖(peptidoglycan) 肽聚糖
革兰阳性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链、 革兰阳性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥
N-乙酰葡糖胺 N-乙酰胞壁酸
溶菌酶作用点
青霉素作用点
肽聚糖(peptidoglycan) 肽聚糖
革兰阴性菌肽聚糖—聚糖骨架、 革兰阴性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链
大肠杆菌革兰氏染色
炭疽芽胞杆菌
五、实验报告
1.结果 . 列表比较大肠杆菌、 列表比较大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和未知菌 的染色反应,并判断它们分别是G 的染色反应,并判断它们分别是 -或G+. 2.思考题 . (1)作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚? )作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚? 其染色成败的关键一步是什么? 其染色成败的关键一步是什么? (2)当你对一株未知菌进行革兰氏染色时, )当你对一株未知菌进行革兰氏染色时, 怎样能确证你的染色技术操作正确, 怎样能确证你的染色技术操作正确,结果 可靠? 可靠?
2.染色
(1)初染:加草酸铵结晶紫一滴,约一分钟, )初染:加草酸铵结晶紫一滴,约一分钟, 水洗。 水洗。 (2)媒染:滴加碘液冲去残水,并覆盖约一 )媒染:滴加碘液冲去残水, 分钟,水洗。 分钟,水洗。 (3)脱色:将载玻片上面的水甩净,并衬以 )脱色:将载玻片上面的水甩净, 白背景, 白背景,用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚 % 不出现紫色时为止, 秒钟, 不出现紫色时为止,约20~30秒钟,立即 ~ 秒钟 用水冲净酒精。 用水冲净酒精。 分钟, (4)复染:用番红液染 ~2分钟,水洗。 )复染:用番红液染1~ 分钟 水洗。
• 革兰氏染色需用四种不同的溶液:碱性染料 革兰氏染色需用四种不同的溶液: (basic dye)初染液;媒染剂 )初染液; );脱色剂 (mordant);脱色剂(decolorising );脱色剂( agent)和复染液(counterstain)。 )和复染液( )。 • 碱性染料初染液 碱性染料初染液——结晶紫(crystal 结晶紫( 结晶紫 violet) ) • 媒染剂 媒染剂——碘(iodine) 碘 ) • 脱色剂——95%的酒精(ethanol) 脱色剂 %的酒精( ) • 复染液 复染液——番红 番红

微生物实验3之革兰氏染色

微生物实验3之革兰氏染色

华中科技大学微生物学实验报告班级:生物制药1101班日期:2013 年 3 月16 日指导教师:邬建国实验组别:启明七组姓名:何明组员姓名:张玉涛、王远馨实验名称:革兰氏染色一、实验目的1.学习并掌握革兰氏染色的方法。

2.简单进行样品的革兰氏染色辨别样品中细菌类别二、实验原理1.革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法,细菌先经碱性染料结晶紫染色,再经碘液媒染后,用酒精脱色,在一定条件下有的细菌紫色不被脱去,有的可被脱去,因此可把细菌分为两大类,前者叫做革兰氏阳性菌(G+),后者为革兰氏阴性菌(G-)。

2为观察方便,脱色后再用一种红色染料,如碱性番红等进行复染。

阳性菌仍带紫色,阴性菌则被染上红色。

有芽孢的杆菌和绝大多数球菌,以及所有的放线菌和真菌都成革兰氏正反应;弧菌,螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都成负反应。

3.革兰式阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别,染色反应不一样,染色与细菌细胞壁的化学组成及结构有关。

4.阳性菌菌体等电点较阴性菌低,在相同pH条件下染色,阳性菌吸附碱性染料较多,因此不易脱去,阴性菌则相反。

三、实验材料菌种:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌;检测样品:含活菌酸奶染料:草酸铵结晶紫液、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液其他:显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌生理盐水、香柏油、二甲苯四、实验方法(一)涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫染色(1min )→水洗→路哥氏碘液媒染(1min )→水洗→95%乙醇脱色(30s )→水洗→番红复染(5min )→水洗→干燥→镜检。

关键点:1.严格掌握乙醇脱色程度,如脱色过度,则阳性菌被误染为阴性菌; 而脱色不够时,阴性菌被误染为阳性菌;2.菌龄也影响染色结果,如阳性菌培养时间很长,或已死亡及部分自行溶解了,都常呈阴性反应。

(二)黑曲霉菌属于真菌,细胞较大,可用水片进行观察,,先在载玻片上滴一滴水,接种,盖上载玻片,即可拿到显微镜下观察.五、实验结果与分析1.对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别进行革兰氏染色(拍照,注明放大倍数)大肠杆菌放大倍数40x 金黄色葡萄球菌,放大倍数100x ,油浴2.对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合涂片进行革兰氏染色(拍照,注明放大倍数)大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合涂片,放大倍数100x,油浴3.酸奶中乳酸菌的革兰氏染色(拍照,注明放大倍数)4.黑曲霉菌水片观察六、思考题1.你的实验结果与课本中所述是否一致?如果不一致,试分析原因。

实验三讲义 细菌的染色及形态观察

实验三讲义 细菌的染色及形态观察
3.2.2 初染。滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位,染色1-2min 后倾去染液,水洗。(教师示范)
3.2.3 媒染。先用卢戈氏碘液冲去载片上残留水迹,再用碘液 覆盖1 min,水洗。
3.2.4 脱色。滴加95%乙醇脱色20-30s ,立即水洗。
3.2.5 复染。用吸水纸吸去载片上残留水,用番红复染液染色 2 min,水洗,吸干水迹。
3.2 方法 C. 细菌形态观察

低倍镜观察 4×,10 ×
高倍镜观察 (40×,找到合适观察目标,移至视野中心)
油镜观察(100×) 将高倍镜转离工作位置,在要观察的涂菌部位滴加一滴 镜油,将油镜转至工作位置,聚光器升至最高,调节照明 度,调节细调节器,使物像清晰。
绘图 在所观察的图像中选取典型部位绘图,要求左眼观察图像, 右眼观察绘图;球菌应注意长度与直径之比,球菌应注意排 列状况;有芽胞的细菌应标记芽胞和营养体的位置;图下方 应标明图的名称、放大倍数、染色结果。
3 材料与方法
3.1 实验器材
3.1.1 药品:革兰氏染色液:草酸铵结晶紫染液、革兰氏碘液、 95%乙醇、番红染液,无菌生理盐水。 芽胞染色液:孔雀绿染色液,番红染色液
3.1.2 菌种: Escherichia coli(大肠杆菌)、 Staphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌)培养18-24 h菌落平板, Bacillus thuringiensis(苏云金芽孢杆菌)培养24 h菌落平板。
3.2 方法 B. 芽胞染色法
3.2.1 制片:按革兰氏染色方法操作。 (取菌落中央和边缘的菌体)
3.2.2 染色。用试管夹夹住载片,滴加孔雀绿染液3-5滴于涂菌 部位,置酒精灯火焰上加热5-8 min ,加热过程要随时滴加染色 液,防止煮沸或干涸。 3.2.3 水洗:载片冷却后水洗。

实验三革兰氏染色

实验三革兰氏染色

革兰氏染色– 染色
6 镜检 干燥后,用油镜观察。蓝紫色为G+,红色为G-。 7 混合涂片染色 将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作混合涂片、染色、镜检进行 比较。
Procedures of Gram Staining
Gram positive or Gram negative?
实验报告
1.绘图说明经革兰氏染色后大肠肝菌和金黄色葡萄球 菌的染色结果。
细菌的等电点较低,pH值大约在2—5之间,故在中性、碱性或弱酸 性溶液中,菌体蛋白质电离后带负电荷;而碱性染料电离时染料离子带 正电。因此,带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。所以,在 细菌学上常用碱性染料进行染色。
2 染色方法
微生物染色方法一般分为单染色法和复染色法两种。前者用一种染 料使微生物染色,但不能鉴别微生物。复染色法是用两种或两种以上染 料,有协助鉴别微生物的作用,故亦称鉴别染色法。常用的复染色法有 革兰氏染色法和抗酸性染色法,此外还有鉴别细胞各部分结构的(如芽 胞、鞭毛、细胞核等)特殊染色法。
革兰氏染色– 制片
A.ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ加小滴水
B. 涂成薄层
C. 固定菌体
2 初染 滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜),染色1-2 min,水洗。 3 媒染 用碘液冲去残水,并用碘液覆盖菌膜约1min,水洗。 4 脱色 用滤纸吸去玻片上的残水,将玻片倾斜,用滴管流加95%的乙 醇脱色,直至流出的乙醇无紫色时,立即水洗。脱色时间一般 液20-30 S。脱色不足与过度都会影响和改变染色的结果。 5 复染 用番红液复染约2min,水洗。
实验三 细菌的单染色与革兰氏 染色法
1 微生物染色的基本原理
微生物染色的基本原理,是借助物理因素和化学因素的作用而进 行的。物理因素如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作 用等。化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性质而发生的各种化 学反应。酸性物质对于碱性染料较易吸附,且吸附作用稳固;同样, 碱性物质对酸性染料较易于吸附。如酸性物质细胞核对于碱性染料就 有化学亲和力,易于吸附。

实验三简单染色法和革兰氏染色法

实验三简单染色法和革兰氏染色法

实验三简单染色法和革兰氏染色法实验三简单染色法和革兰氏染色法(一)细菌的简单染色法1实验目的1.1熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能1.2学习微生物涂片、染色的基本技术1.3掌握细菌的简单染色法1.4初步认识细菌的形态特征,学习油镜的使用方法和无菌操作技术2 实验原理细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。

细菌的细胞小而透明,在普通的光学显微镜下不易识别,必须对它们进行染色。

利用单一染料对细菌进行染色,使经染色后的菌体与背景形成明显的色差,从而能更清楚地观察到其形态和结构。

此法操作简单,适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。

用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。

一般使用碱性染料进行简单染色。

碱性染料的离子带正电荷,能和带负电荷的物质结合。

因细菌蛋电质等电点较低,当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷,因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。

经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比,在显微镜下更易于识别。

常用作简单染色的燃料有美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等。

酸性染料的离子带负电荷,能与带正电荷的物质结合。

当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时,细菌所带正电荷增加,因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。

染色前必须固定细菌,其目的有二:一是杀死细菌并使菌体黏附于玻片上;二是增加对染料的亲和力。

常用的有加热和化学固定两种方法。

固定时尽量维持细胞原有的形态。

3实验材料3.1菌种金黄色葡萄球菌约18h营养琼脂斜面培养物,大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物。

3.2染色剂草酸铵结晶紫染液,番红染液。

3.3仪器或其他用具显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签等。

4 流程涂片干燥固定染色水洗干燥镜检5 步骤5.1涂片在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴生理盐水或无菌蒸馏水,用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀,涂成薄膜,涂布面积约1~1.5cm2。

实验三细菌革兰氏染色法

实验三细菌革兰氏染色法

实验三细菌革兰氏染色法【目的要求】了解革兰氏染色原理;掌握革兰氏染色的方法。

【基本原理】革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法,1884 年由丹麦医师Gram 创立。

未经染色之细菌,由于其与周围环境折光率差别甚小,故在显微镜下极难观察。

染色后细菌与环境形成鲜明对比,可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征,而用以分类鉴定。

革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性(G+)和革兰氏阴性(G-)两种类型,细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。

革兰氏染色的主要步骤包括初染、媒染、脱色和复染。

首先利用草酸铵结晶紫初染,所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。

然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理,由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物,增强了染料在菌体中的滞留能力。

之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时,两种细菌的脱色效果不同。

革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高,壁厚且脂质含量低,肽聚糖本身并不结合染料,但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物,现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁,菌体保持原有的蓝紫色。

而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低,交联度低,壁薄且脂质含量高,乙醇处理时脂质溶解,细胞壁通透性增加,原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来,菌体变为无色。

而在最后用复染步骤(染色剂为番红),染色后变为复染剂颜色(红)。

【实验器材】1.革兰氏染色液:①草酸铵结晶紫甲液:结晶紫(2 g)、乙醇(95%)(20 mL);乙液:草酸铵(0.8 g)、蒸馏水(0.8 mL);将甲、乙两液混合,静置48h 后使用,该染液稳定,在不透气的棕色瓶中可存储数月。

②卢戈氏碘液碘(1 g);碘化钾(2 g);蒸馏水(300 mL)先将KI溶于少量(3-5 mL)蒸馏水中,再放入碘,待碘全溶后,加水至300 mL。

此液稳定,可在不透气的棕色瓶中保存数月。

③脱色液:95%乙醇④复染液:即2.5%蕃红(沙黄)水溶液。

细菌的简单染色和革兰染色

细菌的简单染色和革兰染色

实验三细菌的简单染色和革兰染色一.实验目的1.学习并熟练局部无菌操作2. 学习细菌涂片的制法,掌握细菌简单染色和革兰氏染色的方法3. 进一步熟悉显微镜的使用。

二.实验原理细菌生长时常带负电,所以常用带正电的碱性染料染色。

简单染色就是用一种染料染色的方法。

革兰氏染色可把细菌根据细胞壁成分和结构分为阳性和阴性,阳性菌细胞壁中脂类物质多,染色为紫色;阴性菌细胞壁中脂类物质少,染色为红色。

三.实验材料、仪器与试剂1.菌种:金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌,大肠杆菌、未知菌,酵母。

2.仪器用品:显微镜、载玻片,盖玻片,擦镜纸,接种环,酒精灯,火柴,镊子,擦镜液,吸水纸,牙签3.试剂:简单染液:草酸铵甲紫染液,蕃红染液革兰氏染液:1) 草酸铵甲紫染液;2) 革氏碘液;3) 脱色液;4) 蕃红染液实验前准备(助教完成)将菌种培育24h。

四.实验步骤(一)简单染色1.取载玻片用纱布擦干,在涂菌面反面画直径2mm左右的小圈,把涂菌部位在火焰上烤一下,除去油脂。

2.涂片:左手持菌液试管,右手持接种环在火焰中烧灼灭菌,等冷却后从EP管中沾取菌液一滴,在洁净无脂的载玻片上涂涂膜。

取菌过程要在酒精灯附近的无菌环境中进行。

3.晾干:让涂片自然晾干。

4.固定:让菌膜朝上,通过火焰2-3次固定(以不烫手为宜)。

5.染色:将固定过的涂片放吸水纸上,滴加草酸铵结晶紫液,染1min。

6.水洗:用水缓慢冲洗涂片上的染色液7.镜检。

(二)革兰染色。

1.制片:取菌液制成涂片:干燥,固定。

2.初染:滴加1滴结晶紫色染液,1min,水洗。

3.媒染:滴加1滴碘液,染1min,水洗。

4.脱色:吸去残留水,滴加脱色液至流出液无紫色,立即水洗。

5.复染:滴加蕃红复染3min,水洗。

6.镜检:用吸水纸吸干,盖上盖玻片,从低倍镜到油镜依次观察。

注意细菌形态、大小、排列、颜色。

7.拍照。

(三)选做实验往干净的载波片上滴加半滴水,用无菌牙签取一点牙垢,涂抹在水滴上,制成涂片,革兰染色。

革兰氏染色

革兰氏染色
实验三 细菌的简单染色 和革兰氏染色
一、目的要求:
1、了解简单染色法和革兰氏染色原理。 2、学习并掌握细菌的简单染色法和革兰氏染色法。 3、学习并掌握油镜的使用及维护的基本知识。
二、基本原理:
1、细菌的简单染色法是指只用一种染料使细菌着
色以显示其形态的方法。
2、革兰氏染色法可把细菌分为革兰氏阳性菌和革 兰氏阴性菌两大类。结晶紫作为初染剂进行染色, 碘作为媒染剂,乙醇(或丙酮)作脱色剂,最后用复 染剂(如番红)复染。结果是由这两类细菌的细 胞壁的结构和组成不同决定的。
G﹢菌:肽聚糖层厚,类脂质少,当乙醇脱色时,肽聚糖脱水而孔障缩小,故 保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。 G- 菌:肽聚糖层薄,类脂质多,乙醇脱色不能使其结构收缩,乙醇将类脂质 溶解,缝隙加大,结晶紫-碘复合物溶出细胞壁,番红复染后呈红色。
三、操作技术
1、简单染色法:
涂片
干燥 水洗
A. 加小滴水
定其革兰氏染色反应。你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌 为对照菌株进行涂片染色,以证明你的染色结果正确性。 2 、
固定 B. 涂成薄层 染色 C. 固定菌体 干燥 镜检
2、革兰氏染色法:
(1) 制片:涂片 干燥 固定
(2) 初染:滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜) 染色1~2min 水洗。 (3) 媒染:用碘液冲去残水,并用碘液覆盖约 1min , 水洗。
(4) 脱色:将载玻片倾斜,在白色的背景下 ,用滴管 流加95%的乙醇脱色,直至流出的乙醇无紫色时,立 即水洗。
(5)复染:用番红液复染约2min,水洗。
(6)干燥 (7)镜检:10X (8)结果记录并画图
备注:对照菌株为枯草杆菌和大肠杆菌
油镜(100X)。

实验3细菌标本制备 革兰染色

实验3细菌标本制备 革兰染色

(二)革兰氏染色法


G+
G-
初染:滴加结晶紫液 媒染:加碘液 脱色:加95%酒精 复染:加石炭酸复红液
油镜观察 紫色 红色
五、结果
革兰染色
G+菌呈紫色
G-菌呈红色

革兰染色: 涂片不易过厚,薄而均匀为好; 脱色不足或脱色过度均会造成革兰染色的假 阳性或假阴性,脱色时间取决于涂片厚度、 室温等。
三、材料

葡萄球菌培养物 大肠杆菌培养物 革兰染液 生理盐水、载玻片 接种环、酒精灯、显微镜
三、材料

革兰染液: ⑴结晶紫染液 ⑵碘液 ⑶95%酒精 ⑷石炭酸复红液
四、方法
步骤:
(一)细菌标本片制作
葡萄球菌 大肠杆菌
涂片 干燥
固定
取1~2环生理盐水 挑取少细菌与盐水混匀,涂成直 径约1cm的薄膜。
1.G+菌细胞壁结构致密,粘肽层厚,酒精不易 透入,阻止染料由细胞内渗出。G-菌的细胞壁较疏 松,粘肽层薄,脂质含量多,酒精易透入被脱色。 2.G+菌等电点(pH2~3)比G-菌(pH4~5)低, G+菌所带负电荷比G-菌多,与带正电荷的结晶紫染 料结合牢固,不易脱色。
3. G+菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐与结晶紫 染料结合牢固,不易脱色; G-菌反之。
结晶紫染液碘液95酒精石炭酸复红液三材料一细菌标本片制作涂片干燥固定取12环生理盐水挑取少细菌与盐水混匀涂成直径约1cm的薄膜
医学微生物学实验
实验三
实验项目
细菌染色技术
细菌标本片的制备 革兰染色

一、目的

掌握细菌标本片制作; 掌握革兰染色方法; 熟悉革兰染色的原理与注意事项

实验三 细菌形态观察和革兰氏染色技术

实验三 细菌形态观察和革兰氏染色技术

⑥ 复染:
已经脱色处理的细胞或其结构常以复染液作复染 以便于观察。 复染液与初染液的颜色不同而成鲜明对比,所以 复染也称为对比染色。 复染液不宜太强,以免掩盖初染的颜色而失去对 比作用。
用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。 媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附着力,
即以某种方式帮助染料固定在细胞上,使不易脱落。
不同类型的细胞脱色反应不同,有的能被脱色,有的则不
能,脱色剂常用95%的酒精。
复染液也是一种碱性染料,其颜色不同于初染液,复染 的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色,而未 被脱色的细胞仍然保持初染的颜色,常用的复染液是番红。
三、结果:
② 固定:
染色前必须先行固定。其目的在于凝固细胞质和 其它细胞结构成分而杀死细菌;使菌体粘附于玻 片上以及改变细菌对染料的通透性(因活菌通常 不易使染料透入细胞内)。
固定的方法一般采用火焰加热法,在特殊目的时 也可用冷冻干燥法或化学法如醇、酸、氯化高汞 、重金属盐或氧化剂等进行固定。
③ 媒染:
① 涂片制备:
随标本的种类而略有不同。
• 若为液体培养液,亦可直接涂于载玻片上;
• 若为固体培养基上的细菌,则先取一接种环生理盐水于载玻片中 央,然后从培养基上取菌少许,在盐水中研磨均匀,使呈轻度乳 浊,以接种环扩成1cm2或2份硬币大小的涂面。
在室温下自然干燥或放在火焰上方的热空气中慢 慢烘干。但切忌紧靠火焰烤干。
⑤ 脱色:
脱色:是使被染物脱去已染上的颜色。脱色的目 的是观察细菌与染料结合的稳定程度,故可作为 鉴别染色之用。
凡具有脱色作用的化学试剂称脱色剂。脱色剂或 呈溶媒作用,如醇类、丙酮等;或能影响蛋白质 的电离程度,改变其电荷性质或数量,因而影响 细菌与染料的结合程度,如酸类能减少细菌的负 电荷,故可作碱性染料的脱色剂。

实验三细菌的革兰氏染色及芽孢染色法-文档资料

实验三细菌的革兰氏染色及芽孢染色法-文档资料
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(三)实验器材
n
1、活材料:
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革兰氏染色:培养12h-16h枯草杆菌(Bacillus subtilis)和培养 24h大肠杆菌( Evaluation only. Escherichia coli) n 芽孢染色:培养36 小时 的苏云金杆菌(Bacillus with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2 thuringiensis)或者枯草杆菌(Bacillus subtilis)
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌,是由 这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。 G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂 Evaluation only. ted with 质,而且肽聚糖层较薄、交联度低,故用乙醇或 Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2 丙酮脱色时溶解了类脂质,增加了细胞壁的通透 Copyright 2019-2019 Aspose Pty Ltd. 性,使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出,结 果细菌就被脱色,再经蕃红复染后就成红色。G+ 菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高,类脂质含量 少,经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小, 通透性降低,因此细菌仍保留初染时的颜色。

实验三 细菌的革兰氏染色

实验三 细菌的革兰氏染色

实验三细菌的革兰氏染色一、目的:1.了解革兰氏染色的原理,学习并掌握革兰氏染色的方法。

2.对比革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和芽孢经过革兰氏染色之后的不同。

二、原理:细菌细胞壁成分不同,可分为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。

革兰氏阳性菌具有很厚的肽聚糖壁,在碘液处理后结晶紫与碘液的复合物会在乙醇对细胞壁脱水后被肽聚糖壁保留,不容易被乙醇洗出,细胞壁呈蓝紫色。

而革兰氏阴性菌不具有很厚的肽聚糖壁,而且脂质很多,因此复合物很容易被能溶解脂质的乙醇洗出,最后经过番红复染呈现红色。

以对处于对数期的菌体染色为宜。

三、材料:1.菌种:大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)2.染料:草酸铵结晶紫染液,卢哥氏染液,95%酒精,番红染液3.其它:载玻片,无菌水,洗瓶,擦镜纸,吸水纸,二甲苯,香柏油,接种环,酒精灯四、实验步骤:1.涂片:取一个经过灭菌的载玻片,烘干,滴加三滴无菌水(间隔尽量大)。

点燃酒精灯,充分灼烧接种环。

在火焰附近拔出试管塞,分别灼烧试管口和塞子,使用冷却的接种环从中刮取少量群体,在一滴无菌水中涂匀。

如是制作纯种大肠杆菌、纯种金黄色葡萄球菌和混有杂菌的大肠杆菌的涂片,干燥固定。

2.染色:(1)初染:加草酸铵结晶紫染液一滴覆盖于涂片处约一分钟,水洗;(2)媒染:滴加碘液冲去残水,并用碘液覆盖一分钟,水洗;(3)脱色:倾斜载玻片,并衬以白背景,用95%的乙醇滴洗直至流出的乙醇不带紫色为止,立即用水冲净乙醇;(4)复染:用番红染液覆盖一分钟(可适当延长时间至2分钟),水洗,风干;(5)镜检:使用低倍镜和高倍镜将需要观察的位置放在视野中央,用沾有二甲苯的擦镜纸和干净擦镜纸擦洗油镜,在涂片上滴加香柏油,在油镜下观察,拍照。

(6)清理:整理桌面,将显微镜复位,废片放入废片缸内。

五、结果与讨论本次实验的成败我认为主要有这几个方面:首先,涂片的时候一定只能刮取少量菌体,而且不能带起培养基,否则会比较严重地影响观察。

实验三 革兰氏染色法

实验三 革兰氏染色法

三、器材:
大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,革兰氏染色液,
载玻片,显微镜等
四、操作步骤:
1、涂片:将大肠杆菌(24h)和金黄色葡萄球菌 (24h)分别涂片、干燥、固定。
2、染色: (1)初染:加草酸铵结晶紫一滴,约一分钟,水洗 (2)媒染:滴加碘液冲去残水,并覆盖一分钟,水洗 (3)脱色:将水甩净,并衬以白背景,用95%乙醇滴洗 至刚刚无紫色为止,约20—30秒,立即用水冲净乙醇 (4)复染:用番红液染1--2分钟,水洗
4 显微镜计数:五分钟后,先低倍镜找计数室,后 高倍镜计数。一般以每小格5—10个菌体为宜。常选 四角和中央五个中格计数。格线上菌体只数上线和 左边线。芽大于母体一半方计。同法计另一室。
5 清洗血球计数板:自来水冲洗,切勿用硬物洗刷, 自行凉干。镜检,洗净为止。
五.实验报告:1 结果;2 思考题:第(1)题。
实验三 革兰氏染色法
内蒙古科技大学 基础生物实验中心
一 目的要求: 1、学习并初步掌握革兰氏染色法。 2、了解革兰氏染色法的原理极其在细菌分类
鉴定中的重要性。
二 基本原理: 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain
Gran 创立的,基本步骤是: 1、初染:结晶紫染色 2、媒染:碘液媒染 3、脱色:乙醇脱色 4、复染:番红复染
水玻璃球三角烧瓶,1ml无菌吸管,斜面,平板, 无菌涂棒,土样。
四 操作步骤 1.倒平板; 2.制备土壤稀释液:称取土样10克,放入90ml 无菌水中,震荡20分钟,取1ml悬液于9ml无菌水 中,吹吸三次,使其充分混匀。再取1ml于下一 9ml无菌水中,以此类推,制成10-1、10-2、10-3、 10-4、10-5、10-6各种稀释度的土壤稀释液。
经此法染色后,细胞保留初染剂蓝紫色的细菌
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实验三细菌革兰氏染色及特殊结构观察
一、实验目的:
1、了解革兰氏染色法的原理,并熟练掌握其操作步。

2、了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性。

3、通过革兰氏染色进一步理解细菌细胞壁的结构特点。

4、巩固在油镜下观察微生物的个体形态。

5、学习并掌握芽孢染色法。

6、学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。

二、主要仪器设备及材料:
1、菌种:大肠杆菌,枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),金黄色葡萄球菌斜面
2、试剂:草酸铵结晶紫染色液,路哥氏(Lugol)碘液,95%乙醇,0.5%番红染色液,香柏油,二甲苯,生理盐水,5%孔雀绿
3、仪器与材料:
生物显微镜,载玻片,盖玻片,酒精灯,火柴,小试管(75mm×10mm),烧杯(300mL),滴管,接种环,擦镜纸,镊子,电炉
三、原理:
微生物的细胞小且透明,在普通光学显微镜下不易识别,必须对它们进行染色,使经染色后的菌体与背景形成明显的色差,从而能更清楚地观察到其形态和结构。

因此,微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。

革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。

它是1884年由丹麦医师Gram创立的。

革兰氏染色法(Gram stain)不仅能观察到细菌的形态,而且还可将所有细菌区分为两大类:染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌,用G+表示;染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏阴性细菌,用G-表示。

细菌对革兰氏染色的不同反应,是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。

革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的,在染色过程中,当用乙醇处理时,由于脱水而引起网状结构中的孔径变小,通透性降低,使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色,因此,呈现蓝紫色;革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低,而脂类物质含量高,当用乙醇处理时,脂类物质溶解,细胞壁的通透性增加,使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色,然后又被染上了复染液(番红)的颜色,因此呈现红色。

革兰氏染色需用四种不同的溶液:碱性染料(basic dye)初染液;媒染剂(mordant);脱色剂(decolorising agent)和复染液(counterstain)。

碱性染料初染液的作用与细菌的单染色法基本原理一样,而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。

媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力,即以某种方式帮助染料固定在细胞上,使不易脱落,碘(iodine)是常用的媒染剂。

脱色剂是将被染色的细胞进行脱色,不同类型的细胞脱色反应不同,有的能被脱色,有的则不能,脱色剂常用95%的酒精(ethanol)。

复染液也是一种碱性染料,其颜色不同于初染液,复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色,而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色,而且将细胞区分成G+和G-两大类群,常用的复染液为番红。

细菌的芽孢具有厚而致密的壁,透性低,不易着色,若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色(芽孢呈无色透明状)。

芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。

所有的芽孢染色法都基于同
一个原则:除了用着色力强的染料外,还需要加热,以促进芽孢着色。

芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理,用不同染料进行着色,使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区分。

芽孢壁厚,透性低、着色、脱色均较困难,因此,当先用一弱碱性染料,如孔雀绿或碱性品红在加热条件下进行染色时,染料不仅可以进入菌体,而且也可以进入芽孢,进入菌体的染料可经水洗脱,而进入芽孢的染料则难以透出,若再用复染液(如番红)处理,使菌体和芽孢呈现出不同的颜色,因而能更明显地衬托出芽孢,则菌体和芽孢易于区别。

四、实验步骤:
(一)革兰氏染色:
1、涂片将培养14 —16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片(注意涂片切不可过于浓厚),干燥、固定。

固定时通过火焰1—2次即可,不可过热,以载玻片不烫手为宜。

2、染色
(1)初染加草酸铵结晶紫一滴,约一分钟,水洗。

(2)媒染滴加碘液冲去残水,并覆盖约一分钟,水洗。

(3)脱色将载玻片上的水甩净,并衬以白背景,用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止,约20—30秒钟,立即用水冲净酒精。

(4)复染用番红液染1—2分钟,水洗。

(5)镜检干燥后,置油镜观察。

革兰氏阴性菌呈红色,革兰氏阳性菌呈紫色。

以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准,过于密集的细菌,常常呈假阳性。

(6)同法在一载玻片上以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌做混合制片,作革兰氏染色对比。

革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度,如脱色过度,则阳性菌可被误染为阴性菌;而脱色不够时,阴性菌可被误染为阳性菌。

此外,菌龄也影响染色结果,如阳性菌培养时间过长,或已死亡及部分菌自行溶解了,都常呈阴性反应。

(二)芽孢染色:改良的Schaeffer和Fulton氏染色法
(1)制备菌液:加1—2滴无菌水于小试管中,用接种环从斜面上挑取2—3环的菌体于试管中并充分打匀,制成浓稠的菌液。

(2)加染色液:加5%孔雀绿水溶液2—3滴于小试管中,用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。

(3)加热:将此试管浸于沸水浴(烧杯),加热15—20min。

(4)涂片:用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的载玻片上,做成涂面,晾干。

(5)固定:将涂片通过酒精灯火焰3次。

目的:使细胞质凝固,以固定细胞形态,并使之牢固附着在载玻片上。

(6)脱色:用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。

(7)复染:加蕃红水溶液染色5min后,倾去染色液,不用水洗,直接用吸水纸吸干。

(8)镜检:先低倍,再高倍,最后用油镜观察。

结果:芽孢呈绿色,芽孢囊和菌体为红色。

五、结果与分析:
1、绘图表示革兰氏染色结果。

2、绘出芽孢和菌体的形态图。

3、分析说明染色过程中的要点及注意事项。

六、思考题:
1、革兰氏染色的原理。

2、影响革兰氏染色结果正确性的环节?最关键环节?
3、芽孢染色的原理。

4、若涂片中观察到大量游离的芽孢,很少看到芽孢囊及营养细胞,为什么?
5、不经复染这一步,能否区别革兰氏阳性菌和阴性菌?
6、当你对一株未知菌进行革兰氏染色时,怎样能确证你的染色技术操作正确,结果可靠?
7、你认为制备细菌染色标本时,尤其应该注意哪些环节?
8、为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?
9、如果你的涂片未经热固定,将会出现什么问题?如果加热温度过高、时间太长,又会怎样呢?
热固定温度不宜过高(以玻片背面不烫手为宜),否则会改变甚至破坏细胞形态。

七、难点及重点:
重点:革兰氏染色法。

难点:革兰氏染色操作的正确性。

八、注意事项:
(一)革兰氏染色:
1、革兰氏染色成败的关键是脱色时间,如脱色过度,革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌;如脱色时间过短,革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。

因此必须严格把握脱色时间。

2、选用培养18—24小时菌龄的细菌为宜,若细菌太老,由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。

3、涂片时,生理盐水及取菌不宜过多,涂片应均匀,
4、水洗时,不要直接冲洗涂面,而应使水从载玻片的一端流下。

水流不宜过急,以免涂片薄膜脱落。

5、载玻片要洁净无油迹;滴生理盐水和取菌不宜过多;涂片要涂均匀,不宜过厚。

(二)芽孢染色法:
1、供芽孢染色用的菌种应控制菌龄。

2、改良法在节约染料、简化操作及提高标本质量等方面都较常规涂片法优越,可优先使用。

3、用改良法时,欲得到好的涂片,首先要制备浓稠的菌液,其次是从小试管中取染色的菌液时,应先用接种环充分搅拌,然后再挑取菌液,否则菌体沉于管底,涂片时菌体太少。

4、加热用水不宜过于剧烈沸腾,避免试管内染液烧干。

5、如果染液烧干,不能立即加入冷的染液。

6、制片和干燥时,温度不能过高,否则菌体变形。

九、课后总结:。

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